Artículo de método

Fabricación basada en la recombinación de vectores virales diseñados para investigación y terapia

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 de septiembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

En este artículo

Resumen

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La recombinación, un método de ingeniería genética mediada por recombinación, permite modificaciones precisas del genoma viral sin depender de la digestión enzimática. Este enfoque es crucial para la investigación básica, como las deleciones dirigidas, y para el desarrollo de virus modificados utilizados en terapias oncolíticas, terapia génica y vacunas genéticas, ampliando las posibilidades tanto en investigación como en aplicaciones clínicas.

Resumen

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La creciente demanda de vectores virales modificados tanto en la investigación básica como en la traslacional ha subrayado la necesidad de métodos flexibles, rápidos y escalables para generar virus de ADN recombinante. Las estrategias que se basan en la digestión y ligadura de enzimas de restricción están limitadas por limitaciones dependientes de la secuencia y pasos de clonación que requieren mucho tiempo. Aquí, describimos el método de ingeniería genética mediada por recombinación (recombinación) que elude estas limitaciones al permitir modificaciones precisas y sin problemas de los genomas virales en los cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Este enfoque permite la eliminación, inserción o sustitución eficientes de elementos genéticos codificantes o no codificantes, proporcionando una plataforma poderosa para el desarrollo de vectores virales de alto rendimiento. La recombinación es particularmente valiosa en aplicaciones de investigación básica, como la deleción o mutación de genes virales para investigar su función. Más importante aún, esta metodología permite la generación de decenas de virus recombinantes que codifican distintas cargas útiles inmunoestimulantes o terapéuticas en paralelo, lo que la hace excepcionalmente adecuada para la evaluación preclínica rápida de nuevas construcciones. Si bien esta tecnología puede implementarse potencialmente para cualquier propósito científico, este artículo se centra en la aplicación de la recombinación en dos áreas específicas: la generación de virus oncolíticos basados en el virus del herpes simple y el desarrollo de vectores adenovirales no replicativos para la transferencia de genes. En conclusión, la recombinación ofrece un enfoque versátil para la ingeniería del genoma viral, acelerando significativamente la tubería desde el diseño hasta las pruebas funcionales. Su relevancia abarca desde la virología fundamental hasta la medicina traslacional para satisfacer las necesidades clínicas y de investigación en evolución.

Introducción

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Los vectores virales han surgido como herramientas potentes en la terapia génica, la viroterapia oncolítica y el desarrollo de vacunas genéticas debido a su capacidad natural para administrar material genético en las células huésped. Aprovechan el tropismo natural de los virus y los mecanismos de transducción, facilitando la expresión génica transitoria y a largo plazo. Son capaces de sobrevivir en el entorno extracelular, de unirse a un receptor celular específico (que define el tropismo viral) y promover su internalización, de secuestrar la maquinaria de expresión génica de la célula huésped e impulsar la expresión de sus propios genes, y de eludir los sensores intracelulares y unidos a la membrana del brazo inmune innato 1,2. De esta manera, después de una infección viral productiva, los virus transforman las células en fábricas de progenie viral que propagan nuevos virus en el organismo, causando eventualmente una enfermedad.

Los virus de tipo salvaje pueden transformarse en una herramienta biotecnológica mediante ingeniería genética: su genoma puede manipularse fácilmente para conservar la capacidad de transducción y obtener un resultado clínico. Sobre la base de su aplicación clínica, los vectores virales pueden diseñarse para retener (al menos en parte) o ser ablacionados en su competencia de replicación para generar vectores competentes o incompetentes para la replicación 3,4.

Los virus competentes para la replicación están destinados principalmente a fines de virus oncolíticos. Las células cancerosas, a menudo deficientes en defensas antivirales1, permiten la replicación de virus recombinantes atenuados diseñados mediante la eliminación de genes de virulencia. Estos virus se replican selectivamente en los tumores sin afectar el tejido normal. A medida que ha avanzado la comprensión de la virología, los virus atenuados han sido reemplazados por modificaciones genómicas más precisas diseñadas para mejorar tanto la seguridad como la eficacia terapéutica.

