Inducción de precisión y distinción de los reflejos de tos y estornudo en ratones

Resumen

Este estudio estableció modelos de tos y estornudos en ratones mediante la aplicación de estímulos específicos a la tráquea y la cavidad nasal, y desarrolló un método basado en audio para distinguir entre la tos y los estornudos de ratones mediante el análisis de las diferencias en sus señales acústicas.

Resumen

La tos y los estornudos, como reflejos respiratorios defensivos vitales, han visto la investigación de sus mecanismos limitados por la estimulación inespecífica inherente a los modelos tradicionales. Los métodos existentes, como la nebulización con capsaicina o ácido cítrico, pueden activar simultáneamente la tos (mediada por fibras C traqueales) y el estornudo (mediado por los nervios trigéminos nasales), lo que lleva a observaciones conductuales confusas. Aunque estudios anteriores han intentado distinguir la tos y los estornudos mediante el análisis de patrones respiratorios o firmas acústicas, estos estudios carecen de modelos que puedan estimular específicamente la tráquea y la cavidad nasal. Aquí, desarrollamos un modelo murino que emplea la estimulación específica del sitio de la tráquea (para inducir la tos) y la cavidad nasal (para desencadenar el estornudo). Utilizando grabaciones multimodales sincronizadas, pletismografía de cuerpo entero (WBP), micrófonos ultrasónicos de banda ancha (0-250 kHz) y videografía de alta velocidad (160 fps), cuantificamos distintas firmas fisiológicas de tos y estornudos. Nuestros hallazgos revelaron que tanto la tos como los estornudos exhiben patrones respiratorios de pico simple y doble, con diferencias significativas en la composición de sus espectros de audiofrecuencia. Al construir un sistema de coordenadas basado en características de audio, pudimos distinguir de manera efectiva la tos y los estornudos, mapeándolos en diferentes cuadrantes del eje de coordenadas. Este estudio, a través de la estimulación anatómicamente específica y el análisis de características acústicas, estableció un modelo de ratón capaz de distinguir cuantitativamente entre tos y estornudos, proporcionando un método experimental de alta precisión para la investigación de los reflejos de defensa de las vías respiratorias y el desarrollo terapéutico dirigido.

Introducción

La tos y los estornudos son reflejos defensivos cruciales para que el cuerpo elimine sustancias extrañas del tracto respiratorio, y las anomalías en sus vías neuronales relacionadas a menudo desencadenan enfermedades crónicas, como tos crónica y rinitis. Ambos reflejos implican una fase inspiratoria, una fase compresiva y una fase espiratoria ^1,2. El reflejo de la tos está mediado principalmente por neuronas sensoriales de las vías respiratorias inervadas por el nervio vago ^3,4,5. Las neuronas vagas reciben estímulos mecánicos, químicos o eléctricos de las vías respiratorias y transmiten las señales al núcleo tractus solitarius (NTS) en el bulbo raquídeo⁶. El NTS integra esta información y posteriormente la proyecta a los centros respiratorios en la médula y la protuberancia⁷. Estos centros finalmente coordinan grupos de músculos respiratorios relevantes (como el diafragma, los músculos intercostales y los músculos laríngeos) para ejecutar la acción de la tos, expulsando irritantes y moco potencialmente dañinos del tracto respiratorio a través de la cavidad oral ^8,9,10. El reflejo del estornudo está mediado principalmente por neuronas sensoriales nasales dentro del ganglio del trigémino^11,12. Sus estímulos mecánicos o químicos se transmiten al núcleo espinal del trigémino (SP5), que luego transmite la información a los centros respiratorios 13,14,15,16. Estos centros regulan los músculos relevantes (como los músculos respiratorios, los músculos palatinos y los músculos faciales) para iniciar un estornudo¹⁷. La potente ráfaga espiratoria del estornudo obliga a la mayor parte del aire a salir por la nariz para expulsar los irritantes ^9,18. La investigación sobre la tos y el estornudo no solo ayuda a dilucidar los mecanismos neuronales de la defensa respiratoria, sino que también proporciona objetivos terapéuticos para la tos crónica y la rinitis. Con este fin, el establecimiento de un modelo animal robusto y confiable es de suma importancia.

En los últimos años, los ratones se han convertido en un organismo modelo fundamental para estudiar las vías neuronales de la tos y el estornudo 19,20,21. La metodología actual predominante todavía implica inducir estos comportamientos reflejos a través de la inhalación de compuestos estimulantes en aerosol ^8,20,22. Una limitación significativa de este enfoque de inhalación es que los estímulos actúan simultáneamente sobre la cavidad nasal y la tráquea, activando de forma no específica los distintos sistemas aferentes sensoriales que median el estornudo (a través de la vía del trigémino) y la tos (a través de la vía vagal). Esto plantea un desafío sustancial para la diferenciación precisa del tipo de comportamiento provocado en los experimentos. Esta discrepancia es evidente en la literatura: algunos estudios definen los reflejos respiratorios inducidos por capsaicina en ratones como estornudos²¹, mientras que otros informan que estos reflejos abarcan componentes de tos y estornudos ^8,22.

