Artículo de método

Un ensayo VIVO/MUERTO optimizado junto con citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en células de levadura

DOI:

10.3791/69005

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29 de agosto de 2025

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1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la supervivencia post-estrés en muestras de levadura. El ensayo emplea dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y yoduro de propidio (PI), para cuantificar la integridad de la membrana plasmática. Utiliza la citometría de flujo para proporcionar estimaciones cuantitativas y reproducibles de las fracciones de células vivas, muertas y dañadas para muestras de estrés postoxidativo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuantificar la supervivencia es una tarea común y crítica en la investigación de levaduras. Las tinciones LIVE/DEAD basadas en la integridad de la membrana plasmática proporcionan un ensayo rápido y de alto rendimiento para la supervivencia de la levadura cuando se combina con citometría de flujo. Sin embargo, las variaciones en el tampón de tinción, la concentración de colorante, el tiempo de incubación y la configuración de citometría de flujo pueden afectar la calidad y la reproducibilidad de los datos. Este protocolo presenta un ensayo estandarizado LIVE/DEAD para la cuantificación de la supervivencia post-estrés en levaduras mediante citometría de flujo. Después de tratar Candida glabrata, un patógeno de levadura oportunista, con diferentes dosis de peróxido de hidrógeno, las muestras posteriores al estrés se tiñeron con una tinción LIVE/DEAD de dos componentes que consiste en SYTO 9 y yoduro de propidio (PI). Se utilizó citometría de flujo para distinguir las poblaciones de células vivas, dañadas y muertas y cuantificar sus porcentajes en cada muestra. Las estimaciones de supervivencia basadas en la estadística del porcentaje de vida se compararon con el resultado de la Unidad Formadora de Colonias (UFC) en la misma muestra. Los dos métodos arrojaron resultados consistentes para las muestras tratadas con dosis simulada y letal (1 M H2O2). A la dosis subletal de 100 mM H2O2, SYTO 9 / PI estimó una tasa de supervivencia más alta que la UFC, lo que refleja una diferencia clave entre los dos, donde el protocolo presentado aquí evalúa la supervivencia celular inmediatamente después del estrés, mientras que la UFC cuantifica el porcentaje de células capaces de recuperarse y reproducirse. Por lo tanto, este protocolo mide la viabilidad en una etapa más temprana del proceso de muerte celular. En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa rápida y escalable a la UFC para la cuantificación de la supervivencia post-estrés en levadura. Sus resultados proporcionan información complementaria a la UFC al evaluar la supervivencia en una etapa más temprana y distinguir entre células muertas y dañadas.

Introducción

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El subfilo de levadura en ciernes contiene muchos modelos biológicos y biotecnológicos importantes. Una tarea común y crítica en la investigación de levaduras es cuantificar el efecto de las perturbaciones genéticas o ambientales, estas últimas incluyen el estrés o los tratamientos farmacológicos. En la fermentación industrial, por ejemplo, los productores deben controlar la viabilidad de los cultivos de levadura para garantizar la eficiencia y la calidad del proceso de fermentación 1,2. Cuando se estudian especies de levaduras patógenas, medir su supervivencia después del estrés o el tratamiento antifúngico es fundamental para comprender la base genética y mecanicista de los rasgos relacionados con la infección, como la resistencia a los antifúngicos. La medición de la supervivencia en catéteres y superficies también es una tarea importante en entornos clínicos3. Todos estos diversos escenarios requieren enfoques cuantitativos que puedan medir de manera rápida y precisa el resultado de los tratamientos farmacológicos y de estrés.

Los métodos existentes para lograr el objetivo anterior se dividen en tres categorías principales según lo que miden. La primera categoría mide la clonogenicidad, o la capacidad de las células de levadura individuales para formar una sola colonia después del estrés. El método representativo en esta categoría es el ensayo de unidad formadora de colonias (UFC). La segunda categoría mide la vitalidad, que se basa en la detección de actividades enzimáticas en células vivas. Los ejemplos incluyen sondas químicas como el colorante FUN-14. La tercera categoría de métodos mide la integridad de la membrana plasmática: una pérdida irreversible de la integridad de la membrana plasmática se considera el "punto de no retorno" para la muerte celular5. Ejemplos de esta categoría incluyen colorantes fluorescentes como el yoduro de propidio (PI).