Entre los campos de interés que requieren ingeniería molecular quirúrgica de genomas virales se encuentran: i) Virus oncolíticos condicionales de replicación, donde los promotores virales se reemplazan con promotores asociados a tumores (promotores celulares sobretranscritos en células tumorales), restringiendo así la expresión génica viral a células enfermas5. ii) Virus con tropismo alterado 6,7, donde las glicoproteínas de la envoltura que determinan la infección pueden modificarse o reemplazarse con fragmentos de anticuerpos o ligandos que se dirigen a proteínas sobreexpresadas en las células tumorales 8,9. iii) Virus oncolíticos armados. La muerte de células tumorales inducida por virus oncolíticos desencadena la muerte celular inmunogénica (DAI), caracterizada por la liberación de mediadores inflamatorios 1,10 y antígenos tumorales11. Estas señales promueven el reconocimiento eficiente de antígenos tumorales por parte del sistema inmunológico, restaurando la vigilancia12y permitiendo la combinación con inhibidores de puntos de control inmunológicos 13,14,15 y otras terapias inmunes como terapias basadas en ARN y vacunas 16.

En apoyo de este efecto inmunoterapéutico, los transgenes de interés pueden codificarse dentro del genoma viral, explotando así el virus no solo por su actividad oncolítica sino también para mejorar su potencial inmunoterapéutico a través de la producción in situ de cargas útiles relevantes 3,7,17,18,19. Estas cargas útiles pueden comprender citocinas, quimiocinas, anticuerpos, genes suicidas y antígenos 3,20. La inserción requiere precisión, con regiones intergénicas del genoma viral preferidas para minimizar la interrupción de los genes virales y preservar la replicación y la potencia7. Por lo tanto, son esenciales las técnicas que permiten el cribado tanto de los sitios de inserción óptimos como de los transgenes de interés.

Por otro lado, en el contexto de los virus no replicativos, utilizados para la terapia génica o como vehículos para vacunas genéticas, es importante que el vector viral administre el transgén (ya sea transitoriamente o de larga duración) sin replicarse en la célula huésped para evitar la toxicidad21. Los vectores adenovirales se caracterizan por una alta eficiencia de transducción, una expresión robusta de transgenes y la capacidad de infectar células en división y no en división3. Estas propiedades las han convertido en las primeras de su clase para el desarrollo de vacunas genéticas, incluidas las de enfermedades infecciosas emergentes, como la COVID-19, así como las terapias de reemplazo genético22. El ejemplo más famoso de un vector adenoviral que ha llegado al mercado es la vacuna COVID-19 de Oxford-AstraZeneca, conocida con el nombre comercial de Covishield o Vaxzevria, basada en un adenovirus de chimpancé modificado, ChAdOx1, que codifica para la proteína Spike del SARS-CoV-2. Cuando se inyecta por vía intramuscular, Covishield es capaz de penetrar en el interior de las células e inducir la expresión de la proteína Spike, preparando al sistema inmunitario para montar una respuesta inmunitaria contra ella3.

Existe una clara necesidad de modificar los genomas virales sin estar limitado por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Entre los virus oncolíticos, los vectores basados en el virus del herpes simple-1 (VHS-1) ofrecen ventajas únicas, incluida la capacidad lítica, la seguridad y el gran tamaño del genoma, lo que permite la inserción de transgenes considerables o múltiples elementos genéticos23,24. Más allá del VHS, muchos otros virus muestran una promesa terapéutica, como se revisó recientemente en Sasso et al.3. En lugar de un vector universal "el mejor de su clase", las diferentes plataformas virales se adaptan a distintas necesidades terapéuticas3. Actualmente, los sistemas de recombinación homóloga en bacterias o la clonación híbrida de levaduras y bacterias siguen siendo las alternativas más comunes a las enzimas de restricción, pero son laboriosas, de varios pasos e ineficientes25.

