Artículo de método

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

DOI:

10.3791/68995

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16 de septiembre de 2025

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La espectrometría de masas unicelular (SCMS) se ha convertido en una herramienta indispensable para estudiar el metabolismo celular. Debido a los avances en las técnicas modernas de espectrometría de masas (MS) y la demanda en los estudios de heterogeneidad celular en ciencias biológicas fundamentales y enfermedades humanas, se han desarrollado y aplicado una variedad de diferentes técnicas de SCMS en la investigación de laboratorio. Dado que los metabolitos pueden reflejar con precisión el estado celular, el análisis metabolómico SCMS de células vivas se considera una herramienta poderosa para proporcionar información molecular sobre las células. Sin embargo, un desafío importante en el análisis de SCMS de células vivas es preservar los perfiles de metabolitos endógenos durante la preparación, el transporte y la medición de la muestra. Los metabolitos celulares experimentan una rápida renovación y son muy sensibles a los cambios ambientales, lo que los hace susceptibles a la degradación o transformación antes del análisis. Para abordar esta limitación, presentamos un protocolo de preparación celular robusto y reproducible diseñado para preservar la integridad de los metabolitos celulares para SCMS. El protocolo integra el lavado celular con una solución volátil de formiato de amonio (AF), enfriamiento rápido con nitrógeno líquido (LN2), liofilización al vacío y almacenamiento a -80 °C. Este enfoque minimiza el daño a la membrana celular al tiempo que detiene eficazmente la actividad metabólica. Los resultados indican que el enfriamiento celular rápido es vital; sin embargo, es necesario limitar el tiempo de almacenamiento a -80 °C para preservar los metabolitos celulares. El protocolo propuesto puede utilizarse potencialmente para otras técnicas de SCMS existentes para aplicaciones amplias.

Introducción

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La heterogeneidad de célula a célula ha surgido como un principio fundamental de los sistemas biológicos, especialmente en los contextos de progresión de la enfermedad, resistencia a los medicamentos y diferenciación celular 1,2. En organismos multicelulares, incluso células genéticamente idénticas en el mismo microambiente pueden exhibir fenotipos distintos, que surgen de diferencias en los niveles transcriptómico3, proteómico4 y, crucialmente, metabolómico5. Si bien la genómica y la transcriptómica unicelular han ganado una tracción sustancial en la última década, la metabolómica unicelular sigue estando comparativamente subdesarrollada debido a la complejidad inherente y la rápida dinámica de los metabolitos6. Los metabolitos son altamente sensibles a las señales ambientales, tienen diversas estructuras químicas y polaridades7, y existen en bajas concentraciones en pequeños volúmenes celulares8. Estas propiedades hacen que su medición fiable de células individuales sea un desafío analítico. Dado que la metabolómica ofrece la instantánea más cercana del estado funcional en tiempo real de una célula, el avance de los métodos para estudiar de manera sólida el metaboloma a una resolución unicelular es esencial para una comprensión más profunda de la fisiología y patología celular7.

Las técnicas tradicionales de metabolómica masiva promedian las señales en grandes poblaciones celulares, enmascarando la heterogeneidad celular y ocultando potencialmente firmas metabólicas raras pero significativas. Por el contrario, la metabolómica unicelular revela perfiles bioquímicos únicos a nivel de célula individual, lo que la hace invaluable para estudiar procesos como la diferenciación de células madre, las respuestas a los medicamentos y los mecanismos de la enfermedad 6,9,10,11,12,13. Los métodos basados en espectrometría de masas (MS), como la MS de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y la MS de iones secundarios (SI), han avanzado en el campo, pero enfrentan desafíos como la preparación compleja, los requisitos de vacío y la ionización destructiva que limitan el análisis de células vivas 9,14. En particular, los desarrollos recientes en instrumentación dieron como resultado técnicas de vanguardia, incluido MALDI en modo de transmisión junto con postionización inducida por láser (t-MALDI-215) y espectrometría de masas de iones secundarios Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, que permitieron imágenes metabólicas 3D de alta resolución y sin etiquetas a nivel unicelular y subcelular, ofreciendo una precisión de masa y una resolución espacial excepcionales.

