Evaluación de la seguridad microbiana de las lecherías mediante perfiles proteómicos bacterianos mediante el enfoque MALDI

Resumen

Este protocolo permite una evaluación rápida y rentable de la composición microbiana en los productos lácteos mediante la combinación de la culturomica con MALDI-TOF MS. Ofrece resultados de taxonomía comparables a la secuenciación de ARNr 16S con un tiempo de respuesta más corto que los métodos de cultivo tradicionales.

Resumen

Presentamos un protocolo que utiliza el método de identificación de espectrometría de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS, en adelante "MS") para monitorear la presencia de microorganismos en diferentes productos lácteos (mantequilla, queso mozzarella, leche, crema) utilizando un enfoque proteómico, culturomica moderna y varios procedimientos de preparación de muestras que podrían incorporarse a los laboratorios de control de calidad de seguridad alimentaria como un método rápido, Herramienta confiable y robusta para monitorear la seguridad microbiana. Incluye un paso de aislamiento microbiano, la selección de colonias cultivadas, los procedimientos de preparación de muestras (células intactas, extracción in situ y en tubo), el establecimiento de parámetros de análisis de MS, la generación y recopilación de espectros de MS (huellas dactilares de proteínas) y, finalmente, la obtención de la taxonomía utilizando la plataforma MS, seguida de la interpretación y visualización de datos. Este método, validado por numerosos estudios, ofrece una identificación más fiable y rentable de los microorganismos de la leche en comparación con los sistemas comerciales de pruebas bioquímicas. Se destaca como un avance prometedor en microbiología de alimentos, que cumple con los diversos requisitos de los laboratorios a través de sus protocolos simples y un tiempo de análisis significativamente reducido. El protocolo presentado aborda las necesidades de la industria alimentaria al proporcionar una identificación microbiana confiable en un tiempo de respuesta adecuado (TAT) que se adapta bien a los procesos de fabricación.

Introducción

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una metodología integral para monitorear la seguridad microbiana de varios productos lácteos, incluidos la mantequilla, el queso, la leche y la crema, mediante el empleo de MS para el perfil proteómico bacteriano. Este enfoque, que combina la culturomica moderna con procedimientos optimizados de preparación de muestras, pretende ser una herramienta rápida, fiable y robusta para los laboratorios de seguridad alimentaria y control de calidad. La razón detrás de la creación y aplicación de esta metodología proviene de las limitaciones de los métodos estándar de identificación microbiana. Durante muchos años, los laboratorios veterinarios y de diagnóstico alimentario se han basado en pruebas bioquímicas convencionales que examinan el crecimiento y el metabolismo bacteriano en medios de cultivo diferenciales, seguidos de diversos ensayos enzimáticos¹. Si bien estos métodos, que con frecuencia se basan en pautas estándar como las del Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey, son relativamente económicos y pueden producir datos cuantitativos y cualitativos, son laboriosos y requieren mucho tiempo, y requieren una amplia preparación de medios, dilución de muestras, siembra, incubación, recuento de colonias, aislamiento y pasos de caracterización detallados ^2,3.

La introducción de sistemas comerciales semiautomatizados y automatizados como Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek y Biolog MicroPlates agilizó la identificación microbiana mediante ensayos bioquímicos, reduciendo así los costos y los tiempos de respuesta. Sin embargo, estos sistemas tienen algunos inconvenientes, como la escasa reproducibilidad, la falta de entradas en sus respectivas bases de datos y las dificultades para determinar las variaciones fenotípicas entre cepas, particularmente para bacterias no fermentativas o cepas dentro de una especie con diferencias bioquímicas menores, lo que podría conducir a resultados incorrectos in vitro ⁴. Dado esto, la EM ha evolucionado como una alternativa potente, actualmente común en microbiología clínica y ganando atención en los laboratorios de diagnóstico veterinario y calidad de la leche. Este enfoque se ha complementado con su velocidad, precisión y rentabilidad en la detección de varios microorganismos¹. Numerosos estudios han demostrado que la EM ofrece una identificación más fiable de los microorganismos de la leche, ofreciendo resultados más rápidos y baratos que los sistemas comerciales de pruebas bioquímicas ^5,6,7. Si bien las pruebas bioquímicas pueden ser suficientes para la identificación a nivel de género o grupo, el diagnóstico a nivel de especie a menudo requiere métodos más avanzados como la secuenciación de ARNr MS o 16S⁸. De hecho, la EM se considera una plataforma prometedora para la identificación flexible y fiable de aislados microbianos alimentarios, que satisface los diversos requisitos de los laboratorios de microbiología alimentaria a través de sus protocolos sencillos y su tiempo de análisis significativamente reducido, mejorando así la seguridad alimentaria ^4,5. Los costes operativos son mínimos debido al bajo consumo de reactivos, y la manipulación de muestras permite una mayor automatización y un alto rendimiento⁸. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la utilidad de este método depende intrínsecamente de las condiciones de crecimiento microbiano seleccionadas (incluido el tipo de medio de cultivo) y de la cobertura de especies de una base de datos de referencia, que se reconocen como los factores clave que limitan su utilidad.

