Ensayo de empalme paralelo masivo para examinar los errores de empalme causados por variantes intrónicas relacionadas con enfermedades

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para realizar ensayos de empalme paralelo masivo (MaPSy), que emplean construcciones minigénicas para evaluar sistemáticamente variantes intrónicas a granel. Este enfoque permite un análisis de alto rendimiento de los cambios de empalme inducidos por variantes en las células a través de la secuenciación de amplicones, lo que proporciona evaluaciones funcionales de su impacto en el empalme previo al ARNm.

Resumen

Los errores de empalme representan entre el 10 y el 30% de las mutaciones patogénicas responsables de trastornos genéticos raros. El empalme de ARN garantiza una expresión génica adecuada al unir selectivamente los exones y eliminar los intrones, con secuencias reguladoras clave ubicadas dentro de los intrones. El sitio de empalme 5 'y el sitio de la rama interactúan con pequeños ARN nucleares para formar el complejo de reconocimiento del espliceosoma, mientras que elementos como el tracto de polipirimidina y los potenciadores / silenciadores de empalme reclutan proteínas para regular el ensamblaje del espliceosoma. Predecir las interrupciones del empalme de las variantes intrónicas es un desafío debido a la complejidad de estas interacciones.

Las variantes intrónicas, que comprenden el 90% de las variaciones genéticas humanas naturales, pueden interrumpir el empalme canónico y dar lugar a enfermedades. Para investigar esta posibilidad, desarrollamos un ensayo de empalme paralelo masivo (MaPSy) para evaluar las variantes intrónicas identificadas por el paciente. Los oligonucleótidos sintetizados con secuencias de referencia o variantes se ligaron en minigenes de empalme que contenían señales de promotor y poliadenilación. Cada construcción incluía dos exones constantes que flanqueaban un exón medio que albergaba la secuencia variable de unión intrón-exón de interés. La eficiencia de empalme celular de las secuencias variantes se comparó con sus contrapartes de referencia, lo que nos permitió identificar interrupciones significativas como variantes de empalme.

Los resultados del MaPSy se pueden validar a través de enfoques adicionales, como ensayos minigénicos o edición del genoma mediada por CRISPR in vivo. Además, el análisis agregado de las uniones interrumpidas puede proporcionar información más profunda sobre los mecanismos de empalme y la base molecular de las enfermedades asociadas con los errores de empalme.

Introducción

El empalme de ARN es un proceso crucial que une exones para la traducción y elimina intrones, lo que facilita la exportación de ARN y mantiene la homeostasis de los ácidos nucleicos. Este mecanismo estrictamente regulado opera de manera temporal y espacial, contribuyendo a la diversidad y complejidad del transcriptoma¹. El empalme está guiado por señales clave, incluido el sitio de empalme 5' (5'ss), el sitio de la rama y el sitio de empalme 3' (3'ss), junto con elementos reguladores adicionales como el tracto de polipirimidina aguas abajo del sitio de la rama y la zona de exclusión de dinucleótidos AG, que ayudan en el reconocimiento de 3ss². Mecánicamente, el ARN nuclear pequeño U1 (snRNA) se empareja con el 5'ss, mientras que el sitio de la rama interactúa con el snRNA³ U2. La actividad coordinada del sitio de la rama, el tracto de polipirimidina y las 3'ss facilita la unión de las nucleoproteínas pequeñas U2 (snRNP) y los factores auxiliares U2, estabilizando el espliceosoma y posicionando el punto de ramificación para el ataque nucleofílico en las 5'ss, iniciando así el empalme.