La MS de ionización ambiental aborda estos problemas. Las técnicas representativas de SCMS ambiental incluyen espectrometría de masas de video unicelular en vivo (Video-MS)18, DESI19 y nano-DESI20. Entre ellas, el SCMS de sonda única es una de las técnicas que destaca por su capacidad para muestrear e ionizar directamente células vivas en tiempo real utilizando un sistema de doble capilar 21,22,23,24. Esta técnica minimiza la alteración de la muestra al tiempo que permite un perfil metabólico in situ de alta resolución y se ha aplicado con éxito a estudios de absorción e influencia del fármaco en el metabolismo celular 22,25,26,27,28,29,30, respuestas ambientales31,32 y heterogeneidad metabólica33. 34,35,36 entre células individuales.

Si bien muchos métodos de SCMS ambiental permiten el análisis de células vivas, generalmente sufren de bajo rendimiento debido al manejo manual requerido para la selección de células individuales 23,37,38. Dado que el metabolismo celular es altamente dinámico, la preparación prolongada de muestras puede alterar los perfiles de metabolitos. Para abordar esto, los investigadores aplican técnicas de enfriamiento inmediatamente después de aislar las células39,40. El enfriamiento detiene la actividad metabólica ya sea por enfriamiento rápido 41,42,43,44 o desnaturalización enzimática 43,45,46,47, preservando el estado bioquímico de las células en un momento específico. Este paso es vital para garantizar datos metabolómicos precisos y temporalmente relevantes. Un protocolo de enfriamiento eficaz debe detener rápida y completamente la actividad metabólica intracelular. Se han evaluado varios métodos, incluida la solución salina isotónica fría48, el acetonitrilo46 enfriado, el metanol frío 44,47,48,49, la solución tampón de fosfato helada (PBS)43,50, LN2 43,44,51 e incluso tratamientos con aire caliente 52. Si bien muchos de estos se desarrollaron originalmente para la metabolómica de células a granel, algunos, como el metanol frío y el acetonitrilo, se han adaptado para técnicas unicelulares como Pico-ESI-MS39 y MALDI-MS46. A pesar de su eficacia, cada método tiene inconvenientes: los disolventes orgánicos pueden causar fugas de metabolitos y daños en las membranas celulares48,53, y las soluciones salinas no volátiles pueden interferir con la EM al causar supresión de iones54, reducir la sensibilidad y comprometer la precisión de los datos47,55.

La congelación instantánea de LN2 se usa comúnmente en la investigación biológica56 porque detiene rápidamente el metabolismo celular sin dejar sales no volátiles, lo que la convierte en una buena opción para SCMS. Sin embargo, puede dañar las membranas celulares, lo cual es problemático para SCMS57,58. Para reducir este daño, algunos estudios utilizaron un método que involucra filtración rápida, lavado frío con NaCl y congelación de LN2, que ayuda a retener metabolitos de rápida renovación53,59. Aún así, este método no es ideal para SCMS debido a las dificultades para aislar células individuales y los posibles efectos de la matriz de los residuos de sal. El almacenamiento a -80 °C es otro método de conservación común, pero sus efectos sobre los perfiles de metabolitos unicelulares siguen sin estar claros. Hemos informado previamente estudios para abordar estas limitaciones mediante la combinación de múltiples pasos clave: las células se lavan primero con una solución de AF volátil compatible con MS, luego se enfrían con LN2, se liofilizan al vacío y se almacenan a baja temperatura (-80 °C)60. El enfoque actual minimiza el daño celular y la degradación de metabolitos, lo que permite mediciones de SCMS más precisas. Este trabajo se centra en detalles experimentales, con el objetivo de promover la adopción de este método de preparación celular para técnicas robustas de SCMS.