Una alternativa emergente es el uso de CRISPR/Cas9, aplicado recientemente para diseñar genomas de virus, incluidos el virus vaccinia (VV), el virus del herpes simple y los vectores adenovirales. Cas9 es atractivo para la inactivación de genes a través de mutaciones indel, pero se vuelve menos práctico cuando se requieren múltiples cortes para eliminar segmentos del genoma o insertar un transgén a través del ADN del donante. Además, la edición está limitada por el diseño del ARNg, los efectos fuera del objetivo en los genomas virales y del huésped, y la dependencia de las secuencias de PAM en regiones de interés25.

Con esto en mente, y a través de dos ejemplos basados en HSV y adenovirus, este artículo ilustra el método de recombinación, que se puede aplicar ampliamente, desde virus hasta bacteriófagos, plásmidos complejos y diversos sistemas experimentales. La recombinación es una técnica de ingeniería genética in vivo , utilizada principalmente en Escherichia coli, que explota las proteínas de recombinación de bacteriófagos dependientes de la temperatura para catalizar la recombinación homóloga entre elementos de ADN con tan solo 30 pb de homología26. Este enfoque permite la inserción, eliminación o modificación precisas de secuencias sin depender de los sitios de restricción o el tamaño del ADN. En este manuscrito, describimos una versión basada en la cepa SW102 de E. coli inducible por calor, aunque también están disponibles cepas alternativas con sistemas inducibles específicos27.

La recombinación comienza con la preparación de células bacterianas electrocompetentes a través de un choque de temperatura controlado para activar la maquinaria de recombinación de fagos. Las moléculas de ADN que llevan los brazos de homología apropiados se electroporan. Estos pueden ser ADN bicatenario (dsDNA) generados por digestión de restricción o PCR o ADN monocatenario (ssDNA) como oligonucleótidos. La presencia de secuencias homólogas junto con proteínas de recombinación activas permite la creación de nuevas moléculas de ADN con la modificación deseada.

La recombinación de la tecnología de clonación molecular permite una ingeniería genética precisa y se aplica en diversos contextos, incluida la inserción de marcadores seleccionables o no seleccionables en plásmidos, ADN cromosómico bacteriano y cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Los BAC son particularmente valiosos para clonar grandes fragmentos genómicos, incluido el ADN adenoviral y HSV, lo que permite la producción rápida de vectores virales. Más allá de las aplicaciones traslacionales, la recombinación también apoya la investigación básica al permitir la eliminación, modificación o reemplazo dirigidos de genes virales o dominios de proteínas. La recombinación tiene algunas limitaciones: los brazos cortos de homología dificultan la recombinación en regiones repetitivas; Los sustratos amplificados por PCR pueden introducir ocasionalmente mutaciones; y se debe conocer la secuencia de la región objetivo.

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Protocolo

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Como requisito previo para la recombinación, debe estar disponible una cepa bacteriana competente (por ejemplo, SW102) con un genoma de interés BAC. Aunque la recombinación es un método altamente eficiente para enriquecer colonias que han sufrido la modificación deseada, aquí describimos una estrategia de recombinación de dos pasos, denominada primer y segundo paso (Figura 1). En el primer paso, se inserta un casete de expresión que contiene marcadores de selección positivos y negativos en el locus de interés. En el segundo paso, este casete se reemplaza con la modificación genética real destinada al genoma final. Los marcadores de selección utilizados en este estudio incluyen la resistencia a la ampicilina (AmpR), la actividad de la beta-galactosidasa (β-gal) y el gen sacB ; sin embargo, se puede emplear cualquier combinación de marcadores de selección positivos y negativos, dependiendo de las necesidades específicas del grupo de investigación.

