Detección rápida de Staphylococcus aureus y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina mediante PCR fluorescente multiplex en tiempo real

Summary

Este protocolo utiliza PCR multiplex en tiempo real con cebadores/sondas dirigidos a genes NUC y MRSA mecA específicos de SA. Permite una detección cualitativa rápida (<1 h) de ácidos nucleicos SA/MRSA en muestras de esputo humano, superando las limitaciones de los métodos basados en cultivos.

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano grampositivo común que causa infecciones nosocomiales y adquiridas en la comunidad, con diversas manifestaciones clínicas que van desde lesiones superficiales locales e intoxicación alimentaria hasta infecciones sistémicas fatales. El descubrimiento de los antibióticos redujo significativamente la tasa de mortalidad, pero el problema de la resistencia a los medicamentos se ha vuelto cada vez más prominente. Desde la primera identificación de MRSA en 1960, esta cepa se ha convertido en una amenaza para la salud pública mundial. El SARM es un patógeno importante de las infecciones nosocomiales, capaz de causar diversas enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis crónica, neumonía, artritis piógena y bacteriemia. Por lo tanto, la detección rápida y precisa de S. aureus y su resistencia a los medicamentos es crucial para guiar el tratamiento clínico.

Los métodos actuales de detección de rutina para S. aureus y MRSA tienen limitaciones significativas. El método tradicional de cultivo bacteriano, que ha servido como "estándar de oro" durante décadas, puede proporcionar una identificación definitiva de especies y resultados de sensibilidad a los fármacos, pero el proceso requiere mucho tiempo, ya que dura entre 48 y 72 h. Además, este método es susceptible a la contaminación y se basa en instalaciones de laboratorio especializadas y técnicos calificados. Las pruebas serológicas logran un diagnóstico no invasivo mediante la detección de anticuerpos contra S. aureus en el suero del paciente, pero no pueden distinguir entre infecciones activas e infecciones pasadas, ni pueden identificar cepas resistentes a los medicamentos (como MRSA).

Este estudio se centra en el desarrollo de un nuevo método de detección de PCR de fluorescencia multiplex en tiempo real para superar las limitaciones mencionadas anteriormente. Este método diseña cebadores específicos y sondas fluorescentes TaqMan dirigidas al gen nuc específico de la especie de S. aureus y al gen mecA que media la resistencia a la meticilina, lo que permite la amplificación y detección simultáneas de S. aureus y MRSA en un solo sistema de reacción. Esta tecnología reduce en gran medida el tiempo de detección, proporcionando una solución rápida, precisa y rentable para la detección de S. aureus y MRSA. Este enfoque innovador mejora en gran medida la eficiencia del diagnóstico clínico y facilita la implementación temprana de la terapia antibiótica dirigida, lo que contribuye de manera importante al control de las infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos.

Introduction

S. aureus es un patógeno condicional grampositivo muy extendido que coloniza la mucosa nasal de individuos sanos ^1,2. Cuando la inmunidad del huésped se ve comprometida, puede causar infecciones locales de la piel, invasión de tejidos profundos o enfermedades sistémicas (p. ej., neumonía, endocarditis, osteomielitis y bacteriemia)³. La meticilina, una penicilina semisintética, se aplicó clínicamente para las infecciones por S. aureus en 1959, y dos años más tarde, el SARM surgió en el Reino Unido, extendiéndose rápidamente a países europeos como Dinamarca, Francia y Suiza⁴. La resistencia al SARM a los antibióticos β-lactámicos no solo complica el manejo clínico, sino que también eleva significativamente los riesgos de infección⁵. Múltiples factores, incluida la colonización/propagación incontrolable, los altos costos de prevención y el uso excesivo de antibióticos, han aumentado colectivamente las tasas de infección por SARM⁶. Debido a su rápida transmisión y a sus complejos mecanismos de resistencia, las infecciones por SARM se asocian con altas tasas de letalidad, con casi 150 000 casos notificados y > 7 000 muertes anuales en los países de la UE⁷. Según los datos de vigilancia de CHINET, las tasas de infección por SARM en China se han mantenido por encima del 30% durante los últimos cinco años⁸. El alto riesgo de infección cruzada nosocomial intensifica aún más las cargas de salud pública y ejerce presión sobre los sistemas de salud ^9,10. Por lo tanto, el desarrollo de tecnologías de detección rápida de SARM eficientes y precisas es clínicamente urgente para lograr un diagnóstico temprano, una terapia personalizada, reducir la mortalidad e interrumpir las cadenas de transmisión.

