Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

La heterogeneidad de célula a célula ha surgido como un principio fundamental de los sistemas biológicos, especialmente en los contextos de progresión de la enfermedad, resistencia a los medicamentos y diferenciación celular ^1,2. En organismos multicelulares, incluso células genéticamente idénticas en el mismo microambiente pueden exhibir fenotipos distintos, que surgen de diferencias en los niveles transcriptómico³, proteómico⁴ y, crucialmente, metabolómico⁵. Si bien la genómica y la transcriptómica unicelular han ganado una tracción sustancial en la última década, la metabolómica unicelular sigue estando comparativamente subdesarrollada debido a la complejidad inherente y la rápida dinámica de los metabolitos⁶. Los metabolitos son altamente sensibles a las señales ambientales, tienen diversas estructuras químicas y polaridades⁷, y existen en bajas concentraciones en pequeños volúmenes celulares⁸. Estas propiedades hacen que su medición fiable de células individuales sea un desafío analítico. Dado que la metabolómica ofrece la instantánea más cercana del estado funcional en tiempo real de una célula, el avance de los métodos para estudiar de manera sólida el metaboloma a una resolución unicelular es esencial para una comprensión más profunda de la fisiología y patología celular⁷.

Las técnicas tradicionales de metabolómica masiva promedian las señales en grandes poblaciones celulares, enmascarando la heterogeneidad celular y ocultando potencialmente firmas metabólicas raras pero significativas. Por el contrario, la metabolómica unicelular revela perfiles bioquímicos únicos a nivel de célula individual, lo que la hace invaluable para estudiar procesos como la diferenciación de células madre, las respuestas a los medicamentos y los mecanismos de la enfermedad 6,9,10,11,12,13. Los métodos basados en espectrometría de masas (MS), como la MS de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y la MS de iones secundarios (SI), han avanzado en el campo, pero enfrentan desafíos como la preparación compleja, los requisitos de vacío y la ionización destructiva que limitan el análisis de células vivas ^9,14. En particular, los desarrollos recientes en instrumentación dieron como resultado técnicas de vanguardia, incluido MALDI en modo de transmisión junto con postionización inducida por láser (t-MALDI-2¹⁵) y espectrometría de masas de iones secundarios Orbitrap (OrbiSIMS)^16,17, que permitieron imágenes metabólicas 3D de alta resolución y sin etiquetas a nivel unicelular y subcelular, ofreciendo una precisión de masa y una resolución espacial excepcionales.

La MS de ionización ambiental aborda estos problemas. Las técnicas representativas de SCMS ambiental incluyen espectrometría de masas de video unicelular en vivo (Video-MS)¹⁸, DESI¹⁹ y nano-DESI²⁰. Entre ellas, el SCMS de sonda única es una de las técnicas que destaca por su capacidad para muestrear e ionizar directamente células vivas en tiempo real utilizando un sistema de doble capilar 21,22,23,24. Esta técnica minimiza la alteración de la muestra al tiempo que permite un perfil metabólico in situ de alta resolución y se ha aplicado con éxito a estudios de absorción e influencia del fármaco en el metabolismo celular 22,25,26,27,28,29,30, respuestas ambientales^31,32 y heterogeneidad metabólica³³. 34,35,36 entre células individuales.