Para abordar este desafío, se han desarrollado metodologías avanzadas, incluido el análisis de patrones y trayectorias respiratorias para clasificar distintos comportamientos reflejos⁸. Otro estudio demuestra que la tos y los estornudos presentan marcadas diferencias en las características temporales y espectrales, como la duración, la modulación de frecuencia²². Su trabajo destacó que la tos exhibe una concentración de energía en rangos de frecuencia máxima más bajos (20-80 kHz), mientras que los estornudos muestran componentes que se extienden más allá de 90 kHz²². Estas divergencias acústicas ofrecen un marco novedoso y no invasivo para la discriminación del comportamiento, complementando los análisis tradicionales de formas de onda respiratorias. A pesar de estas innovaciones, persiste una brecha crítica: los modelos existentes carecen de especificidad anatómica en la administración de estímulos, lo que a menudo confunde las vías traqueales y nasales. Esta limitación muestra que necesitamos mejores formas de apuntar y estudiar los reflejos respiratorios.

La investigación sobre los mecanismos subyacentes a la tos y el estornudo inducidos por la estimulación mecánica y química de las vías respiratorias se ha realizado ampliamente en modelos animales grandes (por ejemplo, gatos)¹⁷. Sin embargo, en modelos de animales pequeños (por ejemplo, conejillos de indias, ratas y ratones), las limitaciones técnicas generalmente han requerido la dependencia de compuestos en aerosol (como la capsaicina o el ácido cítrico) para lograr la estimulación química.

Este protocolo propone un método novedoso para inducir comportamientos similares a la tos y al estornudo en ratones y establece un nuevo conjunto de métodos para cuantificar y caracterizar estos reflejos respiratorios. Este enfoque establece una estrategia para diferenciar los comportamientos similares a la tos y al estornudo en ratones mediante la identificación de vocalizaciones características y el análisis de sus características espectrales e intensidad acústica. Esta novedosa metodología tiene el potencial de estandarizar la cuantificación de los reflejos respiratorios murinos, mejorar la reproducibilidad experimental y profundizar la comprensión mecanicista de la neurofisiología de la tos y el estornudo.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas del Protocolo de Uso y Cuidado de Animales del Laboratorio de Guangzhou (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10). En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6 hembras y machos libres de patógenos específicos, de 8 a 10 semanas de edad.

1. Preparación experimental

1. Preparación de animales de experimentación
   1. Aloje a los ratones en jaulas con libre acceso a alimentos y agua, y manténgalos a 22 ± 1 ° C bajo un ciclo estándar de luz / oscuridad de 12 h.
2. Preparación de la solución de capsaicina
   1. Disuelva 30,5 mg de capsaicina en polvo en PBS que contenga 10% de etanol y 10% de Tween-80 para preparar una solución madre de 10 mM.
   2. Diluir la solución madre 1:100 en solución salina fisiológica para preparar una solución de trabajo de 100 μM.
3. Preparación de tribromoetanol (Avertin)
   1. Pesar 0,5 g de tribromoetanol en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Agregue 1 ml de 2-metil-2-butanol.
   2. Incubar a 55 °C con agitación (400-600 rpm) en la oscuridad hasta que se disuelva por completo (~20 min).
   3. Coloque 40 ml de solución salina fisiológica en un vaso de precipitados. Mientras revuelve, agregue la solución de tribromoetanol disuelta gota a gota. Continúe revolviendo hasta que los cristales disueltos se disipen por completo (~ 40 min).
   4. Ajuste el pH a 7.0-7.3 usando NaOH.