Con el rápido avance de las tecnologías de secuenciación, el costo de la secuenciación del genoma completo continúa disminuyendo, lo que lleva a un catálogo cada vez mayor de variantes genéticas humanas. Se estima que entre el 10 y el 30% de las mutaciones asociadas a enfermedades en trastornos genéticos raros afectan el empalme de ARN ^4,5,6, a menudo produciendo productos génicos aberrantes que pueden servir como objetivos terapéuticos. Sin embargo, evaluar el impacto funcional de las variantes intrónicas sigue siendo un desafío debido a la complejidad de las señales de empalme, que a menudo son redundantes y degeneradas. Si bien los sitios de empalme 5 'y 3' están relativamente bien caracterizados, los sitios de ramificación, los tractos de polipirimidina y otros elementos reguladores de empalme exhiben una considerable variabilidad posicional y de secuencia en eucariotas superiores. Los estudios de mapeo a gran escala han demostrado además que pueden existir múltiples sitios de ramificación dentro de un solo intrón 7,8,9,10, lo que complica la interpretación de las variaciones del límite intrón-exón.

Se ha empleado el aprendizaje profundo para evaluar cómo las secuencias primarias contribuyen al reconocimiento del sitio de empalme ^4,11,12, revelando que las variantes de empalme se agrupan en los sitios de empalme canónicos mientras se extienden escasamente hacia el exón y la región 3 'de los intrones. Este patrón se alinea con la comprensión establecida de que la selección del sitio de empalme 5' está dictada principalmente por secuencias de consenso, mientras que el reconocimiento del sitio de empalme 3' depende de elementos intrónicos adicionales, como sitios de ramificación y tractos de polipirimidina. Sin embargo, los modelos existentes han sido entrenados para distinguir los sitios de empalme constitutivos de los alternativos o artificiales en lugar de centrarse específicamente en las variantes intrónicas. Como resultado, estas herramientas computacionales muestran solo una precisión predictiva moderada, identificando principalmente sitios de empalme y variantes de empalme exónico 13,14,15,16. Además de los modelos predictivos, un sistema experimental capaz de validar variantes de empalme a granel mejoraría significativamente la identificación y caracterización de defectos de empalme.

Los datos completos de secuenciación de ARN que vinculan las variantes intrónicas asociadas a enfermedades con fenotipos de empalme siguen siendo escasos debido a su baja frecuencia y la dificultad de predecir los resultados del empalme a partir de los conjuntos de datos existentes. Para abordar esta brecha, se han desarrollado ensayos de empalme de alto rendimiento y modelos computacionales para analizar sistemáticamente las variantes de empalme. Se han diseñado ensayos reporteros de empalme paralelo masivo (MaPSy) para evaluar el impacto de las secuencias variables en la selección del sitio de empalme. Al incorporar variaciones de secuencia cerca de los sitios de empalme 5 'y 3' o abarcar regiones enteras de intrón-exón dentro de las redes tronales minigénicas fijas, MaPSy permite una evaluación funcional de las alteraciones del empalme. Sin embargo, debido a las limitaciones de la síntesis de oligonucleótidos a granel, las variantes intrónicas profundas y la activación del pseudoexón no se capturan en este enfoque.

La robustez de MaPSy se ha validado utilizando 70 minigenes de empalme independientes, lo que arroja una correlación de Pearson de 0,89¹⁷. En particular, aproximadamente el 90% de las variantes de donantes de empalme (+1 y +2) exhibieron defectos de empalme, lo que destaca la precisión del ensayo. Además, MaPSy con secuencias aleatorias de sitios de ramificación ha descubierto la naturaleza degenerada del reconocimiento del sitio de ramificación y su dependencia de las proteínas centrales U2¹⁸. Además, se ha utilizado un diseño de MaPSy de GFP dividida junto con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para investigar los eventos de omisión de exón causados por variaciones genéticas. Este enfoque reveló que el 54% de las variantes disruptoras del empalme residen en regiones intrónicas, incluidos los sitios de empalme canónicos¹³, lo que subraya el papel significativo de los elementos intrónicos en la regulación del empalme. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la importancia de las secuencias intrónicas en el control del empalme y demuestran la utilidad de MaPSy en la identificación de defectos de empalme asociados a enfermedades (Figura 1).

