Este estudio optimiza un método de extracción de ARN basado en fenol caliente para Mycobacterium, obteniendo ARN de alta calidad adecuado para análisis transcriptómicos. Al compararlo con TRIzol y RNeasy en condiciones idénticas, el método proporcionó un mayor rendimiento, integridad comparable y una eficiencia de costos mejorada, ofreciendo una alternativa práctica para estudios a gran escala de expresión génica.
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Artículo de método
Extracción de ARN optimizada basada en fenol caliente de micobacterias: un enfoque robusto para el análisis fiable de la expresión génica
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Resumen
Resumen
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sigue siendo una amenaza importante para la salud global, lo que subraya la necesidad de estudios transcriptómicos confiables para comprender su biología y los mecanismos de resistencia a fármacos. Dichos análisis dependen de la obtención de ARN de alta calidad y alto rendimiento. Aunque existen varios métodos de extracción de ARN, muchos requieren reactivos costosos, grandes volúmenes de cultivo o equipos especializados, lo que limita su idoneidad para estudios a gran escala, especialmente en entornos con recursos limitados. Aquí se presenta un método optimizado de extracción de ARN basado en fenol caliente, diseñado específicamente para micobacterias. El método utiliza un volumen mínimo de cultivo y reactivos comúnmente disponibles para obtener de forma consistente ARN de alta calidad, adecuado para aplicaciones transcriptómicas de alto rendimiento. La cantidad y la integridad del ARN se evaluaron mediante electroforesis en gel y análisis de integridad del ARN (RIN), y su idoneidad para aplicaciones posteriores se confirmó mediante qPCR y Qubit 4. Para evaluar el desempeño del método optimizado, se realizó una extracción paralela de ARN utilizando TRIzol y RNeasy en condiciones experimentales idénticas, incluyendo la misma especie de Mycobacterium, volumen de cultivo, fase de crecimiento (logarítmica y estacionaria) y condiciones de lisis. Esto permitió una comparación directa de rendimiento, calidad, viabilidad y costo. El método optimizado de fenol caliente mostró un rendimiento y calidad de ARN comparables o superiores, reduciendo significativamente el costo de los reactivos y la dependencia de equipos especializados. Debido a su eficiencia, reproducibilidad y bajo costo, este protocolo ofrece una alternativa práctica para estudios a gran escala de expresión génica y transcriptómicos en Mtb y otras especies de micobacterias.
Introducción
M. tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), sigue siendo la principal causa de muerte por un solo patógeno infeccioso, superando al VIH/SIDA. En 2024, la TB provocó aproximadamente 1,3 millones de muertes en todo el mundo1. Esta carga se ve agravada por la creciente prevalencia de cepas resistentes a múltiples fármacos (MDR) y resistentes de forma extensa a los fármacos (XDR). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de comprender la base molecular de la patogénesis de la TB e identificar nuevos objetivos terapéuticos2.
El perfilado transcripcional de Mtb se ha convertido en una herramienta importante para elucidar los elementos funcionales implicados en las interacciones huésped-patógeno3, la adaptación al estrés ambiental4 y los mecanismos subyacentes a la resistencia a fármacos5. Metodologías avanzadas como la PCR en tiempo real, las microarrays y la secuenciación de ARN (ARN-seq) han mejorado significativamente la capacidad de analizar el transcriptoma micobacteriano6. Sin embargo, el éxito de estos métodos depende en gran medida de la disponibilidad de ARN de alta calidad, lo cual a su vez depende de una lisis celular eficiente durante la extracción. La pared celular compleja de Mtb, compuesta por micolil–arabinogalactano–peptidoglucano, hace que la extracción de ARN sea particularmente difícil7. Las técnicas de lisis existentes, incluyendo la hidrólisis enzimática8, la sonicación9 y el batido con perlas10, a menudo requieren equipos costosos y grandes volúmenes de cultivo, lo que limita su practicidad en muchos laboratorios BSL-3. Además, la tasa de crecimiento lento de Mtb requiere tiempos prolongados de cultivo para obtener suficiente biomasa11.
Para superar estas limitaciones, se desarrolló un método optimizado de extracción de ARN basado en fenol caliente que es rápido y económico. Utilizando solo 3 mL de cultivo en fase logarítmica media, el método proporciona entre 45 y 60 µg de ARN de alta calidad, adecuado para análisis transcripcionales posteriores. La lisis celular se logra mediante un molinillo de tejidos portátil y compacto, junto con reactivos fácilmente disponibles, eliminando la necesidad de instrumentos costosos. Aunque el método de fenol caliente ya ha sido descrito previamente11,12, la versión optimizada mejora la comodidad, la rentabilidad y el rendimiento de ARN. La optimización se realizó utilizando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) y se validó con éxito con Mtb H37Rv.
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Protocolo
Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cultivo de Mycobacterium
- Inocular 1 mL del stock de glicerol de Msmeg o Mtb en 10 mL de medio Middlebrook 7H9 suplementado con 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 y 10% de ADC a 37 °C con agitación a 150 rpm hasta que la DO alcance 1–1,5.