Las tecnologías de detección actuales para S. aureus y MRSA abarcan múltiples campos, incluida la detección fenotípica, la detección genómica, la detección transcriptómica, la detección proteómica, la tecnología de espectrometría de masas y los análisis basados en bioinformática¹¹.

Los métodos de detección fenotípica, como el método de difusión en disco (método KB) y el método de concentración inhibitoria mínima (método MIC), son recomendados como "estándares de oro" por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST). Estos métodos tienen la ventaja de no necesitar instrumentos especializados, siendo ampliamente utilizados para la vigilancia del espectro de resistencia y la investigación epidemiológica. Sin embargo, sus desventajas también son evidentes: largos períodos de cultivo (más de 24 h) y los resultados del método KB para algunos antibióticos nuevos requieren validación por valores de CIM, con resultados para cepas de punto de ruptura susceptibles a factores humanos^12,13.

Entre los métodos de detección a nivel genómico, la PCR convencional tiene las características de alta sensibilidad y fuerte especificidad, lo que permite juzgar preliminarmente la resistencia y acortar el tiempo experimental, con bajo costo y alta eficiencia. Pero sus limitaciones radican en poder detectar solo genes de resistencia conocidos y confiar en instrumentos especializados¹⁴. El mecanismo de resistencia microbiana es muy complejo, por lo que es crucial desarrollar métodos técnicos que puedan cubrir fenotipos resistentes desconocidos y permitir una rápida identificación. La tecnología emergente GoPhAST-R (AST genotípica y fenotípica combinada a través de la detección de ARN) determina los fenotipos de resistencia mediante la detección de los niveles de expresión del ARNm, lo que permite la detección simultánea de diferentes genes relacionados con la resistencia en múltiples patógenos, acortando el tiempo de respuesta experimental y logrando una precisión del 94-99% cuando se combina con el aprendizaje automático¹⁵.

Entre los métodos de detección a nivel proteómico, el método de aglutinación de látex PBP2a se basa en la unión específica antígeno-anticuerpo, con un funcionamiento sencillo y resultados rápidos, con alta especificidad y sensibilidad para el SARM. Sin embargo, no puede diferenciar entre diferentes especies de estafilococos, y la sensibilidad de detección de los kits comerciales tiene cierta disminución, lo que requiere volver a realizar la prueba después de la inducción con oxacilina⁸.

Los métodos de detección basados en MS de MALDI-TOF, como el método DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), logran un rendimiento analítico óptimo a las 6-8 horas de incubación, con una tasa de detección de hasta el 96,4%, y tanto la sensibilidad como la especificidad son del 100%. Pero el costo es alto y las posiciones limitadas en la placa objetivo dificultan la detección simultánea de cientos de muestras ^16,17.

Entre las tecnologías de análisis bioinformático combinadas con datos ómicos para la predicción de resistencia, la tecnología de secuenciación del genoma completo destaca por su alta resolución y sus amplias capacidades de análisis de información. Combinado con bases de datos de análisis de genes de resistencia como Resfinder, puede analizar si las cepas portan genes de resistencia específicos, predecir el potencial de resistencia, detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y mutantes de genes asociados a la resistencia, al tiempo que admite el almacenamiento y el reanálisis de datos de genoma completo¹⁸. Sin embargo, este método requiere la operación de profesionales con formación bioinformática, rara vez se utiliza en las pruebas diarias y se utiliza comúnmente para el análisis epidemiológico o la vigilancia molecular de patógenos¹⁹.