La EM juega un papel importante en la microbiología de los alimentos al identificar y diferenciar las bacterias patógenas del ácido láctico (BAL) transmitidas por los alimentos y otras bacterias fermentativas⁹. Su utilidad se extiende a la culturomica moderna, permitiendo la identificación de todas las colonias microbianas cultivadas en medios de cultivo y facilitando la adquisición de información de la unidad formadora de colonias (UFC)⁷. Este enfoque ya se ha aplicado con éxito para descubrir comunidades microbianas tan complejas como las que se presentan en los intestinos humanos, involucradas en infecciones del pie diabético o conectadas con el tracto urinario, revitalizando los métodos dependientes del cultivo en las prácticas microbiológicas^10,11.

Este protocolo se presenta para guiar a los laboratorios en la implementación efectiva de MS para la evaluación de rutina de la seguridad microbiana en productos lácteos, abordando la necesidad de la industria de una identificación microbiana confiable dentro de un tiempo de respuesta práctico (TAT) adecuado para los procesos de fabricación. El protocolo detalla pasos cruciales, que incluyen (1) aislamiento microbiano de productos lácteos líquidos (leche, crema, suero) y sólidos (mantequilla, queso) utilizando una selección de medios de cultivo apropiados (agar de Man, Rogosa y Sharpe - agar MRS, agar M-17, agar Tween 80 para todo uso - agar APT, agar China Blue Lactose - agar CBL, agar Milk Plate Count - MPCA, agar de soja tríptico - TSA) y condiciones de incubación personalizadas; (2) procedimientos estandarizados de preparación de muestras para el análisis de MS, que ofrecen opciones como la transferencia directa de colonias, la extracción de ácido fórmico en el objetivo y la extracción de etanol/proteína de ácido fórmico en el tubo para adaptarse a diferentes tipos de bacterias y flujos de trabajo de laboratorio; y (3) análisis sistemático de MS, incluida la calibración del instrumento, la definición de parámetros óptimos de adquisición de espectros y pautas para la interpretación de datos, incluida la evaluación del valor de la puntuación y las verificaciones de consistencia para una asignación taxonómica confiable. Al proporcionar un enfoque estructurado y validado, este protocolo tiene como objetivo mejorar la precisión y la eficiencia del monitoreo microbiano en la industria láctea, contribuyendo en última instancia a mejorar la calidad de los alimentos y la salud pública.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de bacterias relacionadas con los lácteos