Figura 1: Diseño experimental de ensayo de empalme paralelo masivo (MaPSy) de mutaciones intrónicas cercanas al exón. Las variantes documentadas en bases de datos de enfermedades humanas se recopilaron y sintetizaron como 5.307 pares de oligos. Cada par de oligonucleótidos contiene un alelo de referencia y una variante a través de las regiones intrónicas de 78 nucleótidos (nt) y exónicas de 35 nt. Los oligos están flanqueados por sitios de cebado comunes para la amplificación y ligadura en minigenes de empalme de 3 exones. En consecuencia, la región sintetizada comprende los 3'ss del segundo exón del minigen. Después del ensamblaje de los minigenes, los minigenes agrupados se empalmaron en células renales embrionarias humanas (HEK293T). Las isoformas empalmadas resultantes se cosecharon y resolvieron mediante secuenciación de amplicones. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chiang et ^al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Síntesis de la biblioteca de oligonucleótidos (oligo) MaPSy

1. Estructura básica de oligo: Diseñe cada oligo en el grupo de 155 nuncleótidos (nt) para incluir una secuencia exónica de 35 nt y una secuencia intrónica de 80 nt, formando una región específica del gen de 115 nt flanqueada por secuencias de cebado comunes de 20 nt en cada extremo (Figura 2A).
2. Recopilación de variantes: Para conservar la integridad del motivo y centrarse en las regiones reguladoras que afectan al empalme, recopile las variantes intrónicas que son:
   -78 a +10 nt desde el 3'ss
   -3 a +30 nt desde el 5'ss
   NOTA: Las variantes clínicas se pueden obtener de ClinVar¹⁹, entradas de baja frecuencia en dbSNP²⁰, publicaciones relevantes y bases de datos clínicas adicionales. Las coordenadas del genoma se pueden usar para interceptar variantes con las regiones genómicas deseadas (por ejemplo, usando BEDTools²¹). Solo se deben seleccionar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) e inserciones/deleciones pequeñas (indels) por debajo de 15 nt para minimizar la variabilidad de tamaño dentro del grupo de oligonucleótidos para la síntesis a granel.
3. Estructura básica de minigenes: Para preservar la estructura de la unión de empalme, cada columna vertebral de minigene contiene tres exones: dos exones externos constantes que codifican fragmentos de EGFP (de pGint, Addgene Plasmid # 24217) y un exón medio derivado del exón 15 de CAMTA2 humano (Figura 2B). Digerir tanto el fragmento CAMTA2 como pGint con enzimas de restricción BamHI y SalI y ligar el fragmento CAMTA2 en pGint entre los exones de EGFP, creando minigenes de tres exones pGint-CAMTA2 (Archivo complementario 1).
   NOTA: El exón medio, es decir, el exón 15 CAMTA2 , debe exhibir una eficiencia de empalme intermedia cuando se expresa en células diana. Esta característica es esencial ya que proporciona una línea de base equilibrada, lo que permite la detección de aumentos y disminuciones en la eficiencia del empalme debido a los efectos variantes.
4. Diseño del sitio de cebado: Agregue la secuencia del sitio de inserción a ambos extremos de la biblioteca para que cada oligo contenga secuencias flanqueantes de ~ 20 nt que se superpongan con el sitio de inserción deseado dentro del exón / intrón medio (Figura 2A).
   NOTA: Si el grupo de oligonucleótidos está diseñado para múltiples construcciones de minigenes, se pueden incorporar múltiples sitios de cebado.
5. Diseño de código de barras: Para las variantes intrónicas, los códigos de barras exónicos son esenciales para distinguir los genotipos de los productos empalmados, ya que las secuencias intrónicas se pierden después del empalme. Para evitar cualquier alteración del empalme debido a las secuencias de códigos de barras (es decir, el efecto del código de barras), coloque los códigos de barras distalmente dentro de los exones, lejos de los sitios de empalme (es decir, justo al lado del sitio de cebado exónico).
   NOTA: Se recomienda utilizar varios códigos de barras por variante siempre que sea posible. La longitud del código de barras requerida depende de la complejidad de la biblioteca. Por ejemplo:
   Un código de barras de 1 nt es suficiente si un alelo de referencia se empareja con una sola variante.
   Un código de barras de 2 nt es preferible si un alelo de referencia se empareja con seis variantes diferentes.
   Las bibliotecas con múltiples variantes estrechamente relacionadas con un solo alelo de referencia (por ejemplo, que difieren en un solo nucleótido) pueden aumentar la complejidad del análisis.
6. Ordenar oligos: ordene oligos en formato de archivo FASTA, con cada unión variante emparejada junto con su alelo de referencia.
   NOTA: Para cruces con múltiples variantes, solo se necesita un alelo de referencia por cruce. Los servicios de síntesis de secuencias agrupadas están disponibles en empresas como GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) y Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). La duración de la síntesis, la capacidad de la biblioteca y los costos pueden variar según el proveedor y la región.