2. Establecimiento y registro del modelo de comportamiento similar a la tos

1. Preparación de la cánula de implantación
   1. Cortar una aguja de 28 G (DI: 0,19 mm, OD: 0,35 mm) en una cánula de ~5 mm. Alise ambos extremos con papel abrasivo con fórceps. Fije un extremo al tubo de silicona (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm). Conéctelo a una jeringa de 1 ml y enjuague la cánula con agua para verificar la permeabilidad.
   2. Doblar la cánula a 90° con una relación de brazo de 2:3. Inserte el brazo más largo en el tubo de silicona (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm, 5 cm de longitud; Figura 1A). Designe el extremo doblado para la implantación traqueal. Extienda el tubo de silicona desde la tráquea hasta el cráneo para su fijación (Figura 1B).
2. Preparación de la configuración del equipo de control
   1. Prepare el sistema de pletismografía de cuerpo entero (WBP), registrador ultrasónico, cámara de alta velocidad, bomba de microinyección.
3. Asignación de grupos de ratones
   1. Asigne aleatoriamente ratones a tres grupos (n = 6 / grupo): i) Grupo de control: mantenga el estado normal sin tratar. ii) Grupo simulado: Implante la cánula traqueal sin estimulación. iii) Grupo de estimulación: Implantar la cánula traqueal y administrar capsaicina para inducir la tos.
4. Procedimiento quirúrgico
   1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol (125-250 mg / kg) y confirmar la anestesia completa por la ausencia de respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
   2. Asegure el ratón anestesiado en decúbito supino. Afeitarse el vello craneal y cervical. Desinfectar con yodóforo. Con unas tijeras quirúrgicas, recorte una sección circular del cuero cabelludo de aproximadamente 5 mm de diámetro para exponer el cráneo.
   3. Bajo microscopio: Incidir la piel del cuello uterino aproximadamente 1 cm. Diseccionar sin rodeos los tejidos y músculos para exponer la tráquea. Punción de tejido blando entre los cartílagos cricoides y traqueal con una aguja de 32 G. Cree una abertura traqueal mínima con tijeras oftálmicas.
      NOTA: Mantenga el tamaño de la abertura lo suficientemente grande para el diámetro de la cánula para evitar daños en los tejidos.
   4. Inserte una cánula de metal (revestida de silicona) ~ 1 mm en la luz traqueal. Asegure la unión cánula-tráquea con sutura 7-0.
      NOTA: Limite la profundidad de inserción a 1 mm para evitar problemas respiratorios.
   5. Túnel subcutáneo sin rodeos desde el cuello hasta el cráneo. Dirige el tubo de silicona al cráneo y fíjalo con cemento dental.
   6. Sutura la incisión cervical. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica hasta que esté consciente. Alojar en jaula durante 5 días.
   7. Enjuague diariamente la cánula/tubo traqueal con una jeringa de aire de 1 ml.
      NOTA: Omita el enrojecimiento dentro de las 24 horas anteriores a la inducción de la tos.
5. Registro de tos
   1. Coloque la sonda ultrasónica con un anillo de sellado compatible con el puerto. Inserte la sonda en el puerto de la cámara WBP para garantizar un contacto hermético.
   2. Conecte la cámara WBP, el sensor de flujo y el flujo de polarización. Calibrar a través del software.
   3. Conecte un tubo de silicona fijado al cráneo a un tubo de extensión de 30 cm. Coloque el ratón en la cámara WBP. Extienda el tubo a través del puerto superior. Sella el puerto con plastilina. Verifique la hermeticidad de la cámara confirmando que los picos de forma de onda respiratoria caen dentro de 4 ± 2.
   4. Cargue la jeringa de 1 ml con 5 ml de solución de capsaicina. Elimina las burbujas de aire. Conéctelo al tubo de extensión. Monte la jeringa en la bomba de microinyección y ajuste el flujo a 10 μL ^min-1.
      NOTA: El flujo excesivo puede llevar capsaicina a la cavidad nasal.
   5. Coloque una cámara de alta velocidad frente a la cámara. Ajusta la distancia y el enfoque. Establezca la frecuencia de muestreo en 160 fps (máximo).
   6. Inicie simultáneamente el WBP, el ultrasonido y el software de la cámara; Activa la bomba para infundir la capsaicina. Registre los recuentos de tos durante 10 minutos.