1. Obtención de cultivos bacterianos a partir de productos lácteos líquidos o sólidos
   1. Selección de medios de cultivo
      1. Para el aislamiento bacteriano de muestras lácteas, seleccione los medios de cultivo de acuerdo con los grupos microbianos esperados, incluidos los medios de crecimiento general, los medios para bacterias gramnegativas, bacterias del ácido láctico (BAL), bacterias formadoras de esporas, así como microorganismos de crecimiento lento o fastidiosos.
         NOTA: Para maximizar la recuperación de las especies dominantes y raras, se deben inocular múltiples medios en paralelo. En la Tabla 1 se presenta un conjunto de medios de ejemplo para el análisis del microbioma de muestras lácteas.
   2. Inoculación y siembra
      1. Obtenga una muestra representativa del producto lácteo y mezcle bien.
      2. Transfiera asépticamente 1 ml (muestras líquidas: leche, nata, suero de leche) o 1 g (muestras sólidas: queso, mantequilla) de la muestra a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medio líquido estéril (agua de peptona / solución de NaCl al 0,85 %). Para muestras sólidas, caliente el medio líquido a 40-42 °C antes de agregar la muestra.
      3. Homogeneizar la muestra mediante vórtices vigorosos durante 30-60 s. Para muestras grasas o duras, continuar la homogeneización hasta obtener una suspensión uniforme.
      4. Prepare una serie de diluciones diez veces tomando 1 ml de suspensión y transfiriéndola a tubos sucesivos que contengan 9 ml de solución estéril. Mezclar bien cada dilución.
         NOTA: Dependiendo del tipo de muestra y del nivel esperado de contaminación microbiana, prepare diluciones que oscilen entre ^10-1 y ^10-6. Para la mayoría de las muestras, las diluciones ^{de hasta 10-3} serán suficientes; Sin embargo, al analizar la leche fresca o el queso azul, será necesario preparar más diluciones. Para garantizar un aislamiento preciso y facilitar la selección de colonias, la dilución óptima de la inoculación debe dar de 30 a 300 colonias por placa. Este rango permite una clara diferenciación de colonias individuales y minimiza el riesgo de superposición de crecimientos, facilitando la obtención de cultivos bacterianos homogéneos y no contaminados para su posterior análisis. Para algunos productos lácteos procesados (p. ej., suero de leche), se puede usar una muestra fresca sin diluir (p. ej., 0.1 ml) para el recubrimiento directo.
      5. Tomar 0,1 ml de la muestra o su dilución y transferirla a la superficie de placas de Petri previamente preparadas que contengan el medio de agar adecuado.
      6. Distribuir uniformemente el inóculo sobre la superficie del agar utilizando un esparcidor estéril. Deje que el inóculo se absorba en el medio durante 15 min, luego invierta las placas.
   3. Incubación
      1. Incubación aeróbica: para todas las muestras investigadas, inocular placas de agar APT, M-17, CBL, MPCA y TSA, incubar en condiciones aeróbicas a 37 °C y 30 °C durante 24 h. Las temperaturas de incubación se determinaron en función de los requisitos óptimos de crecimiento de diferentes grupos microbianos, cruciales para evaluar tanto la calidad higiénica (30 °C para mesófilos generales) como la seguridad para la salud pública (37 °C para patógenos asociados a humanos y organismos indicadores) de los productos lácteos.
         NOTA: Si se espera un crecimiento intensivo de bacterias formadoras de esporas, en el caso de TSA, se prefiere un tiempo de incubación más corto (~ 12 h).
      2. Incubación anaeróbica: para todas las muestras investigadas, inocular placas de agar MRS, incubar en condiciones anaeróbicas a 37 °C y 30 °C durante 24-72 h, controlando el crecimiento microbiano todos los días. Las temperaturas de incubación se determinaron como se mencionó en el paso 3.1.
         NOTA: Las condiciones de incubación anaeróbica se pueden lograr colocando placas en recipientes herméticos con sobres generadores de atmósfera anaeróbica, que eliminan el oxígeno y proporcionan una atmósfera adecuada para el crecimiento de bacterias anaeróbicas.
   4. Obtención de cultivos puros
      1. Después de la incubación, inspeccione las placas y seleccione colonias individuales cultivadas en función de sus características morfológicas (por ejemplo, tamaño, forma, color, textura).
      2. Purifique las colonias seleccionadas subcultivando (rayando) en el mismo medio de agar utilizando un asa microbiana de 1 μL y las mismas condiciones de incubación.

Medio de cultivo	Aplicación	Condición de cultivo
Agar de soja tríptico (TSA)	Medio general para el cultivo de una amplia gama de bacterias	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico
Agar sangre (BLA; con 5% de sangre de oveja)	enriquecido, diferenciación de hemólisis, útil para Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico
Agar MRS (agar de Man, Rogosa y Sharpe)	selectivo para Lactobacillus y otras BAL Agregue 1% Tween-80 para apoyar el crecimiento de L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus o L. acidophilus.	30 °C, 48–72 h, anaeróbico o microaerofílico
Agar M17	selectivo para Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, anaeróbico o microaerofílico
Agar APT (agar Tween 80 multiuso)	selectivo para BAL y algunas bifidobacterias	30 °C, 48–72 h, anaeróbico o microaerofílico
Agar Scheadler	aislamiento selectivo y enriquecedor de anaerobios, incluidos Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, anaeróbico
Agar CBL (agar de lactosa azul de China)	medio diferencial, para bacterias coliformes y otras bacterias fermentadoras de lactosa	37 °C, 24–48 h, aeróbico
Agar de recuento en placa de leche (MPCA)	universal, para el número total de bacterias mesófilas aeróbicas	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico

Tabla 1: Lista de medios sugeridos para el análisis del microbioma de muestras lácteas con condiciones de cultivo específicas.