Figura 2: Diseño de minigenes de oligo y empalme para MaPSy. (A) Diseño para la síntesis de oligonucleótidos agrupados del extremo 3 'o 5' de los intrones. Los diagramas ilustran la estructura básica de los oligos de 155 nt. La capacidad real de la síntesis de oligonucleóteos depende de la empresa seleccionada para la producción. (B) Diseño de los minigenes MaPSy. Se modificó un minigen de tres exones (ii) del plásmido pGint (i), y los sitios de empalme se reemplazaron por los oligos agrupados para introducir variaciones en la señal de empalme (iii). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Construcción de plantillas de ADN de la biblioteca MaPSy

1. Amplificación inicial al recibir el grupo de oligoelementos
   1. Al recibir el grupo de oligoelementos, amplíe 10-50 ng de la biblioteca de oligonucleótidos con los sitios de cebado flanqueantes diseñados mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 100 μL utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad para convertir los oligonucleótidos en cadenas dobles (cebadores LibF y LibR en la Tabla 1, configuraciones del termociclador en la Tabla 2).
   2. Limpie los productos de PCR utilizando columnas de purificación. En detalle, una el producto de PCR a la membrana de la columna y, a continuación, lávese con tampones que contengan etanol al 70 % para eliminar los cebadores, las sales y la polimerasa residuales. Finalmente, eluya el producto de PCR purificado utilizando tampón bajo en sal o agua libre de nucleasas.
   3. Verifique el tamaño de oligo amplificado mediante electroforesis en gel. Cargue 5 μL del producto de PCR purificado en un gel de agarosa al 1,5% preparado en tampón TAE al 1× (40 mM de base de Tris, 20 mM de ácido acético, 1 mM de EDTA, pH 8,0).
      NOTA: Limite los ciclos de amplificación de PCR a 15 para evitar la sobreamplificación y el sesgo de PCR. Una banda difusa secundaria, generalmente más grande que el producto objetivo, puede indicar sobreamplificación y recocido incompleto dentro del grupo de oligoelementos. Guarde una parte de los productos de PCR y secuencie el grupo de oligonucleótidos para evaluar la calidad y las tasas de error antes de continuar (punto de parada).
2. Construcción de minigenes de empalme MaPSy - PCR inicial.
   1. Fragmentos de la columna vertebral: Utilice 0,5 ng de la columna vertebral del plásmido pGint-CAMTA2 como fuente para los dos fragmentos principales de PCR
      1. Producto 1 de PCR: Amplificar el promotor del CMV, el primer exón (EGFP N-terminal) y parte del primer intrón (Tabla 1 y Tabla 2).
      2. Producto 3 de PCR: Amplifica parte del exón medio (exón 15 CAMTA2), el segundo intrón, el tercer exón (EGFP C-terminal) y la señal de poliadenilación SV40 (Figura 3, Tabla 1 y Tabla 2).
   2. Amplicón de biblioteca: Producto 2 de PCR: Para la biblioteca 3ss, amplifique los amplicones de biblioteca con secuencias superpuestas en cada extremo para que coincidan con los extremos internos del producto 1 de PCR y el producto 3 de PCR, lo que permite una integración eficiente en el 3ss del exón 15 de CAMTA2 (Figura 3, Tabla 1 y Tabla 2).
      NOTA: Para la biblioteca 5ss, reemplace el extremo 5' de la unión del exón medio con la secuencia de la biblioteca.
3. Después de la PCR, limpie todos los productos utilizando columnas de purificación como paso 2.1.2. Para evitar la contaminación del vector molde, purifique los productos deseados de PCR1 y PCR3 mediante extracción en gel de agarosa. Específicamente, después de la electroforesis, excime ~ 100 mg de gel de agarosa que contiene el producto de PCR objetivo y disuélvalo en el tampón de unión. Une la solución de gel disuelta a la membrana de la columna y, a continuación, continúa con el protocolo estándar de purificación por PCR.
