Este protocolo presenta un método para evaluar la apoptosis mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por compuestos naturales en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este protocolo presenta un método para evaluar la apoptosis mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por compuestos naturales en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Este estudio explora el potencial anticancerígeno de Pileostegia tomentella, con un enfoque particular en su capacidad para inducir la apoptosis clásica en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) H1299 a través de vías mediadas por especies reactivas de oxígeno (ROS). Utilizando un enfoque de aislamiento guiado por bioactividad, se identificaron dos compuestos activos, umbeliferona (UMB) y epi-Vogelósido, como los principales componentes citotóxicos. Ambos compuestos exhibieron efectos inhibidores significativos sobre la viabilidad celular y desencadenaron efectivamente la muerte celular apoptótica en células H1299. Las investigaciones mecanicistas demostraron que el tratamiento con UMB y epi-vogelósido condujo a un marcado aumento en los niveles de ROS intracelulares, lo que implica al estrés oxidativo como un mediador clave. El análisis de Western blot reveló un aumento de los niveles de caspasa-3 escindida y una disminución de la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2, lo que indica la activación de la vía apoptótica mitocondrial intrínseca. Además, el perfil transcriptómico mostró alteraciones generalizadas en la expresión génica, lo que respalda aún más la interrupción de la homeostasis celular. Estos resultados sugieren que Pileostegia tomentella y sus componentes activos son prometedores como posibles agentes terapéuticos para el cáncer de pulmón.
El cáncer presenta un formidable desafío de salud pública mundial, caracterizado por una tasa de mortalidad anual sustancial. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM) es el principal impulsor mundial de las muertes relacionadas con el cáncer, constituyendo aproximadamente el 85% de las incidencias de cáncer de pulmón1. La carcinogénesis, una interacción intrínsecamente compleja de procesos moleculares y celulares, está críticamente influenciada por las interrupciones en la homeostasis de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS, que incluyen oxidantes inestables como los aniones superóxido, los radicales hidroxilo y el peróxido de hidrógeno, son subproductos del metabolismo celular normal y ejecutan funciones esenciales en la señalización, proliferación, diferenciación y apoptosis2. Un desequilibrio en las concentraciones de ROS puede precipitar el estrés oxidativo, activando potencialmente las vías de muerte celular programadas, en particular la autofagia y la apoptosis, impidiendo así la proliferación y supervivencia de las células cancerosas3. En consecuencia, las ROS exhiben un doble papel en oncología, actuando como promotores y supresores de la progresión tumoral. En la última década, las estrategias terapéuticas para el CPCNP han avanzado significativamente, con el desarrollo de nuevos agentes anticancerígenos diseñados para explotar esta naturaleza dicotómica de las ROS, lo que representa un área de investigación particularmente vibrante4.
Se sabe que numerosos agentes anticancerígenos sintetizados químicamente, como la adriamicina (doxorrubicina), el cisplatino y la ciclofosfamida, inducen la apoptosis en las células cancerosas al promover la producción de ROS5. A pesar de los avances en las terapias dirigidas y los anticuerpos inmunoterapéuticos, la quimioterapia basada en platino sigue siendo la piedra angular del tratamiento para los pacientes con CPNM. Sin embargo, la aparición de resistencia y efectos secundarios adversos de la quimioterapia requiere el desarrollo de nuevos fármacos contra el CPCNP. En consecuencia, la exploración de fuentes naturales de compuestos anticancerígenos es cada vez más reconocida por su importancia y potencial. Investigaciones recientes han destacado que ciertos extractos de plantas y sus componentes activos exhiben potentes propiedades anticancerígenas, caracterizadas por baja toxicidad, alta especificidad y la capacidad de dirigirse a múltiples vías6. En particular, algunos de estos compuestos naturales pueden modular los niveles y la señalización de ROS7, induciendo así la autofagia o apoptosis en las células cancerosas y ejerciendo efectos terapéuticos 8,9.