2. Preparación de muestras bacterianas para análisis de MS

1. Antes de comenzar, prepare la solución de matriz MALDI
   NOTA: El compuesto de matriz más utilizado es HCCA, ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. Este compuesto es fotosensible, así que prepare y almacene la matriz en recipientes oscuros o lejos de la luz.
   1. Prepare la mezcla de disolventes utilizando las siguientes proporciones: 50 % de acetonitrilo (grado HPLC), 47,5 % de agua (grado HPLC) y 2,5 % de ácido trifluoroacético (TFA).
   2. Disuelva la matriz en la mezcla de disolventes hasta una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml (o hasta la saturación, hasta que los cristales no disueltos permanezcan visibles).
   3. Si la solución no es clara (quedan cristales), centrifugar o filtrar la solución (por ejemplo, a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm) para obtener un líquido transparente.
      NOTA: Se permite el almacenamiento en el refrigerador por períodos cortos, siempre que haya un número bajo de ciclos de descongelación.
2. Para identificar bacterias usando MS, use uno de los 3 procedimientos de preparación de muestras:
   1. Transferencia directa de colonias: utilice este método más simple y rápido cuando se trate de bacterias no resistentes a la lisis y de buen crecimiento, como la mayoría de las bacterias gramnegativas.
      1. Con un asa estéril o un palillo de dientes, transfiera una pequeña cantidad (~ 1 μL) de la colonia cultivada a un lugar en la placa MALDI.
      2. Unte el material bacteriano directamente en un punto designado en la placa objetivo de MALDI para crear una capa delgada y uniforme.
      3. Una vez seco, cubra el lugar con 1 μL de solución de matriz HCCA y deje secar al aire a temperatura ambiente.
   2. Extracción de ácido fórmico en el objetivo: úselo para bacterias difíciles de identificar (por ejemplo, grampositivas, levaduras) cuyas paredes celulares dificultan la liberación de proteínas sin procesamiento adicional.
      1. Recoja una pequeña cantidad de biomasa bacteriana de una sola colonia bacteriana con un asa microbiana desechable o un palillo de dientes estéril.
      2. Unte el material bacteriano directamente en un punto designado en la placa objetivo de MALDI para crear una capa delgada y uniforme.
      3. Cubra el material bacteriano untado con 1 μl de solución de ácido fórmico al 70% y seque al aire a temperatura ambiente.
      4. Una vez seco, cubra el lugar con 1 μL de solución de matriz HCCA y deje secar al aire a temperatura ambiente.
   3. Extracción de proteínas en tubo (método de etanol / ácido fórmico): use este método para microorganismos difíciles de identificar, incluidas algunas bacterias grampositivas, levaduras y micobacterias.
      1. Con un asa o hisopo estéril, transfiera de 1 a 3 colonias completas de una placa de cultivo en agar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 300 μl de agua estéril.
      2. Agregue 900 μL de etanol absoluto para ajustar la concentración final de etanol a aproximadamente el 75%. Mezcle o haga un vórtice durante unos segundos.
      3. Centrifugar la muestra durante 2 min a 15.000 x g (temperatura ambiente).
      4. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.
         NOTA: En el caso de cepas mucosas, se recomienda centrifugación adicional a 4 °C.
      5. Deje el tubo de pellets abierto hasta que todo el etanol residual se haya evaporado (5-10 min, temperatura ambiente).
      6. Agregue 20-50 μL de ácido fórmico (FA) al 70% al gránulo de células secas. Mezclar pipeteando o vórtice hasta que el pellet se vuelva a suspender por completo.
         NOTA: El volumen debe ser proporcional a la cantidad de material biológico.
      7. Agregue un volumen igual de acetonitrilo (ACN) a la suspensión de ácido fórmico. Mezclar con cuidado.
      8. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min (temperatura ambiente).
      9. Transfiera 1 μl del sobrenadante a un lugar designado en una placa objetivo MALDI.
      10. Deje que la mancha se seque completamente al aire a temperatura ambiente.
      11. Cubra el punto de muestra seco con 1 μl de solución de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA).
      12. Deje que la matriz se seque al aire completamente a temperatura ambiente antes del análisis de MS (Figura 1).
          NOTA: 70% Ácido fórmico: Corrosivo; causa quemaduras. Mango en una campana extractora. Acetonitrilo: Inflamable y tóxico. Mantener alejado de las llamas y evitar la inhalación/contacto. Ácido trifluoroacético (TFA): Fuerte, corrosivo y volátil; Evite el contacto con la piel y los ojos y la inhalación. Siempre use una bata de laboratorio, guantes resistentes a productos químicos y gafas de seguridad. Manipule todos los reactivos en una campana extractora para evitar la inhalación. Evite el contacto con la piel y los ojos; trabaje lejos de las llamas abiertas. Recoja los desechos de solventes ácidos y orgánicos en contenedores compatibles claramente etiquetados para su eliminación adecuada.