Si bien muchos métodos de SCMS ambiental permiten el análisis de células vivas, generalmente sufren de bajo rendimiento debido al manejo manual requerido para la selección de células individuales 23,37,38. Dado que el metabolismo celular es altamente dinámico, la preparación prolongada de muestras puede alterar los perfiles de metabolitos. Para abordar esto, los investigadores aplican técnicas de enfriamiento inmediatamente después de aislar las células^39,40. El enfriamiento detiene la actividad metabólica ya sea por enfriamiento rápido 41,42,43,44 o desnaturalización enzimática 43,45,46,47, preservando el estado bioquímico de las células en un momento específico. Este paso es vital para garantizar datos metabolómicos precisos y temporalmente relevantes. Un protocolo de enfriamiento eficaz debe detener rápida y completamente la actividad metabólica intracelular. Se han evaluado varios métodos, incluida la solución salina isotónica fría⁴⁸, el acetonitrilo⁴⁶ enfriado, el metanol frío 44,47,48,49, la solución tampón de fosfato helada (PBS)^43,50, LN₂ 43,44,51 e incluso tratamientos con aire caliente ⁵². Si bien muchos de estos se desarrollaron originalmente para la metabolómica de células a granel, algunos, como el metanol frío y el acetonitrilo, se han adaptado para técnicas unicelulares como Pico-ESI-MS³⁹ y MALDI-MS⁴⁶. A pesar de su eficacia, cada método tiene inconvenientes: los disolventes orgánicos pueden causar fugas de metabolitos y daños en las membranas celulares^48,53, y las soluciones salinas no volátiles pueden interferir con la EM al causar supresión de iones⁵⁴, reducir la sensibilidad y comprometer la precisión de los datos^47,55.

La congelación instantánea de LN₂ se usa comúnmente en la investigación biológica⁵⁶ porque detiene rápidamente el metabolismo celular sin dejar sales no volátiles, lo que la convierte en una buena opción para SCMS. Sin embargo, puede dañar las membranas celulares, lo cual es problemático para SCMS^57,58. Para reducir este daño, algunos estudios utilizaron un método que involucra filtración rápida, lavado frío con NaCl y congelación de LN₂, que ayuda a retener metabolitos de rápida renovación^53,59. Aún así, este método no es ideal para SCMS debido a las dificultades para aislar células individuales y los posibles efectos de la matriz de los residuos de sal. El almacenamiento a -80 °C es otro método de conservación común, pero sus efectos sobre los perfiles de metabolitos unicelulares siguen sin estar claros. Hemos informado previamente estudios para abordar estas limitaciones mediante la combinación de múltiples pasos clave: las células se lavan primero con una solución de AF volátil compatible con MS, luego se enfrían con LN₂, se liofilizan al vacío y se almacenan a baja temperatura (-80 °C)⁶⁰. El enfoque actual minimiza el daño celular y la degradación de metabolitos, lo que permite mediciones de SCMS más precisas. Este trabajo se centra en detalles experimentales, con el objetivo de promover la adopción de este método de preparación celular para técnicas robustas de SCMS.

Realice cada paso dentro de un laboratorio de bioseguridad certificado de Clase II y en condiciones estériles. En este estudio, se utilizó la línea celular HCT-116 como sistema modelo y las células se cultivaron en medio de cultivo completo. Los regentes y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Cultivo celular

1. Prepare un medio completo. Complemente el medio 5A de McCoy con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Caliéntalo a 37 °C.
2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Monitoree la confluencia diariamente y el paso cuando los cultivos alcancen ~ 80% de confluencia.
3. Pasar las células (cada ~ 2 días).
   1. Aspirar el medio y enjuagar una vez con 5 ml de 1x PBS.
   2. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a la placa de cultivo e incubar a 37 °C durante 3 min para facilitar el desprendimiento celular.
   3. Neutralice la tripsina añadiendo 8 ml de medio completo precalentado y pipeteando suavemente para dispersar las células.
   4. Transfiera 1 ml de la suspensión a 9 ml de medio completo fresco.
   5. Cuenta las células.
      NOTA: Las celdas se contaron utilizando un contador de celdas automatizado TC20 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No se utilizó azul de tripano ni otros agentes de tinción.
4. Células de semillas en los cubreobjetos.
   1. Diluir las células a una concentración final de ~1 × 10⁶ células/ml.
   2. Coloque los cubreobjetos de vidrio individuales de 18 mm en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
      NOTA: Los cubreobjetos de vidrio deben esterilizarse en autoclave antes de usarse para el cultivo celular.
   3. Agregue 2 ml del medio completo y 200 μl de la suspensión celular (~ 2 × 10⁵ células / pocillo).
   4. Incube las células durante la noche para permitir la adhesión celular.
      NOTA: Para asegurarse de que las células estén en estado normal de crecimiento, verifique rutinariamente la morfología de las células y su estado de crecimiento (usando un microscopio), así como examine la posible contaminación por micoplasma (usando un kit de detección de micoplasma).