Protocolo

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Realice cada paso dentro de un laboratorio de bioseguridad certificado de Clase II y en condiciones estériles. En este estudio, se utilizó la línea celular HCT-116 como sistema modelo y las células se cultivaron en medio de cultivo completo. Los regentes y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Cultivo celular

  1. Prepare un medio completo. Complemente el medio 5A de McCoy con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Caliéntalo a 37 °C.
  2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Monitoree la confluencia diariamente y el paso cuando los cultivos alcancen ~ 80% de confluencia.
  3. Pasar las células (cada ~ 2 días).
    1. Aspirar el medio y enjuagar una vez con 5 ml de 1x PBS.
    2. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a la placa de cultivo e incubar a 37 °C durante 3 min para facilitar el desprendimiento celular.
    3. Neutralice la tripsina añadiendo 8 ml de medio completo precalentado y pipeteando suavemente para dispersar las células.
    4. Transfiera 1 ml de la suspensión a 9 ml de medio completo fresco.
    5. Cuenta las células.
      NOTA: Las celdas se contaron utilizando un contador de celdas automatizado TC20 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No se utilizó azul de tripano ni otros agentes de tinción.
  4. Células de semillas en los cubreobjetos.
    1. Diluir las células a una concentración final de ~1 × 106 células/ml.
    2. Coloque los cubreobjetos de vidrio individuales de 18 mm en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
      NOTA: Los cubreobjetos de vidrio deben esterilizarse en autoclave antes de usarse para el cultivo celular.
    3. Agregue 2 ml del medio completo y 200 μl de la suspensión celular (~ 2 × 105 células / pocillo).
    4. Incube las células durante la noche para permitir la adhesión celular.
      NOTA: Para asegurarse de que las células estén en estado normal de crecimiento, verifique rutinariamente la morfología de las células y su estado de crecimiento (usando un microscopio), así como examine la posible contaminación por micoplasma (usando un kit de detección de micoplasma).

2. Lavado celular con solución de formiato de amonio (AF)

NOTA: Prepare una solución de FA nueva cada vez.

  1. Prepare el tampón de lavado AF. Pesar 0,45 g de formiato de amonio y disolver en 50 ml de agua de grado LC/MS. La concentración final de formiato de amonio es de 0,14 M (0,9% p/p).
    NOTA: Mantenga la solución helada (0-4 °C) hasta su uso.
  2. Agregue 2 ml de solución de AF fría a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
  3. Enjuague los cubreobjetos. Usando un par de pinzas estériles para levantar suavemente cada cubreobjetos que contenga células adherentes de su pocillo y luego colocarlo brevemente (durante 2-3 s) en un pocillo separado precargado con 2 ml de solución fría de formiato de amonio (AF) al 0,9%. Repita el proceso de enjuague.
    NOTA: Para evitar perturbar las células durante el paso de lavado, realice el enjuague celular muy suavemente.

3. Enfriamiento celular por nitrógeno líquido (LN2)

  1. Coloque cada cubreobjetos enjuagado con AF (celdas hacia arriba) en la placa de Petri dentro del recipiente de papel de aluminio.
    NOTA: Use guantes con clasificación criogénica, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Realice todo el manejo de LN2 en un área bien ventilada. El papel de aluminio se puede usar para doblar un recipiente para el enfriamiento de LN2 .
  2. Vierta lentamente 10-20 ml de nitrógeno líquido sobre los cubreobjetos, asegurando una cobertura completa.
  3. Incline inmediatamente la placa de Petri con unas pinzas para decantar el nitrógeno líquido restante.
    NOTA: Complete esta acción en unos segundos para evitar la formación de grandes cristales de hielo por la humedad residual del lavado.

4. Liofilización celular al vacío

  1. Liofilice inmediatamente después del enfriamiento de LN2 para evitar la descongelación.
    NOTA: Retire el rotor del SpeedVac para crear una plataforma plana que acomode una placa de Petri de 100 mm.
  2. Con guantes criogénicos y pinzas aislantes, coloque la placa de Petri que contiene los cubreobjetos refrigerados LN2 en la cámara del concentrador de vacío.
  3. Procese utilizando su configuración de vacío estándar y continúe durante 5-7 minutos hasta que el LN2 visible se haya evaporado y los cubreobjetos parezcan secos. Los cubreobjetos secos no deben contener LN2 residual ni cristales de hielo.