Figura 1: Un árbol de decisión que visualiza el proceso de selección de un procedimiento de preparación de muestras apropiado para la identificación de aislados bacterianos mediante la técnica MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Adquisición de espectros e identificación microbiana mediante la técnica MS

1. Calibración
   NOTA: Para una determinación precisa de la masa en MS, antes de analizar muestras desconocidas, calibre el instrumento utilizando los estándares apropiados. La calibración adecuada del instrumento es crucial para una identificación confiable.
   1. Preparar puntos de calibrador en la placa diana MALDI que contenga 1 μl de: (a) estándar de prueba bacteriano (BTS), que contenga un extracto de Escherichia coli DH5 alfa, que cubra un rango de masa de 3,6-17 kDa (para MBT Biotyper); (b) Calibrador de microbiología que contiene extracto de proteína E. coli ATCC 25922, ribonucleasa y mioglobina, que cubre un rango de masa de 3,6-17 kDa (para EXS2600 sistema). Deje secar al aire y superponga los puntos secos del calibrador con 1 μl de solución de matriz HCCA, similar a la preparación de la muestra.
   2. Cargue la placa objetivo MALDI que contiene las muestras preparadas y los puntos de calibrador en el instrumento. Ejecute el análisis de los puntos de calibración utilizando el modo de calibración (automático).
   3. Verifique la calibración para asegurarse de que la precisión de la masa esté dentro de los límites aceptables en (100 ppm) del rango de masa especificado (2-20 kDa).
2. Adquisición de Spectra
   NOTA: Cuando se calibra el instrumento, se adquieren espectros de masas de cada punto de muestra preparado.
   1. Parámetros generales de adquisición
      1. Opere el espectrómetro de masas en modo de iones positivos lineales.
      2. Establezca el rango de detección de masa de 2.000 a 20.000 m/z (2 a 20 kDa).
   2. Utilice los siguientes ajustes específicos del instrumento
      1. Voltajes de fuente de iones: fuente de iones 1 (IS1) a 20 kV, fuente de iones 2 (IS2) a 18 kV, voltaje de lente a 9 kV. El voltaje de aceleración puede ser de hasta 25 kV.
      2. Voltaje del detector: Ajustado a aproximadamente 2,65 kV.
      3. Ajustes de extracción de iones pulsados: 100 ns, tiempo de extracción retardado fijado en 230 ns.
      4. Configuración de potencia del láser: ajuste manualmente para obtener la mejor calidad de espectro (en vista del número de señales e intensidades de señal), que generalmente oscila entre el 40% y el 65% de la potencia mínima requerida.
      5. Número de disparos por espectro: adquiera un número suficiente de disparos láser desde diferentes regiones de cada punto para generar un espectro de suma con una buena relación señal-ruido (S/N)→ (a) promedio de 200 disparos, tomados en pasos de 50 disparos desde 4 regiones diferentes de cada punto o (b) adquisición en pasos de 500 disparos: 50 disparos desde diez posiciones diferentes del punto objetivo usando el modo AutoXecute.
   3. Estrategia de medición de muestras
      1. Mida varios puntos por aislado (2 puntos por aislado como mínimo).
      2. Adquiera espectros replicados para cada punto para garantizar la consistencia y precisión de los hallazgos → medir por duplicado, con el objetivo de obtener un cierto número de espectros totales por muestra (4 espectros por muestra al menos → réplicas técnicas).
         NOTA: Sujete muestras biológicas (al menos 3) para obtener réplicas biológicas.