- Crecer la cultura secundaria añadiendo 1% de la cultura primaria en 10 mL de medio 7H9 hasta la fase logarítmica media, con una DO600nm = 0,6–0,7.
- Dividir en alícuotas de 3 mL y centrifugar los cultivos a 2000 x g durante 5 min a temperatura ambiente (23–25 °C).
- Almacenar los pellets a -80 °C hasta la extracción de ARN.
ADVERTENCIA: Para cultivos de Mtb, seguir las pautas adecuadas de BSL3 e inactivar por calor el pellet a 95 ˚C durante 20–25 min.
NOTA: Figura 1 muestra el diagrama de flujo de los pasos básicos seguidos durante la extracción de ARN mediante el método de fenol caliente.
Figura 1: Una representación esquemática del método de fenol caliente y su análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Extracción de ARN
- Método del fenol caliente (método HP)
- Añada 200 µL de tampón TES (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanol) al pellet celular y resuspenda el pellet mediante vortex.
- Añada aproximadamente 0,1 g de perlas de sílice de 0,1 mm a la muestra. Utilice un homogenizador manual de tejidos durante 10–15 s hasta que el pellet se descongele completamente sobre hielo. Repita este paso durante 2 ciclos más, seguido de congelación rápida en nitrógeno líquido tras cada repetición.
- O utilice un ruptor de perlas de alta velocidad de banco durante 1 min a la velocidad de 5 (5,0 m/s) a temperatura ambiente. Repita este paso durante 3 ciclos e incube la muestra sobre hielo para evitar el calentamiento tras cada ciclo.
NOTA: Repita la lisis de células de Mtb durante 6–8 ciclos (cada ciclo durante 1 min) con un homogenizador manual de tejidos o un ruptor de perlas, y enfríe intermitentemente sobre hielo tras cada ciclo. Utilice agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato) para la preparación de todos los tampones y reactivos necesarios para la extracción de ARN. - Añada 200 µL adicionales de tampón TES (precalentado a 65 °C) a cada muestra para completar un volumen de 400 µL. A cada muestra, añada 200 µL de fenol ácido (fenol equilibrado con tampón citrato 100 mM, pH 4,5) y 200 µL de cloroformo (mezcle el fenol ácido y el cloroformo en relación 1:1 antes de añadirlo a la muestra).
- Incube la muestra a 65 °C en un bloque térmico con agitación a 900 rpm durante 30 min y centrifugue a 12000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Asegúrese de una correcta separación de fases tras la centrifugación (se observará una fase acuosa superior clara que contiene ARN, una interfase definida de ADN y una fase orgánica inferior que contiene proteínas y lípidos).
- Retire la capa superior de la fase acuosa y transfiera a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Añada nuevamente un volumen igual de fenol ácido:cloroformo. Centrifugue a 12.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Asegúrese de una correcta separación de fases.
- Transfiera la capa acuosa superior a un tubo microcentrífugo fresco de 1,5 mL, luego añada 30 µL de tampón de acetato de sodio 3 M, pH 5,3, y 240 µL de isopropanol frío. Incube a −80 °C durante 30 min a 1 h.
NOTA: El tubo microcentrífugo puede almacenarse durante la noche a -80 °C en este paso. Selle el tubo microcentrífugo con varias capas de parafilm para evitar que se abra a 65 °C durante la incubación.
ADVERTENCIA: El fenol y el cloroformo son sustancias químicas peligrosas; por lo tanto, debe utilizarse el equipo de protección personal (EPP) adecuado, controles de ingeniería como campanas extractoras y procedimientos específicos de eliminación de residuos. - Centrifugue a 12.000 x g durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de la formación del pellet y retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Resuspenda el pellet en 1 mL de etanol al 75% y centrifugue a 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Realice este paso dos veces y seque el pellet al aire.
- Resuspenda el pellet en 50 µL de agua libre de nucleasas.
NOTA: Para disolver el ARN, incúbelo en agua libre de ribonucleasas durante 10–30 min a temperatura ambiente.
- Método TRIzol
- Añada 200 µL de reactivo TRIzol al pellet celular.
ADVERTENCIA: TRIzol es una sustancia química peligrosa; por lo tanto, debe utilizarse el equipo de protección personal (EPP) adecuado, controles de ingeniería como campanas extractoras y procedimientos específicos de eliminación de residuos. - Siga el método de lisis celular descrito en los pasos 2.1.2 - 2.1.3.
- Añada 200 µL adicionales de reactivo TRIzol, seguido de 200 µL de cloroformo, y vortex durante 1 min. Centrifugue a 13.400 x g durante 15 min a 4 °C. Asegúrese de la correcta separación de fases tras la centrifugación.
- Transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
- Precipite el ARN añadiendo 500 µL de isopropanol a la fase acuosa e incube a −80 °C durante 30 min a 1 h.