5. Almacenamiento de celdas en un congelador de -80 °C

  1. Envuelva el recipiente con una toalla de papel y transfiéralo a un congelador a -80 °C durante 48 h.
  2. Después del almacenamiento, transfiera inmediatamente los cubreobjetos que contienen la placa de Petri a un desecador a temperatura ambiente durante ~ 10 min. Asegúrese de que la escarcha condensada o el agua en los cubreobjetos desaparezcan por completo antes de sacarlos del desecador.
    NOTA: La transferencia rápida de los cubreobjetos al desecador minimiza la condensación; Incluso una humectación superficial menor puede disolver metabolitos secos.
  3. Después del lavado con FA, divida las muestras en dos grupos (Grupo 1 y Grupo 2). Aplique los siguientes protocolos de procesamiento.
    Grupo 1: Enfriamiento LN2 → liofilización → análisis SCMS (sin almacenamiento).
    Grupo 2: Enfriamiento con LN2 → liofilización → almacenamiento a -80 °C 48 h → análisis SCMS.
  4. Continúe con el análisis SCMS como se describe a continuación.
    NOTA: Se pueden preparar más grupos de celdas utilizando diferentes condiciones. El Grupo 1 y el Grupo 2 se utilizan para ilustrar los protocolos generales.

6. Fabricación de una sola sonda y configuración de SCMS

NOTA: La sonda única se fabrica de acuerdo con los procedimientos establecidos 21,24,60,61, y aquí solo se proporcionan protocolos breves.

  1. Tire de la aguja de cuarzo de doble orificio con un extractor láser y genere una punta de ~ 10 μm. Ensamble una sonda única insertando el capilar de sílice fundida y el emisor nano-ESI en la aguja de cuarzo de doble calibre. Asegure todos los componentes a un portaobjetos de vidrio con epoxi de fraguado rápido.
  2. Monte la sonda única en la platina XYZ. Coloque la sonda única en un manipulador XYZ motorizado colocado debajo de un microscopio digital.
  3. Acople la configuración a un espectrómetro de masas para el análisis SCMS.
  4. Utilice acetonitrilo (≥99,9%) que contenga 0,1 % de ácido fórmico como disolvente de extracción a un caudal de 150 nL/min suministrado por una bomba de jeringa.
  5. Establezca los parámetros de MS.
    Modo de iones positivos: m/z 200-1500, +2,9 kV, resolución de masa 120 k (a m/z 200).
    Modo de iones negativos: m/z 70-900, −2,1 kV, resolución de masa 120 k (a m/z 200).
    NOTA: Debido a que los iones negativos generalmente se detectan en el rango m/z más bajo que el de los iones positivos, se pueden usar diferentes rangos m/z para estos dos modos de iones. Los ajustes adicionales de MS incluyen un tiempo de inyección máximo de 100 ms, un microescaneo, control automático de ganancia (AGC) estándar, modo de escaneo completo (para análisis MS), disociación colisional de mayor energía (HCD) (para análisis MS/MS) con 10-35 de energía de colisión normalizada (NCE) y 320 °C para la temperatura del tubo de transferencia de iones. Se generó un cromatograma iónico total (TIC) en cada escaneo/punto de tiempo para monitorear la estabilidad de la señal y la detección de una sola célula.

7. Experimentos de SCMS de una sola sonda

  1. Coloque los dos cubreobjetos (Grupo 1 y Grupo 2) juntos en la etapa XYZ motorizada de la configuración SCMS de una sola sonda 21,24,61.
  2. Para minimizar los efectos por lotes, seleccione las células al azar bajo el microscopio.
  3. Adquirir espectros de masas en modo de iones positivos y negativos. Analice varias células (por ejemplo, ~ 30) por grupo con la misma sonda única, caudal de disolvente y voltaje de ionización.
    NOTA: Utilice la misma sonda única, caudal de disolvente y voltajes de ionización para cada experimento para garantizar la comparabilidad de los datos. Calibrar el Orbitrap diariamente antes de adquirirlo. Tanto los análisis de MS como los de MS/MS se pueden realizar a nivel de una sola célula. Recopile datos de MS para obtener valores precisos de m / z para estudios de perfiles de metabolitos y etiquetas tentativas en análisis no dirigidos. Realizar análisis MS/MS de iones seleccionados para la identificación molecular en análisis dirigidos. Los datos se adquirieron utilizando un software de adquisición e interpretación de datos compatible.