4. Construcción de minigenes de empalme MaPSy - PCR de extensión de superposición: Realice una ronda o rondas secuenciales de PCR superpuestas para ligar los tres fragmentos principales (Producto 1 de PCR, el amplicón de biblioteca y Producto 3 de PCR; use ~ 20 ng cada uno como plantilla) en un minigen de empalme de longitud completa (use los cebadores más externos CAMGFPF y CMVGFPR en la Tabla 1 y la configuración del termociclador en la Tabla 2).
   NOTA: El producto final contiene el promotor del CMV y tres exones con los primeros 3 derivados de la biblioteca de oligonucleótidos, y está listo para la transfección para experimentos basados en células.
5. Después del ensamblaje, limpie las plantillas de ADN de longitud completa utilizando columnas de purificación de PCR. Si se observan bandas no específicas en el gel, realice la extracción del gel para aislar con precisión el producto de longitud completa deseado como paso 2.3.
   NOTA: Las secuencias muy similares en la biblioteca pueden conducir a un ensamblaje incompleto. Si el ensamblaje completo en una sola reacción de PCR es difícil, se pueden intentar PCR secuenciales superpuestas (comenzando con dos fragmentos y luego agregando un tercero). Para mejorar la especificidad de la PCR, considere ajustar la temperatura de recocido o implementar la PCR de contacto para mejorar la especificidad de unión para plantillas complejas. Prepare suficientes construcciones de MaPSy para realizar al menos cuatro experimentos independientes. Guarde una pequeña alícuota de cada construcción para la secuenciación de próxima generación para verificar la integridad de la secuencia, ya que algunos oligonucleótidos pueden no amplificarse de manera eficiente y dar como resultado ensamblajes incompletos (punto de parada).

Figura 3: Flujo de trabajo de la construcción de bibliotecas. (A) Cebadores utilizados en la PCR superpuesta (ver también Tabla 1). (B) El procedimiento para la PCR superpuesta. En resumen, los grupos de oligonucleótidos y las otras partes de los minigenes de empalme se amplificaron mediante 25 ciclos de PCR. El fragmento que contenía el promotor y el primer exón (producto de PCR 1) se cosió al grupo de oligonucleótidos (producto de PCR 2) superponiendo PCR utilizando 20 ciclos de amplificación. Luego, el producto cosido (producto de PCR 1 + 2) se unió al fragmento que contenía el^3er exón y la señal de poliadenilación (producto de PCR 3) utilizando 20 ciclos de amplificación para obtener la construcción final (producto de PCR 1 + 2 + 3). Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chiang et ^al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Construcción de imprimación de la biblioteca MaPSy		nota
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	Producto de PCR 1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	Producto de PCR 1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	Producto de PCR 2
Libr	AAGGCGCACATGACCCCGGG	Producto de PCR 2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	Producto de PCR 3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	Producto de PCR 3
Imprimación de PCR de la biblioteca MaPSy para la secuenciación de amplicones
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGACACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTCTCTCTGTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGATGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTCTCTCTGTGTAGT
Manual de validación
Lib0F (validación de bibliotecas)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (validación de bibliotecas)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabla 1: Cebadores utilizados en este protocolo.

