Un ensayo VIVO/MUERTO optimizado junto con citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en células de levadura

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la supervivencia post-estrés en muestras de levadura. El ensayo emplea dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y yoduro de propidio (PI), para cuantificar la integridad de la membrana plasmática. Utiliza la citometría de flujo para proporcionar estimaciones cuantitativas y reproducibles de las fracciones de células vivas, muertas y dañadas para muestras de estrés postoxidativo.

Resumen

Cuantificar la supervivencia es una tarea común y crítica en la investigación de levaduras. Las tinciones LIVE/DEAD basadas en la integridad de la membrana plasmática proporcionan un ensayo rápido y de alto rendimiento para la supervivencia de la levadura cuando se combina con citometría de flujo. Sin embargo, las variaciones en el tampón de tinción, la concentración de colorante, el tiempo de incubación y la configuración de citometría de flujo pueden afectar la calidad y la reproducibilidad de los datos. Este protocolo presenta un ensayo estandarizado LIVE/DEAD para la cuantificación de la supervivencia post-estrés en levaduras mediante citometría de flujo. Después de tratar Candida glabrata, un patógeno de levadura oportunista, con diferentes dosis de peróxido de hidrógeno, las muestras posteriores al estrés se tiñeron con una tinción LIVE/DEAD de dos componentes que consiste en SYTO 9 y yoduro de propidio (PI). Se utilizó citometría de flujo para distinguir las poblaciones de células vivas, dañadas y muertas y cuantificar sus porcentajes en cada muestra. Las estimaciones de supervivencia basadas en la estadística del porcentaje de vida se compararon con el resultado de la Unidad Formadora de Colonias (UFC) en la misma muestra. Los dos métodos arrojaron resultados consistentes para las muestras tratadas con dosis simulada y letal (1 M H₂O₂). A la dosis subletal de 100 mM H₂O₂, SYTO 9 / PI estimó una tasa de supervivencia más alta que la UFC, lo que refleja una diferencia clave entre los dos, donde el protocolo presentado aquí evalúa la supervivencia celular inmediatamente después del estrés, mientras que la UFC cuantifica el porcentaje de células capaces de recuperarse y reproducirse. Por lo tanto, este protocolo mide la viabilidad en una etapa más temprana del proceso de muerte celular. En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa rápida y escalable a la UFC para la cuantificación de la supervivencia post-estrés en levadura. Sus resultados proporcionan información complementaria a la UFC al evaluar la supervivencia en una etapa más temprana y distinguir entre células muertas y dañadas.

Introducción

El subfilo de levadura en ciernes contiene muchos modelos biológicos y biotecnológicos importantes. Una tarea común y crítica en la investigación de levaduras es cuantificar el efecto de las perturbaciones genéticas o ambientales, estas últimas incluyen el estrés o los tratamientos farmacológicos. En la fermentación industrial, por ejemplo, los productores deben controlar la viabilidad de los cultivos de levadura para garantizar la eficiencia y la calidad del proceso de fermentación ^1,2. Cuando se estudian especies de levaduras patógenas, medir su supervivencia después del est....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aplicación de estrés por peróxido de hidrógeno

1. Al menos un día antes del experimento, inocular un cultivo nocturno de C. glabrata de una sola colonia en una placa recién rayada en 3 ml de medio sintético completo (SC) (1,7 g / L de base de nitrógeno de levadura, mezcla completa de aminoácidos, 2% p / v de glucosa, agua) y cultivarlo colocando el tubo de vidrio en un tambor de rodillos y crecer a 30 ° C. Alternativamente, se puede usar un agitador orbital coloca....

Resultados

La tinción SYTO 9/PI distingue las células de levadura vivas de las células muertas en función de sus señales de fluorescencia en los canales verde (500 nm-560 nm) y rojo (>600 nm). Las células vivas, que solo acumulan SYTO 9, emiten fluorescencia fuerte en el canal verde, con señales rojas mínimas. Las células muertas acumulan tanto SYTO 9 como PI y se espera que emitan fluorescencia fuerte en el canal rojo, con señales de fluorescencia verde más bajas e.......

Discusión

Este protocolo describe un ensayo LIVE/DEAD utilizando dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y PI, y utilizando citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en levaduras. Si bien estas dos tinciones se han aplicado para evaluar la supervivencia en varias especies de levaduras en la literatura y están disponibles como un kit comercial, ni el manual del fabricante ni la literatura proporcionan suficientes detalles sobre el protocolo de tinción o la configuración de cito.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de pozo profundo de 96 pozos	Thermo Fisher	278606	NUNC 96
Citómetro de flujo Attune NxT con lector de placas	Thermo Fisher A24858	A24858	Automuestreador (A42901)
Candida glabrata			CG99, cepa de laboratorio derivada de un aislado clínico (Cormack & Falkow, 1999)
Kit de levadura VIVA/MUERTA de FungaLight	Thermo Fisher A24858	L34952	Contiene SYTO 9 (3,34 mM) y yoduro propidio (20 mM). Estos dos componentes también pueden adquirirse por separado a varios proveedores.
Peróxido de hidrógeno	Sigma Aldrich	H1009
Microscopio Leica Confocal SP8	Leica	TCS SP8 X
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S9888	Se usa para hacer una solución esterilizada de NaCl al 0,85%
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos	Sigma Aldrich	Y0626	se utiliza para elaborar el medio sintético completo con una mezcla de glucosa al 2% y aminoácidos