- Forme el pellet del ARN mediante centrifugación a 15.000 x g durante 20 min a 4 °C. Observe cuidadosamente el pellet y retire el sobrenadante sin perturbarlo.
- Resuspenda el pellet con 1 mL de etanol al 75% y centrifugue a 13.400 x g durante 1 min a 4 °C. Repita este paso dos veces, seque el pellet al aire durante 30 min a temperatura ambiente y resuspenda en 50 µL de agua libre de nucleasas.
- Añada 200 µL de reactivo TRIzol al pellet celular.
- Método con kit comercial de extracción de ARN
- Resuspenda el pellet celular en 200 µL de tampón de resuspensión (incluido en el kit).
- Siga el método de lisis celular descrito en los pasos 2.1.2 - 2.1.3.
- Realice el experimento subsiguiente según las instrucciones del fabricante.
3. Tratamiento con DNasa, cuantificación y visualización
- Para eliminar la contaminación con ADN genómico, añada 1 µL de DNasa I (10 unidades) y 5 µL de tampón RDD (1x) a cada muestra de ARN e incube a temperatura ambiente durante 30 min.
- Cuantifique la muestra de ARN espectrofotométricamente utilizando Nanodrop y la integridad del ARN utilizando un Qubit4. El valor aceptado de RIN se encuentra entre 7,5 y 10. Los valores aceptados de A260/A280 y A260/A230 están en el rango de 1,8 a 2,0 y de 2,0 a 2,2, respectivamente.
- Visualice el ARN en un gel de agarosa al 1% utilizando colorante de carga para ARN 1X.
4. Síntesis de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real
- Prepare una reacción de 20 µL para la preparación de ADNc utilizando el kit de Transcripción Reversa de ADNc y 1 µg de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante en un termociclador.
- Prepare una reacción de PCR en tiempo real de 10 µL utilizando 50 ng de ADNc, 0,4 µM de cada cebador y SYBR según las instrucciones del fabricante. Ejecute la muestra en el termociclador de PCR en Tiempo Real.
NOTA: Se utilizaron los siguientes cebadores para el análisis de qPCR:
Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'
5. Análisis estadístico
- Realice la prueba de Student prueba t con todos los réplicas biológicas utilizando Graph Pad Prism, P ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Las barras de error representan el error estándar de al menos tres réplicas biológicas.
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Resultados
Calidad y rendimiento del ARN
La calidad y cantidad de ARN se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). Se observaron bandas distintas y nítidas correspondientes al ARNr 23S y 16S con todos los métodos de extracción, lo que confirma el aislamiento exitoso de ARN total. Los métodos de fenol caliente y TRIzol mostraron tres bandas claras que representan el ARNr 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) y 5S (~120 pb), lo ...
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Discusión
Para desarrollar un método sencillo y robusto de extracción de ARN para Mycobacterium, se optimizó el método de fenol caliente. Posteriormente, se comparó el ARN extraído con dos métodos ampliamente utilizados: TRIzol y un método basado en columnas12,13. Estas técnicas se compararon según el rendimiento, pureza, integridad, costo y tiempo de procesamiento del ARN, con el fin de evaluar su practicidad para aplicaciones moleculares posteriores. Tanto el mé...
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Divulgaciones
No hubo conflictos de intereses entre los autores. Todos los autores han aprobado la presentación.
Agradecimientos
Me gustaría agradecer el apoyo del Departamento de Biotecnología (DBT), el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR) y la Junta de Investigación en Ciencias e Ingeniería (SERB).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Perlas de sílice de 0,1 mm | MP Biomedicals | MP116911050 | |
| 2-propanol | Sigma | 278475 | |
| Bead Ruptor 4 | revvity | ||
| Cloroformo | Sigma | 288306 | |
| Centrífuga fría | ThermoScientific | 42541217 | |
| DNasa I | qiagen | 79254 | |
| EDTA | sigma | E02SS | |
| HCl | SRL | 62889 | |
| Bloque térmico | MIULAB | MU-E02-1049 | |
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad | Thermo Fischer Scientific | 4368814 | |
| Molinillo de tejidos accionado por motor G10 | Coron | G22616008 | |
| NaCl | sigma | S5886 | |
| Nanofotómetro N50 | IMPLEM | T51601 | |
| Fenol equilibrado con tampón de citrato 0,1 M, pH 4,5 | Sigma | P4682 | |
| PowerUP SYBR | Applied Biosystems | A25742 | |
| Fluorímetro Qubit 4 | Invitrogen | 2.32262E+12 | |
| Ciclador térmico para PCR en tiempo real | Analytik Jena AG | 844-00503-2 | |
| Kit RNA easy | Qiagen | 74104 | |
| SDS | Sigma | S9888 | |
| Acetato de sodio | Sigma | S2889 | |
| Ciclador térmico | Biorad | 621BR29739 | |
| Reactivo TRI | Sigma | T9424 | |
| Base de Tris | Himedia | MB029 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | 516732 |
Referencias
- Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
- Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
- Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
- Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
- Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
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- Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
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Reimpresiones y permisos