Las metodologías mencionadas anteriormente son de alto costo, requieren mucho tiempo o aún se encuentran en la fase de investigación y desarrollo. Clínicamente, existe una necesidad urgente de una solución que equilibre la "inmediatez" y la "precisión": una novedosa tecnología de PCR fluorescente multiplex llena este vacío amplificando simultáneamente los genes nuc / mecA en un solo tubo, comprimiendo el ciclo de detección a 1 h. Cierra con precisión la brecha de la ventana de tiempo en el proceso tradicional de "detección de emergencia - tipificación de resistencia", proporcionando una herramienta de diagnóstico molecular más eficiente en el tiempo para la prevención y el control de infecciones nosocomiales. Este ensayo de PCR específico se utiliza principalmente para la detección de muestras respiratorias, con muestras de esputo como ejemplo típico. Presenta una sensibilidad de 500 copias/ml y una alta especificidad, sin verse afectado por los agentes antibacterianos. Debido a estas características de rendimiento favorables, este ensayo de PCR tiene un valor de aplicación sustancial para el diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio y la vigilancia de infecciones nosocomiales causadas por MRSA.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong (Nº de ética: KY2025-510-01). La información detallada sobre los materiales utilizados en esta investigación (reactivos, productos químicos, equipos y software) se puede encontrar en la Tabla de materiales.

1. Protocolo de recogida y conservación de muestras

1. Criterios de inclusión: Con la excepción de los materiales de control de calidad, identifique todas las muestras recolectadas como muestras positivas utilizando el método estándar de oro (ensayo basado en cultivo).
2. Recolección de esputo humano
   1. Recoja 1-3 ml de esputo de tos profunda del tracto respiratorio inferior de los sujetos utilizando tubos de muestreo estériles. Selle los tubos inmediatamente y transpórtelos para su análisis. Procese las muestras inmediatamente para su análisis.
3. Almacenamiento de muestras:
   1. Analice las muestras recolectadas a través del método anterior con prontitud. El almacenamiento a corto plazo está permitido en las siguientes condiciones:
      2-8 °C: ≤7 días
      -20 °C ± 5 °C: ≤6 meses
      -70 °C ± 5 °C: ≤24 meses
      NOTA: En este estudio, las muestras de esputo no se trataron con conservantes (como caldo BHI + glicerol, etc.). Después de la recolección, se almacenaron en las condiciones descritas anteriormente, y se evitó estrictamente la congelación y descongelación repetidas. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Ciclos máximos permitidos de congelación-descongelación: ≤3.

2. Extracción de ácidos nucleicos

NOTA: Complete todos los procedimientos dentro de un gabinete de bioseguridad para evitar la contaminación.