Este trabajo presenta un ensayo LIVE/DEAD optimizado junto con citometría de flujo para lograr una cuantificación rápida y escalable de la supervivencia de la levadura después del tratamiento del estrés. Este ensayo basado en la permeabilidad de la membrana es más rápido que el UFC, ya que requiere 15-30 min de tinción en comparación con 24-48 h de incubación para que se formen las colonias. Además, las muestras teñidas con una tinción LIVE/DEAD se pueden analizar fácilmente mediante citometría de flujo además de microscopía, que mide decenas de miles de células en unos pocos segundos y puede procesar fácilmente muestras de 96 pocillos para ensayos de alto rendimiento. Como resultado, este ensayo es rápido, cuantitativo y escalable. En este protocolo, se utiliza una tinción LIVE/DEAD de dos componentes que consta de SYTO 9 y PI para lograr un poder de resolución mejorado. SYTO 9 marca todas las células, vivas o muertas, mientras que PI solo ingresa a las células con membranas plasmáticas comprometidas 6,7. Por lo tanto, las células vivas solo acumulan SYTO 9, mientras que las células muertas acumulan tanto SYTO 9 como PI. Debido a que PI tiene una mayor afinidad que SYTO 9 por el ácido nucleico, excluye competitivamente a este último en la célula8. Además, los dos tintes forman un par de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), donde la emisión de SYTO 9 es absorbida por PI como su excitación. Como resultado, las células muertas exhiben una fluorescencia verde apagada y roja fuerte. Por el contrario, las células vivas muestran fluorescencia verde brillante8. Esta diferencia permite una mejor diferenciación entre células vivas y muertas en presencia de variaciones en la intensidad de la fluorescencia dentro de cada grupo.

Desde un informe inicial de su aplicación en levadura en 2004, el uso de SYTO 9 / PI en estudios de levadura ha sido irregular y se ha limitado en gran medida a evaluaciones cualitativas utilizando microscopía 7,9,10,11,12,13,14,15. Una limitación importante para su adopción como ensayo cuantitativo para la supervivencia de la levadura es la falta de caracterización sistemática y comparación con métodos ampliamente utilizados como la UFC. Este protocolo describe un ensayo estandarizado que incluye el tampón de tinción, la concentración de colorante, el tiempo de tinción y los ajustes de citometría de flujo, que minimizaron los artefactos y generaron resultados reproducibles cuando se aplicaron a C. glabrata y otras dos especies de levadura16. Debido a que la tinción SYTO 9 / PI revela una población intermedia "dañada" de células que difieren de las células vivas y muertas en su patrón de tinción, puede complementar la UFC al revelar información más matizada sobre los efectos del tratamiento del estrés en las células de levadura, lo que podría permitir nuevas aplicaciones.

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Protocolo

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Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aplicación de estrés por peróxido de hidrógeno