3. Establecimiento y registro del modelo de comportamiento similar al estornudo

1. Preparación de equipos experimentales
   1. Prepare un tubo de PE estéril (ID: 0,5 mm, OD: 1 mm) para su fijación como cánula de estimulación en el hueso nasal murino.
   2. Prepare un filamento de nailon esterilizado de 0,25 mm de diámetro para la estimulación nasal transcánula. Basándose en el método de calibración de Vonfrey, cuando el filamento de 5 cm de largo se presiona verticalmente sobre una balanza hasta que se dobla a aproximadamente 45°, la fuerza medida es de 0,6 g.
2. Configuración del equipo de grabación
   1. Listo un sistema de pletismografía de cuerpo entero (WBP), una grabadora de ultrasonido y una cámara de alta velocidad.
3. Asignación de grupos de ratones
   1. Asigne aleatoriamente ratones a tres grupos (n = 6 / grupo): i) Grupo de control: mantenga el estado inicial no tratado. ii) Grupo simulado: Cánula nasal fija sin estimulación. iii) Grupo de estimulación: Fijar cánula nasal + provocar estornudos mediante estimulación con filamentos.
4. Procedimiento quirúrgico
   1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol (125-250 mg / kg) y confirmar la anestesia completa por la ausencia de respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
   2. Afeitarse el vello del cráneo craneal y el puente nasal.
   3. Asegure el mouse en un marco estereotáxico. Desinfectar con yodóforo. Hacer una incisión en la piel sobre el cráneo y el hueso nasal. Exponga el hueso nasal.
   4. Cree un orificio de 0,5 mm en la unión entre el hueso nasal y el proceso lateral del cartílago septal nasal con un microtaladro. Exponer la mucosa nasal.
      NOTA: Limite el tamaño del orificio a 0,5 mm para evitar daños en los tejidos.
   5. Levante suavemente la mucosa nasal con una aguja de 32 G. Exponga la cavidad nasal.
   6. Monte el tubo de PE en el brazo estereotáxico. Coloque la punta del tubo al ras con el orificio de la rebaba. Asegure el tubo al hueso nasal con cemento dental.
   7. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica hasta que recupere la conciencia.
5. Grabación de estornudos
   1. Conecte la cámara WBP, el sensor de flujo y el flujo de polarización según el manual. Calibrar usando software.
   2. Coloque la sonda ultrasónica con una junta adaptada al puerto. Inserte la sonda en la cámara. Verifique un sello hermético.
   3. Transfiera el ratón a la cámara WBP. Extienda el tubo de PE a través del puerto superior. Sella el puerto con plastilina alrededor del tubo. Verifique la hermeticidad de la cámara confirmando que los picos de forma de onda respiratoria caen dentro de 4 ± 2.
   4. Coloque una cámara de alta velocidad frente a la cámara. Ajusta la distancia y el enfoque. Establezca la frecuencia de muestreo en 160 fps (máximo).
   5. Avance un filamento de nailon de 0,25 mm de diámetro a través de un tubo blando hacia la cavidad nasal a profundidades de 0-3 mm. La parte del filamento que sobresale del tubo de mano mide 5 cm de largo. Durante la estimulación, presione este extremo libre hasta que se doble a 45 °, administrando ~ 0,6 g de fuerza a la mucosa nasal durante 1 s, repita una vez cada 30 s. Registre las respuestas de estornudos durante 10 minutos.

4. Tos y estornudos inducidos por capsaicina en ratones

1. Asignación grupal
   1. Divida los ratones en grupos de cirugía simulada y cirugía (n = 5/grupo). Grupo simulado: Exponer los nervios etmoidales e infraorbitarios anteriores bilaterales. Grupo de cirugía: Transecto bilateral de los nervios etmoidal anterior e infraorbitario.
2. Nebulización ultrasónica
   1. Prepare la cámara de comportamiento (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Coloque la grabadora ultrasónica y la cámara para un monitoreo óptimo.
   3. Cargue el nebulizador con 100 μM de solución de capsaicina. Administre pulsos de aerosol de 30 s cada 2 minutos durante 10 minutos.
   4. Registre comportamientos continuamente usando la grabadora ultrasónica y la cámara.

5. Proceso de análisis de datos

1. Análisis de trazado respiratorio de pletismografía de cuerpo entero (WBP)
   1. Importe los archivos de texto grabados WBP en el software Spike2 y sincronícelos con las señales de audio.
   2. Analice las señales de audio correspondientes a los patrones de respiración de pico único y pico doble, y registre la duración de la fase de compresión para cada patrón.
   3. Seleccione el punto más bajo de la fase espiratoria como punto medio y tome los datos de medio segundo antes y después para calcular el valor promedio.
2. Análisis de forma de onda de audio
   1. Importe archivos de audio al software Spike2, seleccione audio individual para toser o estornudar y exportarlos como formato TXT (con una frecuencia de muestreo establecida en 100 kHz y una duración de 0,1 s).
   2. Importe los archivos TXT a Excel y conviértalos en los valores absolutos de las señales de audio.
   3. Utilice el software GraphPad Prism para suavizar los valores absolutos de las formas de onda de audio utilizando una spline de suavizado con 50 puntos.
      NOTA: Para garantizar que la curva se aproxime mucho a los datos originales y evitar puntos de inflexión excesivos, es óptimo seleccionar una spline de suavizado de 50 puntos; Las curvas generadas con valores superiores a 50 puntos muestran una desviación insignificante de la curva de 50 parámetros.
   4. Basándose en las formas de onda de audio suavizadas, calcule la pendiente k desde el punto inicial hasta el punto más alto.
3. Análisis espectral de audio
   1. Importar archivos de audio al software Spike2.
   2. Seleccione los puntos de tiempo de inicio y finalización del audio individual de tos o estornudo para el análisis espectral y exporte los resultados del análisis espectral.
   3. Utilice GraphPad Prism para generar curvas de análisis espectral y calcular el área bajo las curvas.
   4. Calcule la relación del área bajo la curva entre las bandas de frecuencia de 30-60 kHz y 0-30 kHz para distinguir entre tos y estornudos.
4. Cálculo del índice compuesto
   1. Realice una transformación logarítmica natural (ln) en la pendiente k y la relación del área bajo la curva de análisis espectral para mejorar la discriminabilidad de los datos.

6. Análisis estadístico

1. Los datos se presentan como la media ± SEM. Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se realizaron mediante la prueba t y el ANOVA de dos vías, con un P < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis se realizaron con el software GraphPad Prism.