4. Identificación de microorganismos y análisis de datos

NOTA: La identificación del organismo se realiza comparando el perfil proteico obtenido (proteína específica "huella digital" del microorganismo) con una base de datos de referencia, y la correlación resultante tanto de la posición como de la intensidad de la señal se utiliza para generar un valor de coincidencia, que describe el nivel de confianza con el que el organismo estudiado se emparejó con su microorganismo de referencia correspondiente. Identifique microorganismos comparando espectros procesados con bases de datos de referencia.

1. Procesamiento de espectros
   1. Utilice el software adecuado para el procesamiento de espectros: (a) flexAnalysis para sistemas MALDI Biotyper o (b) EX-Accuspec para sistemas EXS2600.
   2. Aplique un método Savitzky-Golay como algoritmo de suavizado (ancho 2 m / z, 10 ciclos).
   3. Realice la corrección de línea de base para eliminar el ruido de fondo utilizando el algoritmo TopHat (umbral S/N = 2, ancho del filtro TopHat 0.2 Da ).
   4. Utilice un modo centroide como algoritmo de detección de picos (umbral S/N = 2).
2. Comparación de bases de datos e interpretación de puntajes
   1. Cargar los espectros de masas procesados de aislados desconocidos en la plataforma MALDI de identificación microbiana. Posteriormente, ejecute la identificación.
      NOTA: En estos estudios se utilizó el siguiente software: Biotyper versión 4.1.100, Ex-Accuspec versión V1. En el caso del software MALDI Biotyper, se recomienda la creación de espectros principales (MSP) a partir de espectros sin procesar para garantizar la mejor fiabilidad de coincidencia.
   2. Evalúe los resultados de identificación de acuerdo con los umbrales estándar del fabricante.
      NOTA: Para MALDI Biotyper y EXS2600, los valores de puntuación son:
      2.300-3.000: identificación de especies altamente probables;
      2.000-2.299: identificación segura de género, identificación probable de especies;
      1.700-1.999: probable identificación del género;
      0.000-1.699: identificación no confiable.
      Durante la evaluación del resultado de la identificación derivado de los hallazgos de soporte de la plataforma MALDI Biotyper utilizando categorías de consistencia: A- Especie Consistente → mejor coincidencia y todas las demás coincidencias con un valor de puntuación igualmente alto (>1.999) apuntan a la misma especie; B - Género Consistente → mejor coincidencia y otras coincidencias con valores de puntuación similares (1.700 - 1.999) apuntan al mismo género, pero pueden diferir a nivel de especie; C- No se han cumplido los requisitos de consistencia → para la consistencia a nivel de especie o género.

Resultados

Enfoque culturómico
El enfoque culturómico es una estrategia dirigida a diversificar al máximo las condiciones de cultivo de microorganismos con el fin de aumentar las posibilidades de aislar, entre otras, especies raras, difíciles de cultivar o no descritas previamente¹². Esto permite obtener una imagen mucho más amplia de la biodiversidad de la microflora presente en varias muestras, por ejemplo, muestras de alimentos. Ya en la etapa de evalu...

Discusión

El protocolo dedicado a la identificación microbiana de productos lácteos ofrece un avance importante con respecto a los métodos tradicionales al garantizar un consenso óptimo sobre velocidad, confiabilidad y rentabilidad. Sin embargo, algunos pasos cruciales dentro del protocolo exigen una atención cuidadosa. En primer lugar, la fase de aislamiento y cultivo es fundamental. Los medios de cultivo y las condiciones de incubación deben coincidir con la diversidad y carga microbiana esperad...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70% ácido fórmico	Chempur	115676307
Acetonitrilo	Merck KGaA	1.00014.1011
Agar APT	Merck KGaA	1.10453.0500
Estándar de Pruebas Bacterianas	Bruker Daltonik GmbH	8255343
Agar CBL (Agar de lactosa azul de China)	Merck KGaA	1.02348.0500
Agar de sangre de Columbia	Oxóide	CM0331B
Agar M17
Conteo de Agar en Placa de Leche (MPCA)	Oxóide	CM0681
MRS Agar (de Man, Rogosa y Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 objetivo de acero pulido BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Agua con peptona	Sigma-Aldrich	70179
Agar de Scheadler	Sigma-Aldrich	91019
Sangre de oveja	Biomaxima	SL0160-100
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508
Agar de soja tríptico (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Agua	Merck KGaA	1.15333.2500
&alfa;-Ciano-4-hidroxicinnámico	Bruker Daltonik GmbH	8201344