Mezcla de reacción de PCR
Componentes	Volumen
ddH2O	13,4 μl
5x Tampón HF	4 μL
10 mM dNTP	0,4 μl
Cebador directo 10 μM	0,5 μl
Imprimación inversa 10 μM	0,5 μl
ADNc	1 μl
ADN polimerasa de alta fidelidad	0,2 μl

Ejecute el programa de PCR (reacción de 20 μL)
	Temp	Hora	Ciclos
Desnaturalización inicial	98°C	1 minuto	1
Desnaturalización	98°C	30 s	10–20
Recocido	65°C	30 s
Extensión	72°C	30 s	Volver a la desnaturalización
Prórroga final	72°C	5 minutos	1
Sostener	4°C	Sostener	Sostener

Tabla 2: Configuración del termociclador.

3. Expresión y recuperación de minigenes de empalme de células de mamíferos

1. Cultivo celular: Mantener HEK293T células en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina en CO₂ al 5% a 37 °C.
2. Transfección de minigenes de empalme:
   1. Placa 5 × 10⁵ células HEK293T en 2 mL de medio en placas de 6 pocillos 24 h antes de la transfección.
   2. Células transfectadas con 1-2 μg de construcciones de MaPSy, preincubadas durante 5 min con 3,75 μL de reactivo de transfección, siguiendo el protocolo del fabricante. La transfección exitosa se indica por la presencia de señales EGFP de la biblioteca empalmada.
   3. Lisar las células con 250 μL de Trizol (o equivalente) 24 h después de la transfección.
3. Extracción de ARN: Extraiga el ARN total utilizando un kit de minipreparación de ARN, siguiendo el protocolo del fabricante. Específicamente, unir el ARN en Trizol a las membranas de la columna, lavar con tampones que contengan etanol al 70% para eliminar sales, proteínas y otras impurezas, y eluir el ARN purificado utilizando tampón bajo en sal o agua libre de nucleasas.
   PRECAUCIÓN: Trizol (o equivalente) es altamente corrosivo y tóxico. La exposición puede provocar quemaduras químicas graves, cicatrices permanentes e insuficiencia renal.
   NOTA: El ARN se puede almacenar en Trizol (o en un reactivo equivalente basado en Trizol, como el extractor de ARN TOOLSmart de TOOLS) a -80 °C durante un máximo de un año (punto de parada). El ARN purificado se puede almacenar a -80 °C durante un máximo de dos años si se minimizan los ciclos de congelación-descongelación (punto de parada).
4. Transcripción inversa: Preparar ADNc a partir de 2 μg de ARN total utilizando transcriptasa inversa con hexámeros aleatorios, siguiendo el protocolo del fabricante. Específicamente, incube el ARN con hexámeros aleatorios de 50 μM a temperatura ambiente durante 10 min para permitir el recocido, y luego realice la transcripción inversa a 55 °C durante 10 min.
   NOTA: el ADNc se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de un año (punto de parada).
5. Amplificación de los minigenes empalmados: Realice PCR utilizando las secuencias de cebado específicas para los minigenes empalmados (Tabla 2). Utilice el número mínimo de ciclos necesarios para visualizar el producto en un gel de agarosa.
   NOTA: Las bandas mixtas de productos empalmados y sin empalmar deben ser visibles en el gel. Las bandas pueden parecer difusas debido a la población mixta de especies de ADN (Figura 4A).
6. Limpie el producto de PCR utilizando columnas de purificación como paso 2.1.2.
7. Conexión de adaptadores de secuenciación: realice una ronda final de PCR para conectar secuencias de adaptadores de secuenciación a los extremos del amplicón. Incluya 0-3 nucleótidos aleatorios al final de los amplicones para garantizar una detección de fluorescencia equilibrada en la plataforma NextSeq (Tabla 1).
8. Limpie el producto de PCR utilizando columnas de purificación como paso 2.1.2.