Resultados

En este estudio, realizamos un análisis detallado de los patrones respiratorios de los comportamientos de tos y estornudo de los ratones utilizando pletismografía de cuerpo entero (WBP) y técnicas de registro de ultrasonido. Los resultados mostraron que los ratones sometidos a cirugía traqueal o nasal demuestran una respuesta comparable a la tos y el estornudo a los controles vírgenes. Sin embargo, la capsaicina (química) y la estimulación mecánica evocan eficazmente los reflejos de tos y estornudo en estos animales preparados quirúrgicamente (Figura 2A, B). Los resultados de WBP revelaron que ambos comportamientos exhibieron patrones de pico simple y doble, y sus señales de sonido aparecieron durante la etapa expulsiva del patrón respiratorio (Figura 3A, C, E, G). Un análisis ecográfico adicional reveló perfiles acústicos distintos: los sonidos de tos exhibieron un inicio abrupto con una intensidad máxima que ocurría instantáneamente, predominantemente dentro del rango de frecuencia de 0 a 30 kHz, y una duración más corta (Figura 3B, D; Vídeo de apoyo S1). Los sonidos de estornudos demostraron una acumulación progresiva de intensidad hasta la amplitud máxima, la distribución de frecuencia de banda ancha (0-80 kHz) y la duración prolongada (Figura 3F, H; Vídeo de apoyo S2). El análisis estadístico reveló que la fase de compresión promedio del comportamiento de tos de un solo pico fue de 32,39 ± 0,73 ms, significativamente más corta que la del comportamiento de tos de doble pico a los 53,17 ± 2,29 ms (Figura 4A, B, C). La fase de compresión promedio del comportamiento de estornudo de un solo pico fue de 44,03 ± 1,84 ms, inferior al valor promedio del comportamiento de tos de doble pico, mientras que la fase de compresión promedio del comportamiento de estornudo de doble pico fue de 74,24 ± 1,29 ms, significativamente más larga que la del comportamiento de estornudo de un solo pico (Figura 4E, F, G). Además, la proporción de ocurrencia del patrón de un solo pico en el comportamiento de tos fue del 77,55 ± el 2,10% (Figura 4D), mientras que en el comportamiento de estornudos, el patrón de un solo pico representó solo el 32,42 ± el 5,88%, y el patrón de doble pico representó el 67,58 ± el 5,88% (Figura 4H). El análisis estadístico de la duración del audio indicó diferencias significativas entre los tiempos de audio de tos y estornudos, pero hubo una superposición considerable entre los dos (Figura 5A). A través del análisis espectral del audio de ultrasonido de tos y estornudos, encontramos que el espectro de frecuencia del audio de la tos se concentró principalmente en el rango de 0-30 kHz, mientras que el audio de los estornudos tuvo una mayor proporción en el rango de 0-60 kHz (Figura 5B). Aunque el audio de la tos también tenía frecuencias en el rango de 30-120 kHz, la proporción de frecuencias bajas siempre fue mayor que la de frecuencias altas. Por lo tanto, utilizamos la pendiente de la intensidad del sonido desde el punto de partida hasta el valor máximo (Figura 5C) como coordenada vertical y la relación de energía de 30-60 kHz a 0-30 kHz (Figura 5D) como coordenada horizontal para establecer un sistema de coordenadas, que pudiera distinguir eficazmente el audio de tos y estornudos. Además, no hubo diferencias significativas entre la tos de uno y dos picos, así como los estornudos de uno y dos picos en este sistema de coordenadas (Figura 5E).

A continuación, empleamos los métodos de clasificación antes mencionados para categorizar los comportamientos de tos y estornudos inducidos por la nebulización de capsaicina en ratones. Encontramos que los comportamientos de tos y estornudos inducidos por la nebulización de la capsaicina se superponen con los evocados por la estimulación específica en las mismas posiciones de coordenadas (Figura 5F, G). Después de la transección de los nervios aferentes sensoriales nasales (nervios etmoidales e infraorbitarios anteriores), la nebulización con capsaicina redujo significativamente las señales acústicas asociadas a los estornudos, mientras que los perfiles de audio relacionados con la tos no se vieron afectados (Figura 5H, I).