2. Lavado celular con solución de formiato de amonio (AF)

NOTA: Prepare una solución de FA nueva cada vez.

1. Prepare el tampón de lavado AF. Pesar 0,45 g de formiato de amonio y disolver en 50 ml de agua de grado LC/MS. La concentración final de formiato de amonio es de 0,14 M (0,9% p/p).
   NOTA: Mantenga la solución helada (0-4 °C) hasta su uso.
2. Agregue 2 ml de solución de AF fría a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
3. Enjuague los cubreobjetos. Usando un par de pinzas estériles para levantar suavemente cada cubreobjetos que contenga células adherentes de su pocillo y luego colocarlo brevemente (durante 2-3 s) en un pocillo separado precargado con 2 ml de solución fría de formiato de amonio (AF) al 0,9%. Repita el proceso de enjuague.
   NOTA: Para evitar perturbar las células durante el paso de lavado, realice el enjuague celular muy suavemente.

3. Enfriamiento celular por nitrógeno líquido (LN₂)

1. Coloque cada cubreobjetos enjuagado con AF (celdas hacia arriba) en la placa de Petri dentro del recipiente de papel de aluminio.
   NOTA: Use guantes con clasificación criogénica, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Realice todo el manejo de LN₂ en un área bien ventilada. El papel de aluminio se puede usar para doblar un recipiente para el enfriamiento de LN₂ .
2. Vierta lentamente 10-20 ml de nitrógeno líquido sobre los cubreobjetos, asegurando una cobertura completa.
3. Incline inmediatamente la placa de Petri con unas pinzas para decantar el nitrógeno líquido restante.
   NOTA: Complete esta acción en unos segundos para evitar la formación de grandes cristales de hielo por la humedad residual del lavado.

4. Liofilización celular al vacío

1. Liofilice inmediatamente después del enfriamiento de LN₂ para evitar la descongelación.
   NOTA: Retire el rotor del SpeedVac para crear una plataforma plana que acomode una placa de Petri de 100 mm.
2. Con guantes criogénicos y pinzas aislantes, coloque la placa de Petri que contiene los cubreobjetos refrigerados LN₂ en la cámara del concentrador de vacío.
3. Procese utilizando su configuración de vacío estándar y continúe durante 5-7 minutos hasta que el LN₂ visible se haya evaporado y los cubreobjetos parezcan secos. Los cubreobjetos secos no deben contener LN₂ residual ni cristales de hielo.

5. Almacenamiento de celdas en un congelador de -80 °C

1. Envuelva el recipiente con una toalla de papel y transfiéralo a un congelador a -80 °C durante 48 h.
2. Después del almacenamiento, transfiera inmediatamente los cubreobjetos que contienen la placa de Petri a un desecador a temperatura ambiente durante ~ 10 min. Asegúrese de que la escarcha condensada o el agua en los cubreobjetos desaparezcan por completo antes de sacarlos del desecador.
   NOTA: La transferencia rápida de los cubreobjetos al desecador minimiza la condensación; Incluso una humectación superficial menor puede disolver metabolitos secos.
3. Después del lavado con FA, divida las muestras en dos grupos (Grupo 1 y Grupo 2). Aplique los siguientes protocolos de procesamiento.
   Grupo 1: Enfriamiento LN₂ → liofilización → análisis SCMS (sin almacenamiento).
   Grupo 2: Enfriamiento con LN₂ → liofilización → almacenamiento a -80 °C 48 h → análisis SCMS.
4. Continúe con el análisis SCMS como se describe a continuación.
   NOTA: Se pueden preparar más grupos de celdas utilizando diferentes condiciones. El Grupo 1 y el Grupo 2 se utilizan para ilustrar los protocolos generales.