4. Secuenciación y análisis de amplicones

1. Secuenciación de lectura corta: Someter los amplicones de PCR a 150 secuenciaciones de extremos emparejados utilizando Illumina Miseq, Novaseq o equivalente, a través de una instalación central o servicio comercial.
2. Alineación:
   1. Crear un genoma de referencia: Cree un "genoma de referencia" sintético etiquetando cada genotipo único como un cromosoma separado. El genoma de referencia incluye los exones e intrones sintéticos contenidos dentro de los amplicones.
   2. Alinear las lecturas de secuenciación: Alinee las lecturas de extremos emparejados con el genoma de referencia mediante HISAT2^22,23, ajustando los parámetros para controlar los elementos específicos del empalme (consulte Archivo complementario 2 para obtener detalles de la línea de comandos).
   3. Seleccione lecturas de alta calidad: convierta SAM a formato BAM, filtre las lecturas de alta calidad (calidad de asignación ≥60) y, a continuación, ordene e indexe los archivos BAM²⁴ (consulte Archivo complementario 2 para obtener detalles de la línea de comandos).
   4. Identifique las uniones de empalme y calcule las lecturas de unión: cuantifique el uso de la unión de empalme extrayendo eventos de omisión de exón de cadenas CIGAR en el archivo BAM alineado. Identifique las lecturas de expansión de cruce en función de "N" operaciones y agregue recuentos de lectura por coordenada de cruce y hebra para evaluar los patrones de empalme (consulte Archivo complementario 2 para obtener detalles de la línea de comandos).
   5. Clasificar los emplazamientos de empalme canónicos: Clasifique los empalmes como canónicos si coinciden con los cruces GT-AG anotados.
      NOTA: En raras ocasiones, los alelos de referencia en MaPSy pueden utilizar sitios de empalme no canónicos. Las lecturas que carecen de uniones que abarquen la posición designada del emplazamiento de empalme se conservan como lecturas sin empalme.
3. Análisis estadístico para identificar variantes de empalme: Clasifique las lecturas en tres grupos:
   (1) lecturas empalmadas versus no empalmadas;
   (2) canónico versus no canónico entre todas las lecturas empalmadas;
   (3) lecturas canónicas versus no canónicas más no empalmadas.
   Realice una prueba exacta de Fisher bilateral, seguida de una corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) (Tabla 3), para evaluar el impacto de las variantes en la eficiencia y precisión del empalme.
4. Filtrar variantes de empalme de alta confianza: Clasifique como significativos los pares de referencia/variante que superen los 100 recuentos de lectura con un valor q inferior a 0,05 en cuatro repeticiones. Luego, considere candidatos con un cambio de razón de probabilidades de 2 veces con el alelo de referencia o la variante con lecturas no empalmadas y no canónicas del >5%, variantes de empalme de alta confianza (Figura 4B).

Lee	Empalmado	Sin empalmes y/o no canónicos
Referencia	un	b
Variante	c	d

Tabla 3: Tabla de dos por dos para la prueba exacta de Fisher.

