Visualizando al guardián: evaluación basada en el tinte azul de Evan de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en peces cebra adultos

Resumen

Este protocolo presenta un método confiable para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) en el modelo de pez cebra adulto (Danio rerio) utilizando la evaluación basada en colorantes azules de Evan, lo que permite el análisis cualitativo y cuantitativo de la alteración neurovascular.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BBB) es una interfaz semipermeable que mantiene la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) regulando el movimiento de sustancias dentro y fuera del cerebro, protegiendo así el tejido neural de agentes potencialmente dañinos. La interrupción de la BHE es una característica bien establecida en muchas enfermedades neurodegenerativas, incluidas la enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Alzheimer (EA), donde el aumento de la permeabilidad contribuye y exacerba la progresión de la enfermedad. Aunque el pez cebra adulto (Danio rerio) es cada vez más reconocido como un modelo valioso para estudiar enfermedades neurodegenerativas, los métodos estandarizados para evaluar la integridad de la BHE en esta especie siguen siendo limitados. Este protocolo describe un enfoque simple, reproducible y rentable para evaluar la permeabilidad de la BHE en el pez cebra adulto mediante el análisis de la extravasación del colorante azul de Evan (EB) desde la neurovasculatura hasta el tejido cerebral. El método combina la visualización cualitativa con el análisis cuantitativo de imágenes de la distribución de EB para detectar la interrupción de la BBB. Los pasos clave incluyen la inyección intraperitoneal adecuada del tinte EB, la confirmación de la circulación sistémica del tinte, la disección cerebral cuidadosa y la medición consistente de imágenes e intensidad en escala de grises. Se incorporan controles positivos y negativos para validar la penetración del tinte y respaldar una interpretación precisa. Los resultados representativos demuestran una mayor extravasación de EB en los cerebros de pez cebra parkinsoniano en comparación con los controles inyectados con solución salina, lo que indica una mayor permeabilidad de la BBB. Esta técnica requiere un equipo especializado mínimo y es adecuada para laboratorios con recursos limitados. En general, este protocolo ofrece una herramienta práctica para investigar la integridad de la BBB en modelos de pez cebra adultos y se puede adaptar para diversas aplicaciones, incluidos estudios de mecanismos de enfermedades y la evaluación de intervenciones terapéuticas dirigidas a la función neurovascular.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BBB) es una interfaz fisiológica selectiva y semipermeable formada principalmente por células endoteliales cerebrales especializadas, apoyadas por pericitos y astrocitos, que regula el intercambio molecular entre el torrente sanguíneo y el espacio intersticial del cerebro para preservar el microambiente del Sistema Nervioso Central (SNC). Su integridad es esencial para preservar la homeostasis del SNC y proteger el tejido neural de sustancias nocivas o tóxicas¹. La alteración de la BHE es una característica patológica bien reconocida en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica ^2,3. La función de la BHE comprometida conduce a un aumento de la permeabilidad, lo que permite que los compuestos neurotóxicos y los mediadores inflamatorios se infiltren en el tejido cerebral, exacerbando así la progresión de la enfermedad⁴. Como tal, evaluar la integridad de la BBB es fundamental para obtener una visión más profunda de los mecanismos neurovasculares e inflamatorios subyacentes a estos trastornos.

Si bien los modelos in vivo de roedores e in vitro siguen siendo los estándares de oro para la investigación de la BHE⁵, el pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo de vertebrado valioso en neurociencia debido a su trazabilidad genética, rentabilidad, facilidad de manejo y características neuroanatómicas y de la BHE conservadas con mamíferos⁶. A pesar de su creciente uso en estudios neurodegenerativos, los métodos para evaluar la integridad de la BHE en el pez cebra adulto siguen siendo limitados ^7,8. Técnicas como las inyecciones de trazadores fluorescentes o los reporteros transgénicos se han utilizado ampliamente en larvas ^9,10, pero plantean desafíos significativos en adultos debido a la pigmentación y la disminución de la transparencia. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es establecer un protocolo simple, reproducible y visualmente demostrable para evaluar la permeabilidad de BBB en peces cebra adultos utilizando la extravasación de colorante azul de Evan (EB). Este método incorpora tanto la observación cualitativa como la medición cuantitativa de la fuga de tinte en el tejido cerebral, proporcionando una herramienta práctica para evaluar la integridad neurovascular en condiciones patológicas.

El colorante azul de Evan, que se une a la albúmina sérica y normalmente no puede atravesar la BBB¹¹ intacta, ofrece una alternativa factible para evaluar la alteración de la barrera¹². La extravasación de EB se ha aplicado ampliamente en modelos de roedores para detectar fugas de BBB en afecciones como lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular y neuroinflamación¹³. Sin embargo, su aplicación en el pez cebra adulto ha permanecido en gran parte inexplorada. Este estudio presenta una adaptación novedosa de la técnica de colorante EB optimizada para el pez cebra adulto, lo que permite una evaluación cualitativa y cuantitativa confiable de la permeabilidad de la BBB. El método es rentable, requiere un equipo especializado mínimo y se puede escalar fácilmente para múltiples animales, lo que ofrece una ventaja práctica sobre los enfoques más complejos basados en imágenes que se usan típicamente en larvas.