1. Para el pretratamiento de muestras de esputo, mezcle la muestra con una solución de NaOH al 4% en una proporción de 1:4 (muestra de esputo: solución de NaOH al 4%) para licuar las muestras de esputo viscoso y eliminar las impurezas que interfieren, luego mezcle completamente el vórtice (30 s) e incube a temperatura ambiente (22-25 °C) durante 30 min para lograr la licuefacción.
2. Preparación de reactivos de extracción de ácidos nucleicos
   1. Saque la placa de 96 pocillos preempaquetada del kit. Mueva ligeramente la placa de 96 pocillos para concentrar los reactivos y las perlas magnéticas en la parte inferior de la placa de 96 pocillos.
   2. Arranca con cuidado la película de sellado de papel de aluminio, evitando que vibre la placa de 96 pocillos para evitar salpicaduras de líquido.
   3. En las soluciones de la columna 1 y la columna 7 de la placa de 96 pocillos: Primero, agregue 20 μl de proteinasa K, luego agregue 200-300 μl de muestra para extraer.
3. Extracción automatizada de ácidos nucleicos (método basado en perlas magnéticas)
   1. Coloque la placa de 96 pocillos preempaquetada con muestras agregadas en la ranura correspondiente del instrumento automatizado de extracción de ácidos nucleicos.
   2. Siga el proceso de extracción de ácidos nucleicos como se describe a continuación.
      1. Con la varilla magnética de la cámara de laboratorio, transfiera las perlas magnéticas adsorbidas con ácido nucleico a diferentes orificios de reactivos.
      2. Use el juego de agitación para mezclar el líquido rápida y repetidamente, de modo que las perlas líquidas y magnéticas se mezclen de manera uniforme.
      3. A medida que las perlas líquidas y magnéticas se combinan armoniosamente, la máquina automatizada de extracción de ácidos nucleicos avanza a través de las etapas sucesivas de lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos (70 °C, 15 min, 3 veces de adsorción magnética), lavado (3 veces, mezclar durante 2 min cada vez, luego realizar la adsorción magnética dos veces (15 s cada una) y elución (2 veces, mezclar durante 5 min cada vez, 3 veces de adsorción magnética), eventualmente, obtiene ácido nucleico de alta pureza.
      4. Valide la concentración y pureza del ácido nucleico utilizando un espectrofotómetro. El volumen de la muestra de ácido nucleico fue de 50 μL, con una concentración que osciló entre 50 y 100 ng/μL, y la relación A260/A280 fue de 1,8 ± 0,2.
   3. Una vez finalizado el programa, aspire directamente la solución de elución que contiene ácido nucleico de la columna 6 y la columna 12 para su posterior análisis. Si es necesario, almacene las muestras de ácido nucleico extraídas restantes a -20 °C para su conservación a largo plazo y su uso futuro.

3. Detección de qPCR de ácidos nucleicos de S. aureus y ácidos nucleicos MRSA

1. Preparación de reactivos de amplificación
   1. Saque la solución de reacción de amplificación de ácido nucleico y la solución de reacción nuc/mecA del kit (cebadores/sonda específicos del gen nuc para S. aureus y mecA para MRSA). Después de descongelar a 22-25 °C, oscile completamente y mezcle uniformemente, luego realice una centrifugación instantánea (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
   2. De acuerdo con el número de muestras a analizar, N, preparar reactivos en función de la cantidad total de N + 2 (N es el número de muestras y 2 son los controles de calidad negativos y positivos). Los pasos específicos son los siguientes:
      1. Preparar la mezcla del sistema de reacción (16 μL de solución de reacción de amplificación de ácidos nucleicos (tampón, dNTPs, ADN polimerasa, enzima UDG) + 4 μL de solución de reacción nuc/mecA (cebadores y sondas para los genes de detección diana nuc, mecA y la referencia interna GAPDH).
      2. Agréguelo a un tubo de centrífuga del tamaño adecuado, oscile completamente y mezcle uniformemente, y realice una centrifugación instantánea (~ 6000 g, 15 s, 22 ° C-25 ° C). A continuación, dispense 20 μl por tubo en tubos de reacción de PCR.
2. Agregue muestras de ácido nucleico y control de calidad:
   1. En los tubos de reacción de PCR preparados anteriormente (20 μL), respectivamente, agregue 5 μL de ácido nucleico de las muestras analizadas, control positivo y control negativo, logrando un volumen final de 25 μL por tubo.
   2. Tape bien los tubos y realice una centrifugación instantánea (~ 6000 × g, 15 s, 22-25 ° C) y luego coloque los tubos en el instrumento de PCR.
3. Amplificación por PCR:
   1. Configure el programa de ciclo de la siguiente manera: Predesnaturalización: 97 °C, 90 s, 1 ciclo; los siguientes 2 pasos durante 42 ciclos: desnaturalización de 97 °C durante 2 s y recocido de 55 °C durante 15 s.
   2. Establezca los parámetros de detección de la señal de fluorescencia de la siguiente manera: utilice el etiquetado fluorescente FAM de los genes nuc ; Marcaje fluorescente VIC de genes mecA ; y el marcado fluorescente CY5 del gen GAPDH como control interno del kit. Recopile datos a 55 °C. Una vez finalizada la reacción, asegúrese de que los datos se guarden para futuros análisis.
   3. Analice los datos utilizando un software específico de qPCR (SLAN 96P):
      1. Información de la muestra: En el diagrama de diseño de la placa de pocillos del software, etiquete los tipos de muestra (por ejemplo, control positivo, control negativo, muestra desconocida, gen de referencia interno, etc.) correspondientes a las posiciones de carga de la muestra.
      2. Colocación de los tubos de reacción: Abra la tapa del módulo calefactor del instrumento, coloque la placa/tubos de PCR sellados de forma constante en el interior, asegúrese de que encajan bien con el módulo calefactor y cierre bien la tapa del módulo (para evitar irregularidades térmicas)
      3. Inicio de la reacción: Después de confirmar que la configuración del programa en el software es correcta, haga clic en Iniciar ejecución y registre el ID del experimento para referencia futura.
      4. Detener el funcionamiento y retirar los tubos: Una vez que el programa termine de ejecutarse, espere a que la temperatura del módulo de calentamiento descienda por debajo de 50 °C, luego abra la tapa para quitar la placa / tubos de PCR y manipule las muestras correctamente.
4. Análisis de datos
   1. Antes del análisis de datos, confirme tres resultados visuales: 1) Las curvas de amplificación de todas las muestras (incluido el control interno) muestran una forma de S típica, sin curvas ascendentes planas o anormalmente retrasadas; 2) La línea umbral de fluorescencia cruza la fase exponencial de las curvas, y los valores de Ct del control interno (por ejemplo, GAPDH) están dentro de ≤ 38 ciclos (coeficiente de variación < 5%); 3) Se incluyen controles negativos/positivos a lo largo de todo el experimento para monitorear la posibilidad de contaminación.
      1. Si el experimento está fuera de control, vuelva a comprobar todo el lote. Si una muestra muestra una amplificación anormal (como una curva S atípica o un valor de Ct dentro del rango crítico), vuelva a verificar esa muestra específica.
   2. Llame los datos experimentales en el software, establezca el umbral y la línea de base, y calcule los valores de Ct de forma automática o manual, ya que el instrumento selecciona automáticamente el umbral de referencia. Establezca el valor final de determinación positiva en Ct ≤ 36; el rango de referencia para el gen de referencia interno requiere Ct ≤ 38. Confirme que sus curvas de amplificación exhiben perfiles característicos en forma de S.