1. Inserte el casete de selección en la región de destino

  1. Día 0
    1. Raya SW102 que contienen el BAC deseado en LB Agar + antibiótico (cuyo gen de resistencia está en BAC (p. ej., cloranfenicol 12,5 μg / mL). Cultívalas durante la noche en la incubadora a 32 °C.
      NOTA: Evite temperaturas > 32 °C para evitar la inducción de genes recombinantes durante esta fase.
  2. Día 1
    1. Realice una PCR para amplificar el casete de selección AmpR/LacZ/SacB. Utilice cebadores directos e inversos que contengan en el extremo 3' la secuencia para recocer y amplificar el casete de selección y en el extremo 5' 30-80 pb que representen brazos de homología a la región genómica viral a modificar (Tabla 1).
      NOTA: El casete de selección, así como el inserto, se pueden pedir fácilmente como construcciones sintéticas a proveedores especializados. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar la presencia de promotores duplicados, terminadores u otros elementos genéticos, ya sea dentro del BAC (control de genes BAC) o en el genoma viral para evitar eventos de recombinación no deseados.
    2. Garantizar la identidad y la pureza del fragmento de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (ya que el casete AmpR/LacZ/SacB es de 3.400 pb, ejecutar un gel de agarosa al 1%) y que los valores de 260/230 y 260/280 estén en línea con el ácido nucleico puro.
    3. Por la tarde, inocular una sola colonia SW102 en 5 mL de LB e incubar durante la noche a 32 °C.
  3. Día 2
    1. Inocular 1-2 ml del cultivo nocturno en 100 ml frescos de LB. Hacer crecer las bacterias hasta un OD600 de 0,55-0,7, midiendo el OD600 regularmente para no perder la fase exponencial.
    2. Preparar un baño de agua a 42 °C para la inducción y enfriar a 4 °C ~250 mL de ddH2O estéril para lavados.
    3. Una vez que el cultivo haya alcanzado la OD deseada, transfiera 50 mL a un tubo cónico limpio e incube a 42 °C en un baño de agua durante 15 min. Incluir un control negativo no inducido.
      NOTA: Este paso inducirá proteínas rojas lambda.
    4. Deje los tubos en hielo durante 10 min, luego centrifugue durante 5 min a 3.200 × g a 4 °C (tanto inducidos a 42 °C como no inducidos).
    5. Deseche el sobrenadante, agregue 40 ml de ddH2O estéril y helado y vuelva a suspender el sedimento (tanto inducido a 42 ° C como no inducido).
    6. Centrifugar de nuevo durante 8 min (ver paso 1.3.4) y repetir el paso de lavado (paso 1.3.5) y centrifugar. Repita el paso de lavado hasta que el sobrenadante esté tan claro como el agua (sin turbidez ni suspensiones) (2-4 lavados).
    7. Después de la última centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 200 μL de ddH2O estéril y helado (tanto inducido a 42 °C como no inducido).
    8. Transfiera una alícuota de los gránulos resuspendidos (50 μl de HSV-1 y 25 μl de Adeno) a tubos de 1,5 ml preenfriados (tanto inducidos a 42 °C como no inducidos). Agregue 50-400 ng de producto de PCR purificado (no exceda los 5 μL). Agite los tubos e incube en hielo durante 5 min.
    9. Transfiera la mezcla del paso anterior a una cubeta preenfriada y electropore a 2,50 kV (2.500 V, cubeta de 0,2 cm) (tanto inducida a 42 °C como no inducida).
    10. Después de la electroporación, deje que las bacterias se recuperen en 1 ml de LB durante 1,5 h a 32 °C. Agrega 1 mL de LB a la cubeta para limpiarla y recoger todo.
    11. Esparza diferentes cantidades de bacterias (10, 50, 200 μL) en LB Agar + Ampicilina (100 μg/ml), X-Gal (20 μg/ml) e IPTG (0,5 mM) y déjelas crecer durante la noche (ON) a 32 °C.
    12. Preparar placas con AMP/X-Gal (misma concentración que en el paso 1.3.11) y placas con sacarosa5.
  4. Día 3
    NOTA: En este punto, se espera que las colonias hayan crecido y que aparezcan azules, pero solo en las placas donde se indujeron bacterias a 42 °C y se electroporaron con el inserto que contenía el casete de selección. Una vez establecido esto, es necesario verificar la integridad del casete de selección en algunas de las colonias.
    1. Identifique las placas de ON donde las colonias están <50 para evitar la recolección de dos o más colonias. Elija varias colonias (típicamente 8-10 son suficientes para identificar al menos una colonia adecuada) y dilúyalas en aproximadamente 50 μL de H2O. Inocular colonias azules individuales en 50 μL de H2O y rayarlas en placas selectivas negativas (LB Agar / Sacarosa / Cloranfenicol) y positivas (LB Agar / Ampicilina / Cloranfenicol / X-Gal / IPTG) (la misma concentración que en los pasos 1.1.2 y 1.3.11) (Figura 2).
      NOTA: Se espera encontrar 20-100 colonias en la placa, donde se han esparcido 50 μL. Sin embargo, si el número de colonias es menor, no significa necesariamente que la recombinación esté comprometida.
    2. Inocular el agua del paso 1.4.1 en 5 mL de LB e incubar las placas y el cultivo de LB durante la noche a 32 °C (Figura 2).
  5. Día 4
    1. Seleccione solo colonias azules que crecieron en placas Amp / X-Gal y no crecieron en placas de sacarosa (Figura 3). Para estos clones positivos (Tabla 2), transfiera una alícuota de 500 μL del cultivo durante la noche a 50 mL de LB fresco.
  6. Día 5
    1. Para cada clon positivo, prepare una puñalada de glicerol y extraiga y aísle el plásmido BAC (midiprep).
    2. Después de la extracción de BAC, realice un control de calidad para verificar si la recombinación se ha producido correctamente. Realice la secuenciación de Sanger del sitio de inserción. Si todo parece correcto, continúe con la segunda sección.