Usando este protocolo, evaluamos la integridad de BBB en peces cebra adultos sanos y parkinsonianos. Para inducir parkinsonismo en el pez cebra, se administró por vía intraperitoneal la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), siguiendo un método previamente descrito¹⁴. Los resultados revelaron una extravasación de EB significativamente mayor en los cerebros del pez cebra parkinsoniano, consistente con la interrupción bien documentada de la BBB observada en la EP. Estos hallazgos validan la sensibilidad y confiabilidad del método, lo que respalda su utilidad para vincular la patología vascular con los resultados moleculares y conductuales. Por lo tanto, esta técnica representa una herramienta valiosa para los investigadores que investigan las contribuciones neurovasculares a las enfermedades neurodegenerativas y puede aplicarse tanto en modelos genéticos como de pez cebra inducidos por toxinas.

Protocolo

Este protocolo fue seguido y permitido por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Islámica Internacional de Malasia (IIUM), con referencia a la aprobación de ética animal (ref. no.: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Prepare la solución madre de tinte azul Evans

1. Disuelva 0,1 g de colorante EB en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para preparar una solución madre al 1% (p/v). Mezclar bien hasta que el tinte se disuelva por completo.
   PRECAUCIÓN: EB está categorizado como carcinógeno de categoría 1B. Evite el contacto directo con la piel y los ojos. Use ropa protectora, guantes, gafas de seguridad y un respirador contra el polvo. Evite inhalar polvo y siga las instrucciones de manejo del fabricante. No deseche el tinte Evans Blue (sólido o solución) en el fregadero. Conserve los residuos en los envases originales etiquetados. Deseche de acuerdo con las regulaciones nacionales y locales de desechos peligrosos.
2. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,45 μm. Recoja el filtrado en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Envuelva el tubo en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C.
   NOTA: También se puede utilizar un filtro de tamaño de poro más pequeño (por ejemplo, 0,2 μm). La solución madre se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas, o a -20 ° C durante un mes, y se recomienda la alícuota para minimizar los ciclos repetidos de congelación y descongelación cuando se almacena congelada.

2. Administrar el tinte Evans Blue al pez cebra adulto

1. Anestesiar al pez cebra mediante shock hipotérmico bajando gradualmente la temperatura del agua de 12 °C a 7 °C, hasta que el pez ya no responda a los estímulos táctiles.
   NOTA: La reducción gradual de la temperatura se puede lograr agregando pequeñas cantidades de hielo picado al agua lentamente durante varios minutos, lo que permite que la temperatura disminuya progresivamente. La inmersión en tricaína también es un método anestésico alternativo adecuado.
2. Inyecte 20 μL de colorante EB al 1% en la cavidad intraperitoneal (IP) con una jeringa de insulina de 31 G. Aplique una presión suave en el lugar de la inyección durante 10 s para evitar el reflujo.
   NOTA: La cavidad intraperitoneal del pez cebra se encuentra posterior a la cintura pélvica. Para aumentar la tasa de éxito de la administración de EB, ayune los peces durante 24 h antes de la inyección. Esto vaciará la cavidad abdominal para proporcionar un mejor acceso y precisión al espacio intraperitoneal.
3. Transfiera el pescado a un tanque de recuperación y deje que se recupere durante 30 min. Monitoree las lesiones, la mortalidad o los cambios de comportamiento.
   NOTA: Para ayudar al pez cebra con la recuperación, use una temperatura del agua ligeramente reducida (20-24 ° C) para que el tanque de recuperación proporcione un efecto anestésico suave y ayude a adormecer las posibles molestias posteriores a la inyección. Los peces inyectados exhibirán un tono azul, lo que indica una circulación exitosa del tinte (Figura 1).
4. Después de 30 min, sacrificar a los peces mediante shock hipotérmico a 1 °C a 3 °C. Luego, decapita al pez con una cuchilla estéril o unas tijeras quirúrgicas.
   NOTA: Para ayudar en la disección cerebral más adelante, deje carne extra detrás de la cabeza al decapitar.
5. Enjuague la cabeza dos veces en 1x PBS (proporción de pescado a PBS de 1:20) para eliminar el exceso de sangre y el tinte EB.
   NOTA: Un lavado insuficiente puede dar lugar a resultados falsos positivos y comprometer la precisión del análisis. Para evitar esto, lave bien el tejido cerebral al menos dos veces con 1x PBS, asegurándose de eliminar toda la sangre visible y el tinte que fluye libremente. Si queda algún resto de tinte, se recomienda encarecidamente un tercer lavado.
6. Fije la cabeza en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 ° C durante la noche (proporción de pescado a fijador de 1:20). No se requiere agitación durante la fijación, ya que el pequeño tamaño de la cabeza del pez cebra y el volumen suficiente de fijación permiten una penetración efectiva en condiciones estáticas.
   PRECAUCIÓN: El PFA es dañino si se ingiere, inhala o entra en contacto con la piel. Prepare la solución de PFA bajo una campana extractora. Utilice el equipo de protección personal adecuado y evite la inhalación de polvo. Siga todas las pautas de seguridad según el fabricante. Trate los PFA como desechos peligrosos. Evite tirarlo por el desagüe. Recoja y etiquete los desechos en contenedores sellados y deséchelos de acuerdo con las regulaciones locales y nacionales.
7. Diseccionar el cerebro del pez cebra
   1. Coloque la cabeza fija en una placa de Petri limpia y diseccione el cerebro como se describió anteriormente¹⁵, usando pinzas de punta puntiaguda. Agregue continuamente 1x PBS gota a gota durante la disección para mantener el tejido hidratado y evitar que se seque.
   2. Prepare la placa de agarosa disolviendo 1 g de agarosa en 100 ml de agua destilada. Caliéntalo en el microondas hasta que esté completamente derretido, viértelo en una placa de Petri y deja que se solidifique.
   3. Enjuague el cerebro diseccionado dos veces en dos baños separados de 1x PBS. Luego, coloque el tejido en una placa de agarosa al 1% para retener la humedad y evitar que se encoja.
      NOTA: Un lavado insuficiente puede dar lugar a resultados falsos positivos y comprometer la precisión del análisis. Para evitar esto, lave bien el tejido cerebral al menos dos veces con 1× PBS, asegurándose de eliminar toda la sangre visible y el tinte que fluye libremente. Si queda algún resto de tinte, se recomienda encarecidamente un tercer lavado.

