Detección rápida de Staphylococcus aureus y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina mediante PCR fluorescente multiplex en tiempo real

Resumen

Este protocolo utiliza PCR multiplex en tiempo real con cebadores/sondas dirigidos a genes NUC y MRSA mecA específicos de SA. Permite una detección cualitativa rápida (<1 h) de ácidos nucleicos SA/MRSA en muestras de esputo humano, superando las limitaciones de los métodos basados en cultivos.

Resumen

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano grampositivo común que causa infecciones nosocomiales y adquiridas en la comunidad, con diversas manifestaciones clínicas que van desde lesiones superficiales locales e intoxicación alimentaria hasta infecciones sistémicas fatales. El descubrimiento de los antibióticos redujo significativamente la tasa de mortalidad, pero el problema de la resistencia a los medicamentos se ha vuelto cada vez más prominente. Desde la primera identificación de MRSA en 1960, esta cepa se ha convertido en una amenaza para la salud pública mundial. El SARM es un patógeno importante de las infecciones nosocomiales, capaz de causar diversas enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis crónica, neumonía, artritis piógena y bacteriemia. Por lo tanto, la detección rápida y precisa de S. aureus y su resistencia a los medicamentos es crucial para guiar el tratamiento clínico.

Los métodos actuales de detección de rutina para S. aureus y MRSA tienen limitaciones significativas. El método tradicional de cultivo bacteriano, que ha servido como "estándar de oro" durante décadas, puede proporcionar una identificación definitiva de especies y resultados de sensibilidad a los fármacos, pero el proceso requiere mucho tiempo, ya que dura entre 48 y 72 h. Además, este método es susceptible a la contaminación y se basa en instalaciones de laboratorio especializadas y técnicos calificados. Las pruebas serológicas logran un diagnóstico no invasivo mediante la detección de anticuerpos contra S. aureus en el suero del paciente, pero no pueden distinguir entre infecciones activas e infecciones pasadas, ni pueden identificar cepas resistentes a los medicamentos (como MRSA).

Este estudio se centra en el desarrollo de un nuevo método de detección de PCR de fluorescencia multiplex en tiempo real para superar las limitaciones mencionadas anteriormente. Este método diseña cebadores específicos y sondas fluorescentes TaqMan dirigidas al gen nuc específico de la especie de S. aureus y al gen mecA que media la resistencia a la meticilina, lo que permite la amplificación y detección simultáneas de S. aureus y MRSA en un solo sistema de reacción. Esta tecnología reduce en gran medida el tiempo de detección, proporcionando una solución rápida, precisa y rentable para la detección de S. aureus y MRSA. Este enfoque innovador mejora en gran medida la eficiencia del diagnóstico clínico y facilita la implementación temprana de la terapia antibiótica dirigida, lo que contribuye de manera importante al control de las infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos.

Introducción

S. aureus es un patógeno condicional grampositivo muy extendido que coloniza la mucosa nasal de individuos sanos ^1,2. Cuando la inmunidad del huésped se ve comprometida, puede causar infecciones locales de la piel, invasión de tejidos profundos o enfermedades sistémicas (p. ej., neumonía, endocarditis, osteomielitis y bacteriemia)³. La meticilina, una penicilina semisintética, se aplicó clínicamente para las infecciones por S. aureus en 1959, y dos años más tarde, el SARM surgió en el Reino Unido, extendiéndose rápidamente a países europeos com....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong (Nº de ética: KY2025-510-01). La información detallada sobre los materiales utilizados en esta investigación (reactivos, productos químicos, equipos y software) se puede encontrar en la Tabla de materiales.

1. Protocolo de recogida y conservación de muestras

1. Criterios de inclusión: Con la excepción de los materiales de control de calidad, identifique todas las muestras recolectadas como muestras positivas utilizando el método estándar de oro (ensayo basado en cultivo).<....

Resultados

Detección de S. aureus y MRSA mediante qPCR
Basándonos en el gen nuc específico de la especie de S. aureus y el gen de resistencia a los fármacos mecA de MRSA, diseñamos cebadores y sondas marcados con distintos fluoróforos para la detección de qPCR. Todos los resultados del control de calidad a lo largo de los experimentos de qPCR se mantuvieron dentro de los umbrales recomendados, lo que confirma la fiabilidad de los resultados de la detección (

Discusión

La detección precisa y temprana de la resistencia a la meticilina es fundamental para el pronóstico de las infecciones causadas por S. aureus. La identificación temprana de S. aureus y MRSA puede reducir el uso indebido de antibióticos de amplio espectro y disminuir la presión selectiva que conduce a la aparición y propagación de resistencia bacteriana.

Los métodos tradicionales de detección fenotípica, como la difusión en disco de cefoxitina.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extractor automático de ácidos nucleicos	DAAN	Inteligente 32	Para extracción de ADN
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Cabina de bioseguridad
Centrífuga electrónica	WEALTEC		Centrifugar el líquido residual de la pared del tubo
Kit de detección de genes de resistencia a los medicamentos Staphylococcus aureus resistente a la meticilina	BOJIE	ZC-HX-38-2	Detección de genes de resistencia a Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
Kit de extracción de ácidos nucleicos	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Extraer ácido nucleico
SLAN Sistema de análisis de PCR médica totalmente automático	HONGSHI		Análisis de datos
SLAN-96S Máquina de PCR en tiempo real	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificación de PCR cuantitativa fluorescente
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop Uno	Análisis cuantitativo de ADN, ARN y proteínas
Congeladores de temperatura ultrabaja (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &grados; C para almacenar reactivos
Vórtice-5	Kylin-campana		Para mezclar reactivos