2. Reemplace el casete de selección con la modificación deseada

  1. Día 0
    1. Raye el clon positivo en agar LB. Incubar durante la noche a 32 °C.
  2. Día 1
    1. Realice una PCR para amplificar el inserto/modificación. Utilice cebadores directos e inversos que contengan en el extremo 3' la secuencia para recocer y amplificar el casete de selección y en el extremo 5' los mismos brazos de homología de 30-80 pb utilizados en el paso 1.3.1 (Tabla 1).
    2. Garantizar la identidad y la pureza del fragmento de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y que los valores de 260/230 y 260/280 estén en línea con el ácido nucleico puro.
    3. Inocular una sola colonia en 5 mL de LB e incubar durante la noche a 32 °C.
  3. Día 2
    1. Transfiera 2 ml del cultivo durante la noche a 100 ml de LB y crezca a 32 ° C hasta que OD600 alcance 0.55-0.7 (en ~ 2.5-3 h). Preparar un baño de agua a 42 °C para la inducción y enfriar a 4 °C ~250 mL de ddH2O estéril para lavados.
    2. Una vez alcanzada la OD deseada, transferir 50 mL de cultivo a un tubo cónico e incubar en el baño de agua a 42 °C durante 15 min para inducir proteínas de recombinación de fagos λ. Mantenga otro tubo de 50 ml a 32 °C como control no inducido.
    3. Después de la inducción de calor, coloque los tubos en hielo durante 10 min.
    4. Centrifugar durante 8 min a 3.200 × g a 4 °C (tanto a 42 °C inducidos como a los no inducidos).
      NOTA: A partir de este momento, trabaje en hielo para mantener la competencia de la celda SW102.
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo con 40 ml de agua preenfriada girando suavemente.
    6. Centrifugar durante 5 min a 3.200 × g a 0-4 °C.
    7. Repita el paso de lavado (paso 2.3.5) una vez.
    8. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el gránulo en 100 μL de agua.
    9. Transfiera una alícuota de los gránulos resuspendidos (50 μL de HSV-1 y 25 μL de Adeno) a tubos de 1,5 mL preenfriados (tanto inducidos a 42 °C como no inducidos). Añadir 50-400 ng de producto de PCR purificado (no superar los 5 μL). Agite los tubos e incube en hielo durante 5 min.
    10. Transfiera la mezcla del paso anterior a una cubeta preenfriada y electroporato a 2,50 kV (tanto inducida a 42 °C como no inducida).
    11. Deje que las células se recuperen en 5 ml de medio LB durante 4-5 h a 32 °C agitando.
      NOTA: El tiempo de recuperación es más largo que en el primer paso de recombinación para permitir la degradación de la proteína SacB residual después del reemplazo del casete.
    12. Coloque diferentes cantidades (50, 200, 500 μL) de cultivo en placas de Petri de agar LB que contengan sacarosa, X-Gal e IPTG (misma concentración que en los pasos 1.1.2 y 1.3.11). Incubar durante la noche a 32 °C.
  4. Día 3
    1. Examinar un número sustancial de colonias (20-100) para aumentar la probabilidad de identificar clones positivos que se hayan sometido con éxito a la recombinación con el fragmento que lleva la modificación deseada y el casete de selección. Realizar un cribado de primer nivel mediante PCR de colonias. Use una placa de Petri con una cuadrícula; elija colonias de un cuadrante dado y etiquételas (Figura 4).
      NOTA: Un enfoque particularmente efectivo implica el uso de un par de cebadores en los que un cebador se recoce fuera de la región objetivo (en el genoma viral) y el otro dentro del fragmento recombinado (Figura 5).
    2. Comprobar la presencia y el tamaño del amplicón de PCR por gel de agarosa (1,5%).
    3. Recoger del cuadrante correcto los clones positivos e inocular en 100 mL de LB. Incubar durante la noche a 32 °C.
  5. Día 4:
    1. Realice un midiprep para extraer el plásmido de cultivos bacterianos.
    2. Digestión del plásmido con enzimas de restricción y ejecute un gel de agarosa para analizar el patrón de digestión.
    3. Si el patrón de digestión es correcto, proceda con la secuenciación de la región modificada del genoma viral.
    4. Después de asegurar la identidad molecular de los clones recombinantes, proceda con la transfección y el rescate de las partículas virales.