Figura 1: Diagrama esquemático de la operación en el modelo de tráquea estimulada y cavidad nasal. (A) Representación esquemática del catéter implantado en la tráquea. (B) Los planos frontal (izquierdo) y coronal (derecho) muestran la posición del catéter implantado en la tráquea del ratón. (C) El plano sagital muestra la posición de implantación del catéter en la cavidad nasal y la posición de la estimulación de la fibra de filamento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de comportamientos similares a la tos y los estornudos provocados por la estimulación específica del sitio. (A) Cuantificación de estornudos del grupo de control normal, grupo simulado y grupo de estimulación nasal mecánica. El grupo simulado exhibió una frecuencia de estornudos comparable a la de los controles. La estimulación nasal mecánica evocó un aumento significativo en los eventos de estornudos. (B) Cuantificación de tos del grupo de control normal, el grupo simulado y el grupo de desafío traqueal con capsaicina. El grupo simulado no mostró diferencias significativas en la frecuencia de tos en comparación con los controles. La estimulación traqueal con capsaicina aumentó significativamente el recuento de tos. Los datos se representan como la media ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los rastros respiratorios y el oscilograma sonoro de la tos y los estornudos. (A) Imágenes representativas que muestran el rastro respiratorio máximo único y la grabación de audio durante una tos inducida por capsaicina. (B) El oscilograma de sonido (arriba) y el espectrograma (abajo) de la grabación de audio de la tos en A. (C) Imágenes representativas que muestran el rastro respiratorio de doble pico y la grabación de audio durante una tos inducida por capsaicina. (D) El oscilograma de sonido (arriba) y el espectrograma (abajo) de la grabación de audio de la tos en C. (E) Imágenes representativas que muestran el rastro respiratorio máximo único y la grabación de audio durante un estornudo inducido por estimulación mecánica. (F) El oscilograma de sonido (arriba) y el espectrograma (abajo) de la grabación de audio del estornudo en E. (G) Imágenes representativas que muestran el rastro respiratorio de doble pico y la grabación de audio durante un estornudo inducido por estimulación mecánica. (H) El oscilograma de sonido (arriba) y el espectrograma (abajo) de la grabación de audio del estornudo en G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los picos simples y dobles de los rastros respiratorios de comportamientos similares a la tos y al estornudo. (A) Rastros respiratorios promedio (rojo) e individual (gris) y promedio (rojo) de comportamientos similares a la tos con un solo pico respiratorio (n = 52). (B) Trazas respiratorias promedio (rojo) e individual (gris) y promedio (rojo) de comportamientos similares a la tos con picos respiratorios dobles (n = 29). (C) Duración de las fases compresivas de picos respiratorios simples y dobles para la tos inducida por capsaicina (pico único n = 52, picos dobles n = 29). (D) La proporción promedio de trazas de pico respiratorio simple y doble en tos (n = 6 ratones). (E) Rastros respiratorios promedio (rojo) e individual (gris) y promedio (rojo) de comportamientos similares a estornudos con picos respiratorios únicos (n = 40). (F) Rastros respiratorios promedio (rojo) e individual (gris) y promedio (rojo) de comportamientos similares a estornudos con picos respiratorios dobles (n = 74). (G) Duración de las fases compresivas de picos respiratorios simples y dobles para estornudos inducidos por estimulación mecánica (pico único n = 40, picos dobles n = 74). (H) La proporción promedio de trazas de pico respiratorio simple y doble en el estornudo (n = 6 ratones). Los datos se representan como la media ± SEM, ****P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La clasificación de frecuencia y forma de onda del oscilograma de sonido de tos y estornudos. (A) Cuantificación de la duración del sonograma de tos y estornudos. (B) El análisis de espectrograma promedio de los estornudos inducidos por estimulación mecánica (n = 69, negro) y la tos inducida por capsaicina (n = 140, rojo). (C) Un diagrama esquemático representativo para calcular la pendiente de un oscilograma de sonido. El análisis comparativo de la spline de suavizado revela que a 25 puntos, el suavizado excesivo oscurece las características de datos originales, mientras que los valores superiores a 50 puntos (por ejemplo, 75 puntos) muestran una superposición sustancial con la curva de 50 spline pero introducen puntos de inflexión adicionales. (D) Un diagrama esquemático representativo del cálculo de la relación de área, utilizando los resultados del análisis espectral para calcular el área bajo diferentes curvas de frecuencia en GraphPad Prism. La relación de área es igual al área bajo la curva de 30-60 kHz y el área bajo la curva de 0-30 kHz. (E) La clasificación de frecuencia y forma de onda de los estornudos inducidos por estimulación mecánica y el oscilograma de sonido de tos inducido por capsaicina, con el eje y representando el exponente de la pendiente de la forma de onda de sonido desde la línea de base hasta el pico, y el eje x representando el exponente de la relación de ondas sonoras entre 30-60 kHz y 0-30 kHz. (F) El análisis de espectrograma promedio de los estornudos inducidos por la nebulización de la capsaicina (n = 36, negro) y la tos inducida por la nebulización de la capsaicina (n = 42, rojo). (G) La clasificación de frecuencia y forma de onda de los estornudos inducidos por nebulización de capsaicina (n = 36, negro) y la tos inducida por nebulización de capsaicina (n = 42, rojo) oscilograma de sonido, con el eje y representando el exponente de la pendiente de la forma de onda de sonido desde el inicio hasta el pico, y el eje x representando el exponente de la relación de ondas de sonido entre 30-60 kHz y 0-30 kHz. (H) Datos estadísticos sobre el reflejo de estornudo inducido por capsaicina en grupos con nervios etmoidales e infraorbitarios anteriores seccionados versus el grupo de cirugía simulada. (I) Datos estadísticos sobre el reflejo de tos inducido por capsaicina en grupos con nervios etmoidales e infraorbitarios anteriores seccionados versus el grupo de cirugía simulada. Los datos se representan como la media ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video complementario 1: Video de comportamiento similar a la tos sincronizado con su espectrograma de audio, mostrado a velocidad normal y 0.1x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 2: Video de comportamiento similar a un estornudo sincronizado con su espectrograma de audio, mostrado a velocidad normal y 0.1x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, inducimos con éxito comportamientos de tos y estornudos en ratones estimulando específicamente la tráquea con capsaicina y estimulando mecánicamente la cavidad nasal ^8,17. Recopilamos sincrónicamente datos de pletismografía de cuerpo entero (WBP), grabaciones de audio y video, y encontramos que las relaciones de frecuencia de audio y las pendientes de intensidad del sonido podrían diferenciar efectivamente entre los comportamientos de tos y estornudo en ratones ^8,23.