5. Validación

1. Empalme minigénico para validación:
   1. Síntesis y amplificación de oligos: Sintetizar los oligos de ADN de secuencias candidatas a MaPSy seleccionadas individualmente (por ejemplo, mediante tecnologías integradas de ADN). Luego, amplifique los oligos usando las secuencias flanqueantes diseñadas en cadenas dobles por PCR usando ADN polimerasa de alta fidelidad (Tabla 2).
   2. Clonación de minigenes: digiera tanto los productos de PCR resultantes como el pGint-CAMTA2 por BbsI y SmaI y ligue el producto digerido por ADN ligasas.
   3. Transfección: Transfecte las construcciones resultantes en células HEK293T utilizando un reactivo de transfección como paso 3.2.2.
   4. Extracción de ARN: Extraiga ARN de las células transfectadas, como se describe en el paso 3.3.
   5. Transcripción inversa: Realice la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando hexámeros aleatorios.
   6. Amplificación de isoformas de empalme: amplifique las isoformas de empalme con cebadores dirigidos a los dos primeros exones del minigen (Lib0F y Lib0Rl, Tabla 1, configuración del termociclador en la Tabla 2). Resuelva los productos amplificados mediante electroforesis y visualícelos utilizando el sistema Gel Doc.
   7. Cuantificación: Cuantifique la intensidad de la señal de cada isoforma de empalme utilizando ImageJ (National Institutes of Health, EUA)^25,26. Alternativamente, utilice el kit de detección de ADN con el analizador de ácidos nucleicos de alto rendimiento eGENE HDA-GT12 para cuantificar la intensidad y el peso molecular de los productos de PCR.
   8. Extracción y confirmación de isoformas: Aísle cada isoforma mediante extracción en gel de agarosa como paso 2.3 y confirme el resultado del empalme mediante la secuenciación de Sanger de los productos de PCR a través de una instalación central o servicio comercial, evaluando el empalme normal, la inclusión de intrones y la omisión de exones.
2. Minigenes de empalme de múltiples exones:
   1. Después de validar los resultados de MaPSy, seleccione la variante de interés y clone de tres a cinco exones del ADN genómico (ADNg) para proporcionar un contexto más genómico para el defecto de empalme observado.
   2. Realice mutagénesis dirigida al sitio utilizando cebadores mutagenizantes y PCR superpuesta para ensamblar construcciones minigénicas que albergan la alteración de secuencia deseada en el sitio objetivo.
      NOTA: Si los intrones flanqueantes son demasiado largos para la clonación, conserve aproximadamente 300 nt de la secuencia intrónica para cada sitio de empalme para garantizar un contexto de empalme adecuado.
   3. Realice el ensayo de empalme basado en células como se describe anteriormente en 5.1.
3. Validación celular: Para validar el efecto de empalme en las celdas, utilice la edición CRISPR basada en plantillas para alterar la secuencia de las variantes seleccionadas en un modelo celular apropiado.
   NOTA: Cuando sea posible, utilice muestras humanas que lleven la variante específica para evaluar directamente el patrón de empalme.

Resultados

Después del empalme celular de las construcciones de MaPSy, los productos empalmados y no empalmados están presentes como una mezcla. Debido a la diversidad de tamaños de la biblioteca y al potencial de empalme no canónico, ambos tipos de productos pueden parecer algo difusos en un gel. En construcciones dirigidas al extremo 3', el segundo intrón, que contiene secuencias adenovirales parciales, tiende a empalmarse de manera muy robusta (Figura 4A).

En los experime...

Discusión

La señal EGFP intrínseca en la construcción MaPSy permite la detección basada en fluorescencia de la omisión de exones. Si la secuencia en el exón o los intrones medios promueve la omisión de exones, la ligadura del primer y tercer exones produce una señal EGFP detectable por FACS, lo que lo convierte en un método valioso para identificar variantes que influyen en la omisión de exones y facilitar la visualización basada en microscopía de variantes de empalme¹³. Si...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit MiniPrep Plus de ARN de Direct-zol	Investigación Zymo	Referencia R2072
Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965084
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	A2916801
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
plásmido pGint	Addgene	24217
ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion	Thermo Fisher Scientific	F530L
Kit de extracción de gel QIAquick	Qiagen	28706
Kit de purificación de PCR QIAquick	Qiagen	28106
Kit de detección de ADN QIAxcel (2400)	Qiagen	929004
Transcriptasa inversa SuperScript IV	Thermo Fisher Scientific	18090010