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Resultados

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Generación de un virus del herpes oncolítico codificante de IL12
Como se describe en la sección introductoria de este trabajo, una aplicación potencial de la recombinación es la inserción de transgenes inmunoestimulantes en el genoma de los virus oncolíticos, con el objetivo de mejorar su potencial inmunoterapéutico. A continuación, presentamos un ejemplo de una aplicación de este tipo utilizando un vector oncolítico basado en HSV-1. Específicamente, este estudio investiga el impacto de la inserción d...

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Discusión

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Este protocolo de "RECOMBINEERING" (ingeniería genética mediada por RECOMBInation) utiliza una estrategia de dos pasos: primero, la integración de un casete de selección en el locus genómico de interés y, segundo, el reemplazo de este casete con la modificación deseada (Figura 1).

Los marcadores de selección utilizados incluyen la resistencia a la ampicilina (AmpR), la beta-galactosidasa (β-gal) y el sacB. AmpR permite la selecció...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros o no financieros relevantes que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por: PRIN 2022-MUR Italia, Subvención 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Centro Nacional de Terapia Génica y Medicamentos basados en Tecnología de ARN. PNRR PE13 One Health Acciones de investigación básica y traslacional que abordan las necesidades insatisfechas en enfermedades infecciosas emergentes. Los autores agradecen al servicio de síntesis Geneart por proporcionar ADN personalizados. Los autores también expresan su sincera gratitud a Michele Veneruso, quien contribuyó a la finalización exitosa de este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ampicilinacualquiercualquiergrado molecular
Para que oligo amplifique Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		cualquiercualquierPurificado por HPLC
Para oligo para amplificar AmpR / LacZ / SacB   casete: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		cualquiercualquierPurificado por HPLC
IPTGcualquiercualquiergrado molecular
Agar LB
LB medio
Phusion Hot Start II ADN polimerasa de alta fidelidadThermo ScientificF549S
Rev oligo para amplificar Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		cualquiercualquierPurificado por HPLC
Rev oligo para amplificar AmpR/LacZ/SacB  casete: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		cualquiercualquierPurificado por HPLC
Casete de selección SacB / AmpR / LacZEste manuscrito--
Sacarosacualquiercualquiergrado molecular
SW102 con BAC-HSV-1 o BAC-AdvEste manuscrito--
Triptonacualquiercualquiergrado molecular
Wizard SV GelPromegaReferencia A9281
X-galcualquiercualquiergrado molecular
Extracto de levaduracualquiercualquiergrado molecular

Referencias

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