Pileostegia tomentella Mano. Zucc, una hierba perenne del género Clematis dentro de la familia Buttercupaceae, se encuentra predominantemente en regiones como Japón, Corea del Norte y China. Los diversos componentes de la planta, incluidas las raíces, los tallos, las hojas y las flores, son conocidos por sus propiedades medicinales, que ofrecen beneficios como la eliminación del calor, la desintoxicación, la reducción de la hinchazón, el alivio del dolor y los efectos antibacterianos y antiinflamatorios. Investigaciones recientes han arrojado luz sobre las actividades anticancerígenas de los extractos o ingredientes activos de Hoshi Hairy Vine, demostrando efectos supresores de tumores en una variedad de cánceres, incluidos el glioma, el cáncer de mama, colon y cuello uterino10. Sin embargo, los mecanismos anticancerígenos específicos de Pileostegia tomentella, en particular su papel potencial en la modulación de ROS para inducir autofagia o apoptosis en células cancerosas, permanecen en gran medida inexplorados.
A pesar del interés emergente en los compuestos naturales para la terapia del cáncer, los mecanismos proapoptóticos de los componentes clave de Pileostegia tomentella en el cáncer de pulmón siguen sin explorarse. Este estudio es pionero en la identificación y disección mecanicista de umbeliferona y epi-vogelósido como inductores selectivos de apoptosis dependientes de ROS en NSCLC.
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Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Composición química de Pileostegia tomentella y predicción del objetivo del CPNM
Los componentes químicos de Pileostegia tomentella se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución combinada con espectrometría de masas Orbitrap con trampa de iones lineal (HPLC-LTQ/MS). Los extractos se disolvieron en disolventes apropiados y se filtraron antes de la inyección. La separación cromatográfica se logró utilizando una columna de fase inversa bajo un programa de elución de gradiente adaptado a las clases de compuestos. Los datos de espectrometría de masas se recopilaron en modo de ionización por electropulverización positiva en un rango de masas de 100-1500 m / z. Las estructuras moleculares de los compuestos identificados se dibujaron utilizando un software genérico de dibujo químico y se guardaron en formato SDF. Estos archivos estructurales se enviaron a una herramienta de predicción de objetivos en línea para identificar posibles objetivos biológicos, y los 20 objetivos principales se seleccionaron para su posterior validación. Los objetivos asociados al NSCLC se recuperaron de una base de datos de genes de acceso público. Los objetivos superpuestos de ambos conjuntos de datos se identificaron como posibles objetivos terapéuticos de Pileostegia tomentella.
2. Construcción de redes componente-objetivo
Los datos de interacción proteína-proteína para los objetivos predichos se obtuvieron de una base de datos de interacción de proteínas de acceso abierto. Los datos de interacción se importaron al software de visualización de red general para construir la red de interacción compuesto-objetivo. Las propiedades topológicas de la red, incluida la centralidad de grado, la intermediación y la cercanía, se analizaron utilizando herramientas analíticas integradas para identificar nodos reguladores clave.
3. Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG
El enriquecimiento funcional de las proteínas diana predichas se realizó mediante el análisis de la vía KEGG a través de herramientas de enriquecimiento disponibles públicamente y software estadístico. Las vías con valores de p ajustados inferiores a 0,05 se consideraron significativas. Se integraron vías significativas con datos de objetivos compuestos para construir una red de interacción "camino objetivo-compuesto mediante software genérico de visualización de redes. El análisis de la topología de la red destacó los principales centros reguladores biológicos, ilustrando los mecanismos multicomponente y multiobjetivo de Pileostegia tomentella.
4. Extracción de componentes de Pileostegia tomentella
Los tallos secos de la vid de Corydalis spinosa se molían hasta obtener un polvo fino. El material en polvo se extrajo con etanol al 70% bajo tratamiento ultrasónico a temperatura ambiente durante un período definido. El extracto crudo se filtró y concentró a presión reducida. La partición líquido-líquido se realizó utilizando disolventes de polaridad creciente, incluidos éter de petróleo, acetato de etilo y n-butanol. La fracción de acetato de etilo, que mostró la mayor actividad biológica en los ensayos preliminares, se recolectó, concentró, liofilizó y almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.