  1. Al menos un día antes del experimento, inocular un cultivo nocturno de C. glabrata de una sola colonia en una placa recién rayada en 3 ml de medio sintético completo (SC) (1,7 g / L de base de nitrógeno de levadura, mezcla completa de aminoácidos, 2% p / v de glucosa, agua) y cultivarlo colocando el tubo de vidrio en un tambor de rodillos y crecer a 30 ° C. Alternativamente, se puede usar un agitador orbital colocando el tubo de vidrio en un ángulo inclinado y agitando el cultivo a 200 rpm.
    1. Mida la densidad óptica (OD600) del cultivo nocturno a la mañana siguiente y dilúyalo con medios SC nuevos a OD600 ~ 0.2 en un volumen total de 10 ml. Déjelo crecer durante dos duplicaciones, lo que tarda aproximadamente 4 h, en alcanzar la fase de registro medio (OD600 ~ 1).
      EJEMPLO: Si un cultivo nocturno tiene un DO600 = 10, agregue 200 μL de este cultivo a 9,8 mL de medios SC.
  2. Dentro de los 30 minutos anteriores al tratamiento de estrés, prepare el medio de estrés con peróxido de hidrógeno. Diluir en serie el peróxido de hidrógeno del stock al 30% (9.798 M) en medios sintéticos completos (SC) a la concentración deseada. Incluya un tratamiento simulado (SC sin peróxido de hidrógeno añadido) y una dosis letal (1 M es adecuado para C. glabrata).
    EJEMPLO: Para hacer un medio de estrés de peróxido de hidrógeno de 100 mM, agregue 10,3 μl del material de peróxido de hidrógeno de 9,798 M a 1 ml SC. Pipetear suavemente para mezclar. Para hacer un medio de estrés de peróxido de hidrógeno de 10 mM, diluya 500 μL del medio de estrés de peróxido de hidrógeno de 100 mM en 4,5 mL de SC.
  3. Mida el OD600 del cultivo de registro medio y estandarícelo a, por ejemplo, OD600 = 1, agregando medios SC.
    EJEMPLO: La referencia cultural de registro medio está en OD600 = 1,2. Agregue 0,2 ml de medios SC por 1 ml de cultivo.
  4. Transfiera 600 μl de cultivo de registro medio por condición de prueba a una placa de 96 pocillos profundos. Celdas de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración sin alterar el sedimento celular.
  5. Agregue 600 μL de medio de estrés simulado o de peróxido de hidrógeno preparado en el paso 1.2 a cada pocillo y pipetee suavemente para volver a suspender las células.
  6. Incubar la placa durante 120 min a 30 °C agitando a 300 rpm.
    NOTA: El tiempo de incubación depende de la cuestión biológica de interés.

2. Aplicación de la tinción SYTO 9/PI

  1. Antes del experimento, prepare al menos 10 ml de tampón salino estéril al 0,85%.
    NOTA: Encontramos que el tampón salino al 0,85% produce artefactos de tinción mínimos, es decir, células no teñidas y muertas en muestras tratadas simuladamente, en comparación con agua desionizada o medios de crecimiento16.
  2. Prepare una solución de material de trabajo de PI a 0,2 mM utilizando agua estéril y desionizada.
    NOTA: Este material de trabajo de PI se puede almacenar hasta por 6 meses a 4 °C.
  3. Inmediatamente antes del experimento, prepare una solución madre SYTO 9 de trabajo a 33,4 μM con agua estéril y desionizada.
    NOTA: Prepare el material de trabajo SYTO 9 fresco para cada experimento. No almacenar ni reutilizar.
  4. Pipetee suavemente para mezclar las células de cada pocillo de la placa de tratamiento. Mida OD600 de cada condición de tratamiento y calcule la cantidad de tampón necesaria para volver a suspender las celdas a un OD600 de 1.
    NOTA: Se pueden utilizar pipetas multicanal para una mezcla eficiente y uniforme. Evite mezclar demasiado las muestras.
  5. Recoger las células de levadura después del simulacro o tratamiento de estrés por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado a través de la aspiración. Resuspender las células en tampón salino estéril al 0,85% a DO600 = 1 (calculado en el paso 2.4).
    NOTA: Utilice una pipeta multicanal para volver a suspender las células. Manipule todos los cultivos posteriores al tratamiento con cuidado y evite mezclar en exceso.
  6. Reserve 50 μL de cada muestra para que sirvan como controles de tinción sin teñir y con colorante único.
    NOTA: Se encontró una autofluorescencia mínima para C. glabrata de tipo salvaje en ambos canales para SYTO 9 y PI. Sin embargo, siempre verifique la autofluorescencia de las muestras sin teñir y realice una resta de fondo adecuada o use medios de crecimiento de baja autofluorescencia.
  7. Alícuota 16 μL de muestra postratamiento resuspendida en tampón salino al 0,85% a un tubo de PCR de 50 μL. Agregue 2 μL del material de trabajo de 0,2 mM de PI a la suspensión celular. A continuación, añada 2 μL del material de trabajo de 33,4 μM de SYTO 9 al mismo tubo hasta un volumen final de 20 μL.
    1. Las concentraciones finales de PI y SYTO 9 serán de 20 μM y 3,34 μM, respectivamente. Pipetear suavemente para mezclar e incubar durante 30 min en la oscuridad (se puede usar una caja negra) a temperatura ambiente.