8. Análisis de datos

  1. Preprocese los datos SCMS sin procesar mediante un script de R personalizado. Los pasos de preprocesamiento incluyen la eliminación de ruido y fondo y la normalización de la intensidad de iones a TIC 11,12,23.
  2. Desisótopa los datos de SCMS usando el paquete de Python ms_deisotope.
  3. Realice la alineación de picos utilizando un script de Python interno60. Utilice un ancho de ubicación de 0,01 m/z para la discretización. Utilice una tolerancia de masa de 0,01 m/z o 5 ppm para la alineación de picos.
  4. Realice análisis estadísticos de datos con MetaboAnalyst 6.062. Realice una prueba t y genere un mapa de calor (para los niveles relativos de metabolitos). Seleccione Usar los 100 mejores en la prueba T/ANOVA para generar los 100 metabolitos principales, clasificados por valores p de menor a mayor, con una diferencia significativa (p < 0,05) de la comparación. Traza un mapa de calor usando estos 100 metabolitos principales.
  5. Busque valores precisos de m / z y espectros MS / MS en la base de datos de metabolomas humanos (HMDB63). Utilice una tolerancia de masa de 10 ppm en la búsqueda de bases de datos de MS.
    NOTA: Se pueden utilizar otras bases de datos, como LipidMaps64, para la búsqueda en bases de datos.

Resultados

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Este informe describe una metodología que integra el lavado celular, el enfriamiento celular rápido, el secado al vacío y el almacenamiento a -80 °C (Figura 1). Específicamente, este enfoque está diseñado para preservar el estado metabolómico de las células antes del análisis de SCMS. La eficacia de este protocolo se probó preparando células en dos condiciones diferentes: células recién templadas y secas (Grupo 1, que sirve como control), y células templadas, secas y almacenadas a -80 °C (Grupo 2). Cada grupo se analizó utilizando el método SCMS de sonda única en modos de iones positivos y negativos. Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) y la visualización de mapas de calor para evaluar las diferencias en los perfiles metabolómicos entre los grupos.

Los resultados de PCA en el modo de iones positivos (Figura 2A) revelaron que los Grupos 1 y 2 tenían perfiles de metabolitos generales similares. Los perfiles casi idénticos del Grupo 1 y el Grupo 2 demuestran que el almacenamiento a -80 °C durante 48 h no altera significativamente el metaboloma si las células se enfrían adecuadamente antes del secado. En el modo de iones negativos (Figura 2B), se observa un patrón comparable, aunque el Grupo 2 aparece ligeramente más distinto, potencialmente debido a las diferencias de ionización entre clases específicas de metabolitos, por ejemplo, las fosfatidilcolinas se detectan mejor en modo positivo, mientras que los ácidos grasos se ionizan de manera más eficiente en modo negativo60. A pesar de esta variación, la agrupación constante entre los grupos 1 y 2 en ambos modos respalda la conclusión de que el protocolo integrado de enfriamiento-secado-almacenamiento mantiene la integridad metabólica.

El análisis del mapa de calor validó aún más los hallazgos de PCA al representar abundancias relativas de los 100 metabolitos principales en dos grupos. Como se muestra en la Figura 3, los 100 metabolitos principales muestran patrones de abundancia altamente consistentes entre el Grupo 1 y el Grupo 2 en ambos modos iónicos. No se observan cambios importantes ni agrupamientos específicos de grupos, aunque las variaciones menores en algunos grupos de metabolitos pueden reflejar diferencias en la eficiencia de ionización o la estabilidad de los metabolitos. Estos resultados demuestran colectivamente que el flujo de trabajo de enfriamiento-secado-almacenamiento conserva los perfiles metabolómicos celulares con alta fidelidad, lo que lo hace muy adecuado para aplicaciones de SCMS ambientales.