5. Línea celular y condiciones de tratamiento
La línea celular de cáncer de pulmón humano H1299 se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. Las células se sembraron a una densidad adecuada y se dejaron adherir durante la noche antes del tratamiento. Las células se expusieron a concentraciones variables (500 μg/ml, 750 μg/ml y 1.000 μg/ml) de dos compuestos de prueba, UMB y epi-vogelósido, como se indica en la Tabla 1. Después de 24 h de incubación en condiciones de cultivo estándar, las células se recolectaron para análisis posteriores para evaluar los efectos biológicos de los compuestos.
6. Ensayo MTT para la viabilidad celular
Los efectos citotóxicos de los compuestos se evaluaron mediante un ensayo colorimétrico MTT. Las células H1299 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad definida y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, las células se trataron con los compuestos de prueba durante 72 h en condiciones de cultivo estándar. Después del tratamiento, se agregó una solución de MTT a cada pocillo y se incubó para permitir que las células viables convirtieran el MTT en cristales de formazán púrpura insolubles. Después de la incubación, se retiró el medio y los cristales de formazán se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. Los valores de absorbancia corresponden a la viabilidad celular, lo que proporciona una evaluación cuantitativa de la citotoxicidad del compuesto.
7. Evaluación de la integridad de la membrana mediante la liberación de LDH
La integridad de la membrana celular se evaluó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) como indicador de citotoxicidad. Las células H1299 se trataron con los compuestos de prueba durante 24 h, 48 h o 72 h. En cada punto de tiempo, se recolectaron sobrenadantes de cultivo y se sometieron a un ensayo de actividad de LDH de acuerdo con el protocolo del fabricante. Dado que la LDH se libera solo de las células con membranas dañadas, los valores de absorbancia medidos reflejan la extensión del daño de la membrana inducido por los compuestos a lo largo del tiempo.
8. Análisis de citometría de flujo de la apoptosis
La inducción de la apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo mediante tinción de anexina V y 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Después del tratamiento con los compuestos de prueba, las células H1299 se recolectaron por centrifugación, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato frío y se resuspendieron en tampón de unión. Luego, las células se incubaron con anexina V conjugada con un colorante fluorescente y 7-AAD de acuerdo con el protocolo de tinción. Las muestras se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Este método permitió la diferenciación entre células viables (sin teñir), células apoptóticas tempranas (anexina V positiva, 7-AAD negativa) y células apoptóticas o necróticas tardías (positivas para ambas tinciones).
9. Cuantificación de ROS intracelular
Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares se midieron mediante un ensayo basado en fluorescencia. Las células H1299 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 × 105 células por pocillo y se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia. A continuación, las células se trataron con los compuestos designados durante 72 h. Después del tratamiento, las células se incubaron con 1 μM de la sonda fluorescente sensible a ROS 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Después de la incubación, se recolectaron células y se midió la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 525 nm utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia corresponde a los niveles de ROS intracelulares.
10. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Las células H1299 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 células por pocillo y se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia. A continuación, las células se trataron con los compuestos designados durante 72 h. El ARN total se extrajo utilizando un método de fenol-cloroformo ampliamente utilizado. La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó utilizando un kit de transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real con cebadores específicos (enumerados en la Tabla 2). Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método Ct comparativo, con genes de limpieza utilizados como controles internos.
11. Inmunotransferencia para la expresión de proteínas
Se realizó un análisis de Western blot en células H1299 cultivadas y tratadas. La proteína total se extrajo utilizando un tampón de lisis apropiado y los lisados se clarificaron por centrifugación a 10.000 × g durante 15 min a 4 °C. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un ensayo espectrofotométrico. Cantidades iguales de proteína de cada muestra se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con leche en polvo descremada al 5% durante 2 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios específicos para Bcl-2, caspasa-3, PARP1, BAX, GAPDH y Tubulina en diluciones optimizadas. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados durante 2 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron y obtuvieron imágenes utilizando un sustrato quimioluminiscente. El análisis densitométrico se realizó con software de análisis de imágenes y las intensidades de banda se normalizaron a GAPDH y Tubulina como controles de carga.