Results

Detección de S. aureus y MRSA mediante qPCR
Basándonos en el gen nuc específico de la especie de S. aureus y el gen de resistencia a los fármacos mecA de MRSA, diseñamos cebadores y sondas marcados con distintos fluoróforos para la detección de qPCR. Todos los resultados del control de calidad a lo largo de los experimentos de qPCR se mantuvieron dentro de los umbrales recomendados, lo que confirma la fiabilidad de los resultados de la detección (

Discussion

La detección precisa y temprana de la resistencia a la meticilina es fundamental para el pronóstico de las infecciones causadas por S. aureus. La identificación temprana de S. aureus y MRSA puede reducir el uso indebido de antibióticos de amplio espectro y disminuir la presión selectiva que conduce a la aparición y propagación de resistencia bacteriana.

Los métodos tradicionales de detección fenotípica, como la difusión en disco de cefoxitina...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extractor automático de ácidos nucleicos	DAAN	Inteligente 32	Para extracción de ADN
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Cabina de bioseguridad
Centrífuga electrónica	WEALTEC		Centrifugar el líquido residual de la pared del tubo
Kit de detección de genes de resistencia a los medicamentos Staphylococcus aureus resistente a la meticilina	BOJIE	ZC-HX-38-2	Detección de genes de resistencia a Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
Kit de extracción de ácidos nucleicos	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Extraer ácido nucleico
SLAN Sistema de análisis de PCR médica totalmente automático	HONGSHI		Análisis de datos
SLAN-96S Máquina de PCR en tiempo real	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificación de PCR cuantitativa fluorescente
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop Uno	Análisis cuantitativo de ADN, ARN y proteínas
Congeladores de temperatura ultrabaja (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &grados; C para almacenar reactivos
Vórtice-5	Kylin-campana		Para mezclar reactivos