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Figura 1: Flujo de trabajo general para el análisis de espectrometría de masas unicelular (SCMS) que investiga cómo la extinción de LN2 y el almacenamiento de 48 h a -80 °C afectan los perfiles de metabolitos en células individuales. (A) Las células se sembraron, incubaron y enjuagaron con una solución de formato de amonio (AF). (B) Se prepararon dos grupos de células: Grupo 1: las células se lavaron, enfriaron y liofilizaron para experimentos inmediatos de SCMS sin almacenamiento; Grupo 2: las células se lavaron, enfriaron, liofilizaron y almacenaron a -80 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Análisis de componentes principales (PCA) de datos de SCMS de células HCT-116 en grupos experimentales en (A) modo de iones positivos y (B) modo de iones negativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Mapas de calor que muestran los niveles relativos de los 100 metabolitos principales detectados en células individuales de HCT-116 preparadas en diversas condiciones, presentadas para (A) modo de iones positivos y (B) modo de iones negativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Un paso crítico en este protocolo es el enfriamiento inmediato de las células vivas utilizando LN2 después del lavado con AF, lo que reduce sustancialmente la actividad enzimática y detiene los procesos metabólicos en curso. Además, el lavado de las células con AF antes de apagar mejoró la intensidad de los iones y redujo los efectos de la matriz, lo que respalda su inclusión como un paso preparatorio para mejorar la sensibilidad del SCMS. En los estudios actuales, las células de diferentes grupos (es decir, Grupo 1 y Grupo 2) se cultivaron utilizando el mismo lote inicial para minimizar su variación biológica. Se eligió un tiempo de almacenamiento de 48 h porque las células con tiempo de crecimiento adicional (Grupo 1) aún pueden mantener densidades celulares adecuadas (por ejemplo, para evitar agregados celulares) para el análisis comparativo de SCMS con células almacenadas (Grupo 2). Sin embargo, se justifica la precaución cuando se confía en el almacenamiento en frío, incluso durante 48 h, ya que todavía se observaron cambios metabólicos significativos en las comparaciones entre muestras recién secas y almacenadas (Grupo 1 vs. Grupo 2). Aunque en estudios reales, las muestras de células y tejidos se almacenan comúnmente durante períodos más largos (por ejemplo, durante semanas y meses) en un congelador de -80 °C, se sugiere acortar el tiempo de almacenamiento para minimizar los cambios en los metabolitos.

Por lo tanto, la resolución de problemas debe centrarse en minimizar el tiempo entre el secado y el análisis SCMS, asegurando que las condiciones de descongelación eviten la condensación o la rehidratación parcial. El contenido de agua residual y la condensación de agua durante las transiciones de la muestra pueden rehidratar parcialmente las células y permitir reacciones enzimáticas y químicas como hidrólisis, oxidación y proteólisis que degradan los metabolitos65, lo que lleva a cambios artificiales en la composición de los metabolitos. Las muestras completamente secas detienen eficazmente estos procesos y preservan la integridad molecular66. Garantizar un entorno de desecación libre de humedad y una rápida transición a SCMS es clave para evitar estos escollos.

A pesar del éxito de este método en la preservación de los perfiles de metabolitos, siguen existiendo limitaciones. El método requiere acceso a un sistema de secado al vacío y un congelador a -80 °C, y no es completamente efectivo para el almacenamiento a largo plazo. Además, aunque el secado rápido a temperatura ambiente conserva los metabolitos temporalmente, no sustituye el enfriamiento de LN2 . Aún pueden ocurrir alteraciones relacionadas con el almacenamiento debido a la eliminación incompleta de agua y al riesgo de rehidratación durante el manejo de la muestra. Estas limitaciones resaltan la necesidad de refinar el método si se desea un almacenamiento más prolongado o un mayor rendimiento.