12. Microscopía de inmunofluorescencia de Caspasa-3
La expresión y localización subcelular de caspasa-3, una proteína apoptótica clave, se evaluaron mediante tinción de inmunofluorescencia. Después del tratamiento, las células H1299 se fijaron con paraformaldehído, se permeabilizaron con una solución detergente suave y se incubaron con un anticuerpo primario contra la caspasa-3. Luego se aplicó un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia para detectar la señal de anticuerpo primario. Los núcleos celulares se contratiñeron con un tinte fluorescente de unión al ADN. Las células teñidas se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. La intensidad y la distribución celular de la señal de fluorescencia proporcionaron información cualitativa y espacial sobre la activación de la caspasa-3, lo que respalda su participación en la respuesta apoptótica inducida por el compuesto.
13. Secuenciación transcriptómica
Para perfilar la respuesta transcripcional celular a los compuestos de prueba, se extrajo el ARN total de las células H1299 tratadas y se evaluó su integridad utilizando métodos estándar de control de calidad. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon siguiendo protocolos establecidos y se sometieron a secuenciación de alto rendimiento utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación. Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron a través de una tubería bioinformática convencional, que incluía filtrado de control de calidad, alineación con el genoma de referencia y cuantificación de la abundancia de transcripciones. Se realizó un análisis diferencial de la expresión génica para identificar genes con cambios estadísticamente significativos en la expresión después del tratamiento. Se realizaron análisis de enriquecimiento y vías de los genes expresados diferencialmente para dilucidar los procesos biológicos clave afectados por los compuestos, proporcionando así una visión transcriptómica completa de sus efectos moleculares.
14. Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística entre los grupos se determinó utilizando métodos estándar, incluida la prueba t de Student o ANOVA de una vía, cuando correspondía. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para valores de p inferiores a 0,05.
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Cribado de componentes clave de Pileostegia tomentella contra el cáncer de pulmón
En la Figura 1 se presenta una descripción general del diseño experimental. Se empleó HPLC-LTQ/Orbitrap MS para caracterizar siete componentes bioactivos principales presentes en Pileostegia tomentella (Tabla 3). Posteriormente, se realizó una predicción de objetivos in silico en estos compuestos utilizando la base de datos...
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El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) sigue siendo un problema de salud mundial apremiante, caracterizado por su biología agresiva, rápida progresión clínica y alto potencial metastásico, lo que con frecuencia resulta en malos resultados para los pacientes12. Aunque las intervenciones estándar, como la resección quirúrgica, la radioterapia y la quimioterapia, ofrecen un beneficio terapéutico en la enfermedad en estadio temprano, su efectividad disminu...
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Construcción de Disciplinas Clave de Alto Nivel de Medicina Tradicional China - Farmacia de Minorías Étnicas (Farmacia Zhuang) de la Administración Estatal de Medicina Tradicional China (No. zyyzdxk-2023165); el Programa de Cultivo de Talentos "Proyecto Juvenil" del Hospital Médico Internacional Zhuang de Guangxi (No. 2022001); el Proyecto de Equipo Multidisciplinario de Innovación Cruzada en Medicina China de Guangxi (No. GZKJ2309); el Programa de Equipo de Innovación de Cultivo de Talento de Alto Nivel de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guangxi (No. 2022A008); el Proyecto Clave de Investigación y Desarrollo del Departamento de Ciencia y Tecnología de Guangxi (No. Gui Ke AB21196057); el Plan de Acción Trienal 2023 para la Construcción del Equipo de Talentos de Alto Nivel del Hospital Médico Internacional Zhuang de Guangxi (Nos. GZCX20231203, GZCX20231202); el Tercer Lote del Programa de Cultivo de Equipos de Talentos de Alto Nivel "Proyecto Qihuang" de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guangxi (No. 202414).