Dada la naturaleza delicada de los procedimientos quirúrgicos involucrados, se debe prestar especial atención a varios pasos críticos. Primero, durante la cirugía traqueal, la cánula intratraqueal implantada debe ser lo más delgada posible e insertarse a poca profundidad para evitar la obstrucción de las vías respiratorias, lo que podría provocar dificultad respiratoria o incluso mortalidad. Además, como las secreciones dentro de la tráquea pueden bloquear fácilmente el catéter, la limpieza diaria del catéter es crucial. Al administrar capsaicina, la velocidad de inyección debe controlarse cuidadosamente para evitar el flujo retrógrado hacia la cavidad nasal, lo que podría desencadenar reflejos de estornudos. En segundo lugar, durante la cirugía de implantación de hueso nasal, el tamaño del orificio perforado es crucial para evitar daños excesivos al ratón. El catéter debe colocarse al nivel del hueso nasal sin insertarlo demasiado profundamente, para evitar una irritación excesiva de la cavidad nasal o la interferencia con la respiración normal. En última instancia, la implementación de procedimientos quirúrgicos precisos es esencial para el experimento. Al minimizar las lesiones del ratón, no solo se puede acelerar la recuperación, sino que también se pueden registrar respuestas conductuales experimentales más precisas. Estos métodos quirúrgicos ayudan a mejorar la fiabilidad del modelo y garantizan datos de alta calidad, proporcionando así una base experimental sólida para estudiar comportamientos reflejos respiratorios como la tos y los estornudos.

Tradicionalmente, el modelado del comportamiento de la tos se ha basado en la nebulización de compuestos como la capsaicina y el ácido cítrico para inducir la tos^24,25. Sin embargo, este enfoque conlleva limitaciones notables: no solo provoca tos, sino que también puede desencadenar simultáneamente reflejos de estornudo ^8,22. Además, se ha observado una variabilidad interindividual significativa en la sensibilidad a los estímulos en aerosol²⁶, y un subconjunto de ratones no mostró ninguna respuesta a la tos. Por el contrario, el novedoso paradigma de estimulación mecánica desarrollado en este estudio logra comportamientos estables similares a la tos al tiempo que permite una personalización flexible de los estímulos a través de actuadores intercambiables. De manera similar, los modelos convencionales de estornudos que emplean agentes en aerosol sufren de una especificidad conductual deficiente, ya que con frecuencia evocan tos colateral²², lo que complica la diferenciación entre estos reflejos respiratorios distintos.

Estudios previos han establecido modelos de tos y estornudo de ratón utilizando capsaicina, y diferenciado los dos en función de las características de los patrones respiratorios (picos simples o dobles) registrados por pletismografía de cuerpo entero (WBP)⁸. Los datos de nuestra investigación indican que en el comportamiento de tos inducida, el patrón de respiración de un solo pico representó el 77,55 ± el 2,10% de las ocurrencias, mientras que en el comportamiento de estornudos, el patrón de un solo pico representó el 32,42 ± el 5,88%. Estos resultados confirman que el método de clasificación basado en los patrones respiratorios WBP es efectivo en la mayoría de los casos, pero presenta limitaciones y no permite una diferenciación perfecta entre los dos comportamientos. Además, algunos estudios han intentado distinguir la tos de los estornudos utilizando las características de duración y frecuencia de las señales de audio²². Aunque la duración promedio de las señales de audio para el comportamiento de estornudo suele ser más larga que para la tos, existe una superposición sustancial entre las duraciones de los eventos individuales. Por lo tanto, confiar en la duración del audio como indicador distintivo puede carecer de suficiente discriminación. Además, el análisis espectral de la tos y los estornudos no ha revelado un límite claro: la tos leve solo puede manifestarse como señales de baja frecuencia, mientras que la tos vigorosa puede producir sonidos que incluyen componentes significativos de alta frecuencia, con características espectrales similares a las de los estornudos. En particular, los eventos de tos exhiben consistentemente una mayor proporción de energía de baja frecuencia. Por el contrario, la relación entre la energía de alta frecuencia y la de baja frecuencia (relación de energía de alta a baja frecuencia) puede proporcionar una característica acústica más discriminativa para distinguir entre comportamientos de tos y estornudos.