3. Configuración y calibración del citómetro de flujo

NOTA: Esto debe hacerse en cada nuevo instrumento y también en nuevas aplicaciones de la tinción SYTO 9 / PI, incluso para una especie / cepa diferente, nuevo factor estresante o protocolo de crecimiento, etc. Los siguientes ajustes se desarrollaron en un citómetro de flujo Attune NxT. Consulte el manual del usuario del instrumento en uso para obtener instrucciones específicas.

  1. Elija canales/filtros de fluorescencia adecuados para el citómetro de flujo: se utilizaron un filtro de paso de banda de 530 nm ± 30 nm (BL1) y un filtro de paso largo de 600 nm (> 600 nm, BL3) para recoger señales en los canales verde (SYTO 9) y rojo (PI y SYTO 9). Ambos estaban emocionados con un láser azul de 488 nm.
  2. Establezca el caudal en 200 μL/min y deténgase cuando se hayan recopilado al menos 30.000 eventos.
    NOTA: El número de eventos por muestra se puede ajustar con el objetivo de lograr estimaciones sólidas de los porcentajes. Se deben excluir las muestras con muy pocos eventos (células). El siguiente paso es ajustar los voltajes en los canales FSC y SSC durante la configuración inicial.
  3. Diluya 16 μL de muestra sin teñir tratada simuladamente en 200 μL de tampón salino estéril al 0,85%. Pipetear suavemente para mezclar inmediatamente antes de la citometría de flujo. Ejecute este ejemplo y ajuste los voltajes de los canales FSC y SSC para que la población esté en el centro del FSC vs. Gráfico de densidad SSC.
    NOTA: Se utilizó un voltaje de 345 mV y 399 mV para el FSC y el SSC, respectivamente. Los siguientes pasos son ajustar los voltajes en los canales de recolección (BL1 y BL3) durante la configuración inicial.
  4. Mezcle una muestra tratada con simulacros de 24 μL con una muestra de 24 μL de 1000 mM tratada con peróxido de hidrógeno o muerta por calor.
  5. Divida la muestra mixta de células vivas y muertas en tres tubos de 16 μl cada uno. Tiña los tres tubos con (1) 2 μL de SYTO 9 y 2 μL de agua durante 30 min; (2) 2 μL de PI y 2 μL de agua durante 30 min; (3) 2 μL SYTO 9 y 2 μL PI durante 30 min. Siga el protocolo de tinción de la sección anterior.
    1. Después de la incubación, agregue 200 μL de tampón salino estéril al 0,85% a cada tubo. Ahora están listos para la citometría de flujo.
  6. Tubo de funcionamiento (1) para ajustar el voltaje del canal de fluorescencia verde (BL1); luego ejecute el tubo (2) para ajustar el voltaje de la fluorescencia roja (BL3). El objetivo es que el modo de distribución de intensidad de cada canal sea ~ 104-10 5 para utilizar el rango dinámico completo del instrumento.
    NOTA: Siga las instrucciones de su citómetro de flujo específico al ajustar los voltajes. Algunos citómetros de flujo tienen voltajes fijos y se omite este paso.
  7. Ejecute el tubo (3) para verificar si las poblaciones de células vivas y muertas están bien separadas. Ajuste los voltajes de los canales BL1 o BL3 si es necesario.
    NOTA: Se utilizó un voltaje de 200 mV para los canales BL1 y BL3 en Attune NxT.
  8. Ejecute la muestra tratada simuladamente sin teñir con los ajustes de voltaje establecidos para asegurarse de que la muestra tenga una autofluorescencia mínima en los canales de interés (<102).