Los protocolos informados en este trabajo ofrecen un enfoque simplificado y eficaz para preservar el metaboloma unicelular para el EMCC ambiental. A diferencia de los métodos que requieren crioprotectores elaborados o congelación in situ, nuestro flujo de trabajo es fácilmente compatible con las técnicas de ionización ambiental existentes y permite plazos flexibles de muestreo y análisis. La integración del lavado, el enfriamiento, el secado y el almacenamiento a corto plazo de las células sin una pérdida sustancial de fidelidad metabolómica ofrece una solución práctica para los laboratorios que carecen de acceso bajo demanda a los espectrómetros de masas. Este enfoque tiene un gran potencial para avanzar en la investigación en biología de sistemas unicelulares, metabolismo del cáncer, heterogeneidad de respuesta a medicamentos y fenotipado metabólico de poblaciones de células raras. La amplia aplicabilidad de estos protocolos, particularmente para plataformas SCMS basadas en ionización ambiental, los convierte en una contribución importante al campo de las técnicas analíticas unicelulares. En estudios futuros, estos protocolos se pueden adaptar y refinar para acomodar una variedad más amplia de tipos de células. Con pasos adicionales de preparación de muestras (por ejemplo, aplicación de matriz), las células procesadas pueden analizarse potencialmente mediante otras técnicas de SCMS (por ejemplo, MALDI y SIMS), lo que ofrece una mayor resolución espacial y rendimiento para el análisis de un mayor número de células (por ejemplo, células altamente confluentes). Los resultados también sugieren que estos protocolos de enfriamiento-secado-almacenamiento pueden usarse potencialmente para preparar celdas para su envío (por ejemplo, en contenedores de hielo seco), lo que permite estudios colaborativos de SCMS en diferentes lugares.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (2305182), los Institutos Nacionales de Salud (1R01AI177469) y la Iniciativa Chan Zuckerberg. La Figura 1 se creó en BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
-80 &grados; Congelador CEppendorf Nuevo BrunswickU700Preparación de muestras
AcetontriloThermoFisher Scientific240744Configuración del experimento SCMS
Formiato de amonio ThermoFisher Scientific401152500Preparación de muestras
Cubreobjetos 18 mmVidrio de micro cubierta VMR48380046Cultivo celular
Microscopio estereoscópico digitalShenzhen D& F Co.Superojos T004Análisis
Tubería de cuarzo de doble orificio, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QFabricación de una sola sonda
Resina epoxiDevconN.º de pieza 20945Fabricación de una sola sonda
Ácido fórmicoLa ciencia de Ward 470301-120 500 mlConfiguración del experimento SCMS
Capilar de sílice fundida, ID: 40 µ m, OD: 100 µ mTecnologías PolymicroTSP040105Fabricación de una sola sonda
Capilar de sílice fundida, ID: 50 µ m, OD: 150 µ mTecnologías Polymicro1068150015Configuración del experimento SCMS
Cubreobjetos de cristal, 18 mmVWR 48380046Cultivo celular
HyClone Suero sintético (FBS)HycloneSH3006603Cultivo celular
Incubadora HeraCell (Heraeus)Cultivo celular
Extractor láserInstrumento Sutter Co.Modelo P-2000Fabricación de una sola sonda
Lámpara LED UVEquipo dental Foshan Liang YaLY-C240Fabricación de una sola sonda
El 5A de McCoy Gibco 2537128Cultivo celular
MicrouniónIDEX Salud & Ciencia LLCM-539Configuración del experimento SCMS
Interfaz FAIMS pro modificada Termo Fisher 98100-20046Análisis
Kit de detección de micoplasma MycoAlert PLUSLonzaLT07-703Cultivo celular
Placa óptica Thorlabs Inc., NewtonAnálisis
Agua de grado Optima LC/MS (Fisher Chemical, EE. UU.)ThermoFisher ScientificW6500Preparación de muestras
Espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher ScientificConfiguración del experimento SCMS
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122Cultivo celular
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)VWR0780-50LCultivo celular
Concentrador SpeedVac (Savant)ThermoFisher Scientific SPD111 VPreparación de muestras
Bomba de jeringa (SKE10)Chemyx Inc.80561Configuración del experimento SCMS
Jeringa, 250 µ LHamilton1725LTN250ULConfiguración del experimento SCMS
Contador de células automatizado TC20Laboratorios Bio-Rad 1450102EDURecuento de células
Placa de cultivo de tejidos, 100 mmFisher científico FB012924Cultivo celular
Tripsina-EDTAThermoFisher Scientific25200-072Cultivo celular
Microscopio digital USB (Zoom "Scorpio" 500)Chinavasion, Mayorista Ltd.Análisis
Resina de curado UVDental principalN.º de artículo 006.030Fabricación de una sola sonda
Software XcaliburThermoFisher Scientific
Etapa XYZ (CONEX- MFACC)Corporación de NewportAnálisis

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

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