Nuestra innovación aborda estas limitaciones a través de la estimulación mecánica con restricciones espaciales. El modelo conductual refinado demuestra ventajas duales: (1) precisión milimétrica en las sondas estabilizadas de aplicación de estímulos y (2) especificidad conductual mejorada. Además, nuestro extenso análisis de la acústica de la tos y los estornudos revela que estos comportamientos exhiben distintos perfiles de intensidad de sonido, con diferencias estadísticamente significativas en sus relaciones de energía de alta a baja frecuencia. Además, nuestro análisis acústico integral de los eventos de tos y estornudos revela perfiles de intensidad de sonido distintivos entre estos comportamientos, acompañados de diferencias estadísticamente significativas en sus relaciones de energía de alta a baja frecuencia. Además, este método de clasificación también es factible en los registros acústicos de comportamientos de tos y estornudos inducidos por la nebulización de capsaicina. En conjunto, estos parámetros acústicos permitieron el desarrollo de un espacio de características multidimensional que establece un estándar objetivo y cuantificable para diferenciar la tos y el estornudo. El resultado establece un buen estándar para investigar los mecanismos de defensa de las vías respiratorias con factores de confusión reducidos y reproducibilidad mejorada. Esto no solo resuelve los desafíos de larga data en la investigación de los reflejos respiratorios, sino que también abre vías para estudios precisos de neuromodulación de los circuitos neuronales de la tos y el estornudo.

Aunque este método induce eficazmente comportamientos de tos y estornudos en ratones, todavía tiene algunas limitaciones. En comparación con la inducción de nebulización, la cirugía puede causar cierto grado de lesión a los ratones, aunque nos esforzamos por minimizar el daño durante el procedimiento. No obstante, la cirugía aún puede provocar comportamientos de tos y estornudos de manera estable, lo que indica que la cirugía en sí no disminuye la sensibilidad de los ratones a estos estímulos. También surgieron desafíos técnicos en el fenotipado conductual. La fidelidad de la señal acústica requirió una calibración precisa de la ubicación del micrófono desde el sujeto para equilibrar las relaciones señal-ruido y evitar la saturación de amplitud. Además, la integración de catéteres de administración de estímulos con cámaras de pletismografía de cuerpo entero (WBP) requirió diseños especializados: el catéter debe extenderse desde la parte superior de la cámara sin obstaculizar los movimientos naturales del ratón o la administración del estímulo. En resumen, a pesar de las limitaciones del método quirúrgico, proporciona un medio eficaz para inducir de manera estable comportamientos de tos y estornudos en ratones, y con un proceso experimental cuidadosamente diseñado, se pueden minimizar las lesiones en el ratón para garantizar una recopilación precisa de datos de comportamiento.

En conclusión, a través de estas delicadas manipulaciones quirúrgicas y un riguroso diseño experimental, hemos establecido un modelo que induce de manera estable comportamientos de tos y estornudos en ratones, proporcionando una base experimental confiable para un mayor estudio de estos dos comportamientos reflejos respiratorios.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

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2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Para grabación ultrasónica
Inyector estereotáctico cerebral	RWD	68801
Capsaicina	MCE	HY-10448
Balance electrónico	Shanghai ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Utilizado para gráficos y análisis de datos
Sistema de Cámara de Alta Velocidad	Filr	20102748
Iodóforo	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Bomba de microinyección	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Plastilina para modelar			https://detail.tmall.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-10 41234985980666-2-1& bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S& cpp=1&; h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item& id=61 1429671875& compartir _crt_v=1& shareurl=true&; short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D& SPM=A2159R.13376460.0.0 & tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5& UN=B385 9eAb62EF44248BD7BAB98FFEB 263& un_site=0&; ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1& wxsign =tbwPFmvLRyYYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF& x-SSR=True
Nebulizador	YUWELL	M105	Para la atomización de la capsaicina
Tubos de PE	RWD	62323
Tubería de silicona			https://item.taobao.com/item.htm? id=618505617112& pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnmk< br/> Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw& SPM=a21xtw.291 78619.0.0
Software Spike2	Spike2		Utilizado para análisis de trazas respiratorias y audio
SpinView	Filr		Utilizado para grabación de vídeo de alta velocidad
Tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Software admiad WBP	TOW-INT-TECH		Utilizado para la grabación de WBP
Sistema de pletismografía corporal WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204