6. Fabricación de una sola sonda y configuración de SCMS

NOTA: La sonda única se fabrica de acuerdo con los procedimientos establecidos 21,24,60,61, y aquí solo se proporcionan protocolos breves.

1. Tire de la aguja de cuarzo de doble orificio con un extractor láser y genere una punta de ~ 10 μm. Ensamble una sonda única insertando el capilar de sílice fundida y el emisor nano-ESI en la aguja de cuarzo de doble calibre. Asegure todos los componentes a un portaobjetos de vidrio con epoxi de fraguado rápido.
2. Monte la sonda única en la platina XYZ. Coloque la sonda única en un manipulador XYZ motorizado colocado debajo de un microscopio digital.
3. Acople la configuración a un espectrómetro de masas para el análisis SCMS.
4. Utilice acetonitrilo (≥99,9%) que contenga 0,1 % de ácido fórmico como disolvente de extracción a un caudal de 150 nL/min suministrado por una bomba de jeringa.
5. Establezca los parámetros de MS.
   Modo de iones positivos: m/z 200-1500, +2,9 kV, resolución de masa 120 k (a m/z 200).
   Modo de iones negativos: m/z 70-900, −2,1 kV, resolución de masa 120 k (a m/z 200).
   NOTA: Debido a que los iones negativos generalmente se detectan en el rango m/z más bajo que el de los iones positivos, se pueden usar diferentes rangos m/z para estos dos modos de iones. Los ajustes adicionales de MS incluyen un tiempo de inyección máximo de 100 ms, un microescaneo, control automático de ganancia (AGC) estándar, modo de escaneo completo (para análisis MS), disociación colisional de mayor energía (HCD) (para análisis MS/MS) con 10-35 de energía de colisión normalizada (NCE) y 320 °C para la temperatura del tubo de transferencia de iones. Se generó un cromatograma iónico total (TIC) en cada escaneo/punto de tiempo para monitorear la estabilidad de la señal y la detección de una sola célula.

7. Experimentos de SCMS de una sola sonda

1. Coloque los dos cubreobjetos (Grupo 1 y Grupo 2) juntos en la etapa XYZ motorizada de la configuración SCMS de una sola sonda 21,24,61.
2. Para minimizar los efectos por lotes, seleccione las células al azar bajo el microscopio.
3. Adquirir espectros de masas en modo de iones positivos y negativos. Analice varias células (por ejemplo, ~ 30) por grupo con la misma sonda única, caudal de disolvente y voltaje de ionización.
   NOTA: Utilice la misma sonda única, caudal de disolvente y voltajes de ionización para cada experimento para garantizar la comparabilidad de los datos. Calibrar el Orbitrap diariamente antes de adquirirlo. Tanto los análisis de MS como los de MS/MS se pueden realizar a nivel de una sola célula. Recopile datos de MS para obtener valores precisos de m / z para estudios de perfiles de metabolitos y etiquetas tentativas en análisis no dirigidos. Realizar análisis MS/MS de iones seleccionados para la identificación molecular en análisis dirigidos. Los datos se adquirieron utilizando un software de adquisición e interpretación de datos compatible.

8. Análisis de datos

1. Preprocese los datos SCMS sin procesar mediante un script de R personalizado. Los pasos de preprocesamiento incluyen la eliminación de ruido y fondo y la normalización de la intensidad de iones a TIC 11,12,23.
2. Desisótopa los datos de SCMS usando el paquete de Python ms_deisotope.
3. Realice la alineación de picos utilizando un script de Python interno⁶⁰. Utilice un ancho de ubicación de 0,01 m/z para la discretización. Utilice una tolerancia de masa de 0,01 m/z o 5 ppm para la alineación de picos.
4. Realice análisis estadísticos de datos con MetaboAnalyst 6.0⁶². Realice una prueba t y genere un mapa de calor (para los niveles relativos de metabolitos). Seleccione Usar los 100 mejores en la prueba T/ANOVA para generar los 100 metabolitos principales, clasificados por valores p de menor a mayor, con una diferencia significativa (p < 0,05) de la comparación. Traza un mapa de calor usando estos 100 metabolitos principales.
5. Busque valores precisos de m / z y espectros MS / MS en la base de datos de metabolomas humanos (HMDB⁶³). Utilice una tolerancia de masa de 10 ppm en la búsqueda de bases de datos de MS.
   NOTA: Se pueden utilizar otras bases de datos, como LipidMaps⁶⁴, para la búsqueda en bases de datos.