CONTRIBUCIÓN DEL AUTOR:
Wen Zhong, Leimin Jiang y Bing Qing contribuyeron por igual a este trabajo y comparten la primera autoría. Fueron los principales responsables del diseño experimental, la adquisición de datos y la interpretación de los resultados. Xiumei Ma realizó análisis de datos y contribuyó a la preparación del manuscrito. Shi Xianyi, Deng Qingmei y Zhou Guangyun participaron en el diseño del estudio, la recopilación de datos y la investigación bibliográfica. Jiangcun Wei, el autor correspondiente, supervisó el análisis y la interpretación de los datos y desempeñó un papel destacado en la redacción y revisión del manuscrito.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anexión V– Kit de detección de apoptosis PE / 7-AAD | BD Biociencias | 556547 | Detección de apoptosis basada en citometría de flujo |
| Anticuerpo: BAX | Abcam | AB32503 | Western blot para proteína proapoptótica |
| Anticuerpo: Bcl-2 | Abcam | AB182858 | Western blot/inmunofluorescencia |
| Anticuerpo: Caspasa-3 escindida | Abcam | AB32042 | Western blot / IF |
| Anticuerpo: GAPDH | Abcam | AB8245 | Control interno en Western blot |
| Anticuerpo: PARP1 | Abcam | AB32064 | Western blot para marcador de apoptosis |
| Anticuerpo: Tubulina | Abcam | AB78078 | Control interno en Western blot |
| ChemDraw | Informática PerkinElmer | CCG821391 | Dibujo de estructuras de moléculas pequeñas |
| Sistema de imágenes de quimioluminiscencia | Ciencia de Tanon y Tecnología | Tanon 5200 | Para visualizar bandas de proteínas |
| Citopaisaje | Cytoscape.org | https://cytoscape.org | Construcción y análisis de redes |
| Tinción nuclear DAPI | Sigma | D9542 | Contratinción nuclear azul para IF |
| DAVID | NIH | https://david.ncifcrf.gov | Anotación funcional y enriquecimiento de la vía KEGG |
| DMSO | Sigma | MFCD00002089 | Se utiliza para disolver cristales de formazán |
| Etanol (para extracción) | Sigma | MFCD00003568 | Disolvente de extracción asistido por ultrasonidos |
| Acetato de etilo | Sigma | MFCD00009171 | Se utiliza para el fraccionamiento bioactivo |
| Anticuerpo secundario conjugado con FITC | Abcam | AB6785 | Utilizado en inmunofluorescencia |
| Citómetro de flujo | Thermo Scientific | A29001 | Se utiliza para la detección de apoptosis y ROS |
| Microscopio de fluorescencia | Corporación Olympus | BX53F | Para obtener imágenes de portaobjetos de inmunofluorescencia |
| Liofilizador | Corporación Labconco | 7670520 | Para liofilización y conservación de muestras |
| Tarjetas genéticas | Instituto Weizmann | https://www.genecards.org | Base de datos de genes para la relevancia de la enfermedad |
| Espectrometría de masas HPLC-LTQ-Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAVFACZMAIK | Identificación de compuestos por MS |
| Plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq | Illumina Inc. | 20012850 | Se utiliza para RNA-seq |
| Kit de ensayo de citotoxicidad LDH | Tiempo de beyo. | C0016 | Para medir la liberación de LDH como indicador de citotoxicidad |
| Lector de microplacas | Thermo Scientific | VL0000D0 | Para mediciones de absorbancia en ensayos MTT y LDH |
| Kit de ensayo de viabilidad celular MTT | Beyotime | C0009S | Se utiliza para el ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular |
| Máquina qPCR | Thermo Scientific | 4485701 | Para el análisis de la expresión génica |
| R software | Fundación R | https://www.r-project.org | Computación estadística y trazado de vías |
| Kit de transcripción inversa (RT Kit) | Vazyme | Documento IM201 | Para la síntesis de ADNc |
| Kit de preparación de la biblioteca RNA-seq | Illumina Inc. | 20020594 | Preparación de la biblioteca para la secuenciación |
| Predicción de objetivos suizos | Instituto Suizo | http://www.swisstargetprediction.ch | Herramienta de predicción de objetivos compuestos |
| Mezcla de qPCR SYBR Green | Vazyme | Pregunta 311-02 | Para PCR cuantitativa |
| Reactivo TRIzol (extracción de ARN) | Sigma | T3934 | Para la extracción de ARN total |
| Limpiador ultrasónico | Branson | M1800-CPXH | Para extracción asistida por ultrasonidos |
| Aparato Western Blot | Thermo Scientific | Referencia A56727 | Electroforesis en gel y transferencia de proteínas |
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