4. Ejecución de muestras en el citómetro de flujo

  1. Aplique la configuración del citómetro de flujo establecida anteriormente y ejecute primero la muestra sin teñir para asegurarse de que las señales de autofluorescencia estén por debajo de 102 en los canales BL1 y BL3.
  2. Agregue 200 μL de tampón salino al 0,85 % a cada muestra teñida y ejecútelo en el citómetro de flujo.
    NOTA: Si se analizan varias muestras, escalone el paso de tinción de modo que cada muestra se tiña durante 30 min antes de ejecutarla en el citómetro de flujo.
  3. Exporte la salida de citometría de flujo como archivos .fcs (estándar FCS 3.0 o 3.1).

5. Análisis de datos en R

NOTA: Se proporciona un script de análisis de muestra como archivo complementario 1. Se proporcionan ejemplos de estrategias de activación en la sección Resultados representativos.

  1. Instale y cargue los paquetes necesarios: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importe archivos .fcs en el entorno de R actual.
  3. Ajuste los nombres de los archivos y especifique las condiciones de tratamiento.
  4. Haga un gráfico de densidad 2D para todos los eventos en FSC. H contra SSC.H. Utilice una puerta de polígono para excluir eventos que no sean de celda. Nombra esta puerta "celdas".
    NOTA: En ciertos citómetros de flujo, se recomienda el parámetro Área sobre Altura. Consulte las recomendaciones específicas del instrumento.
  5. Para la población cerrada de "celdas", haga un gráfico de densidad 2D en FSC. H contra FSC.W. Por lo general, se ven dos grupos con rangos similares de FSC. H pero diferente FSC.W. El conglomerado con una media más baja de FSC. El nivel W contiene las celdas individuales ("singletes"). Dibuja una puerta poligonal para seleccionarlos y nombra la puerta "singlets".
  6. Para la población cerrada de "singletes", haga un gráfico de densidad 2D en BL1. H frente a BL3.H. Dibuje puertas de polígono para poblaciones vivas, dañadas y muertas en función de los controles de células vivas y muertas. Se proporciona un ejemplo en la sección Resultados representativos.
  7. Determina la supervivencia utilizando los porcentajes de cada población y exporta las estadísticas.

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Resultados

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La tinción SYTO 9/PI distingue las células de levadura vivas de las células muertas en función de sus señales de fluorescencia en los canales verde (500 nm-560 nm) y rojo (>600 nm). Las células vivas, que solo acumulan SYTO 9, emiten fluorescencia fuerte en el canal verde, con señales rojas mínimas. Las células muertas acumulan tanto SYTO 9 como PI y se espera que emitan fluorescencia fuerte en el canal rojo, con señales de fluorescencia verde más bajas e...

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Discusión

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Este protocolo describe un ensayo LIVE/DEAD utilizando dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y PI, y utilizando citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en levaduras. Si bien estas dos tinciones se han aplicado para evaluar la supervivencia en varias especies de levaduras en la literatura y están disponibles como un kit comercial, ni el manual del fabricante ni la literatura proporcionan suficientes detalles sobre el protocolo de tinción o la configuración de cito...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al Dr. Michael Dailey y al Centro Carver de Imágenes por su capacitación y apoyo para la microscopía. Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y actuales del Laboratorio de Regulación Genética por sus valiosos comentarios sobre el protocolo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de pozo profundo de 96 pozosThermo Fisher278606NUNC 96
Citómetro de flujo Attune NxT con lector de placasThermo Fisher A24858A24858Automuestreador (A42901)
Candida glabrataCG99, cepa de laboratorio derivada de un aislado clínico (Cormack & Falkow, 1999)
Kit de levadura VIVA/MUERTA de FungaLightThermo Fisher A24858L34952Contiene SYTO 9 (3,34 mM) y yoduro propidio (20 mM). Estos dos componentes también pueden adquirirse por separado a varios proveedores.
Peróxido de hidrógenoSigma AldrichH1009
Microscopio Leica Confocal SP8LeicaTCS SP8 X
Cloruro de sodioSigma AldrichS9888Se usa para hacer una solución esterilizada de NaCl al 0,85%
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidosSigma AldrichY0626se utiliza para elaborar el medio sintético completo con una mezcla de glucosa al 2% y aminoácidos

Referencias

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