Este informe describe una metodología que integra el lavado celular, el enfriamiento celular rápido, el secado al vacío y el almacenamiento a -80 °C (Figura 1). Específicamente, este enfoque está diseñado para preservar el estado metabolómico de las células antes del análisis de SCMS. La eficacia de este protocolo se probó preparando células en dos condiciones diferentes: células recién templadas y secas (Grupo 1, que sirve como control), y células templadas, secas y almacenadas a -80 °C (Grupo 2). Cada grupo se analizó utilizando el método SCMS de sonda única en modos de iones positivos y negativos. Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) y la visualización de mapas de calor para evaluar las diferencias en los perfiles metabolómicos entre los grupos.

Los resultados de PCA en el modo de iones positivos (Figura 2A) revelaron que los Grupos 1 y 2 tenían perfiles de metabolitos generales similares. Los perfiles casi idénticos del Grupo 1 y el Grupo 2 demuestran que el almacenamiento a -80 °C durante 48 h no altera significativamente el metaboloma si las células se enfrían adecuadamente antes del secado. En el modo de iones negativos (Figura 2B), se observa un patrón comparable, aunque el Grupo 2 aparece ligeramente más distinto, potencialmente debido a las diferencias de ionización entre clases específicas de metabolitos, por ejemplo, las fosfatidilcolinas se detectan mejor en modo positivo, mientras que los ácidos grasos se ionizan de manera más eficiente en modo negativo60. A pesar de esta variación, la agrupación constante entre los grupos 1 y 2 en ambos modos respalda la conclusión de que el protocolo integrado de enfriamiento-secado-almacenamiento mantiene la integridad metabólica.

El análisis del mapa de calor validó aún más los hallazgos de PCA al representar abundancias relativas de los 100 metabolitos principales en dos grupos. Como se muestra en la Figura 3, los 100 metabolitos principales muestran patrones de abundancia altamente consistentes entre el Grupo 1 y el Grupo 2 en ambos modos iónicos. No se observan cambios importantes ni agrupamientos específicos de grupos, aunque las variaciones menores en algunos grupos de metabolitos pueden reflejar diferencias en la eficiencia de ionización o la estabilidad de los metabolitos. Estos resultados demuestran colectivamente que el flujo de trabajo de enfriamiento-secado-almacenamiento conserva los perfiles metabolómicos celulares con alta fidelidad, lo que lo hace muy adecuado para aplicaciones de SCMS ambientales.

Figura 1: Flujo de trabajo general para el análisis de espectrometría de masas unicelular (SCMS) que investiga cómo la extinción de LN2 y el almacenamiento de 48 h a -80 °C afectan los perfiles de metabolitos en células individuales. (A) Las células se sembraron, incubaron y enjuagaron con una solución de formato de amonio (AF). (B) Se prepararon dos grupos de células: Grupo 1: las células se lavaron, enfriaron y liofilizaron para experimentos inmediatos de SCMS sin almacenamiento; Grupo 2: las células se lavaron, enfriaron, liofilizaron y almacenaron a -80 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de componentes principales (PCA) de datos de SCMS de células HCT-116 en grupos experimentales en (A) modo de iones positivos y (B) modo de iones negativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Mapas de calor que muestran los niveles relativos de los 100 metabolitos principales detectados en células individuales de HCT-116 preparadas en diversas condiciones, presentadas para (A) modo de iones positivos y (B) modo de iones negativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.