Figura 1: Comparación de la coloración de la piel entre un pez cebra normal y uno inyectado con EB. (A) Pez cebra normal que muestra un tono de piel marrón típico. (B) Pez cebra inyectado EB que exhibe un tono azulado notable, lo que indica una circulación sistémica exitosa del tinte. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Establecer un control positivo a través de una lesión por herida por arma blanca (SWI)

NOTA: La lesión por herida punzante rompe la BHE y permite la extravasación de EB en el sitio de la lesión.

1. Anestesiar a los peces utilizando el método de choque hipotérmico (ver paso 2.1). Una vez anestesiado, inyecte 20 μL de colorante EB al 1% y deje que el pez se recupere durante 30 min como se describe en los pasos 2.2 y 2.3.
2. Después de un período de recuperación de 30 minutos, prepare una aguja estéril de 31 G conectada a una jeringa de insulina y realice un procedimiento de lesión por herida de arma blanca de la siguiente manera:
   1. Anestesiar al pez nuevamente.
   2. Coloque el pescado en posición vertical sobre una superficie plana y fría (por ejemplo, una bolsa de gel de hielo). Inserte la aguja en un lado del telencéfalo en un ángulo de 90° a una profundidad que no exceda de 1,5 mm (Figura 2).
      NOTA: Para evitar el contacto directo de la piel con la bolsa de gel de hielo y evitar posibles daños en la piel, coloque una capa de gasa o toalla de papel entre el pescado y la superficie fría (Figura 2). Alternativamente, el pescado se puede colocar en una placa de Petri poco profunda colocada encima de la compresa fría para mantener el enfriamiento sin contacto directo. Marque 1,5 mm en la aguja para evitar una penetración excesiva.
   3. Transfiera los peces a un tanque de recuperación y déjelos recuperar durante 30 min.
   4. Eutanasia, decapitación, reparación y disección del cerebro como se describe en los pasos 2.4 a 2.7.
   5. Para el control negativo, repita los pasos 2.1 a 2.7 usando 20 μL de 1x PBS en lugar de colorante EB.

Figura 2: Lesión por herida de arma blanca para control positivo. (A) Inserte brevemente una aguja 31G en el telencéfalo (círculo rojo) para facilitar la penetración del tinte EB en el tejido cerebral; Comparación lado a lado de un cerebro no lesionado y un cerebro apuñalado, (B) vista dorsal del sitio de la puñalada (círculo rojo), (C) vista lateral del sitio de la puñalada. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Análisis cualitativo de la extravasación de EB

1. Observe los tejidos cerebrales disecados bajo un microscopio estereoscópico. Optimice la configuración de la imagen (zoom, balance de blancos, exposición, contraste, etc.) para garantizar la consistencia.
2. Capture imágenes con una cámara montada en un microscopio y guárdelas en . TIFF.
   NOTA: Utilice configuraciones de imágenes idénticas para todas las muestras para garantizar la validez comparativa.

5. Análisis cuantitativo de la extravasación de EB

1. Descargue e instale Fiji (un enlace para descargar el software está disponible en la Tabla de materiales). Abre la imagen en Fiji.
2. Realice la deconvolución de color haciendo clic en: Imagen > Color > Deconvolución de color > RGB, lo que da como resultado tres imágenes separadas que representan tonos rojos, verdes y azules.
   NOTA: Este paso aísla el tono azul de los otros componentes de color, asegurando que solo se mida la intensidad del tinte azul.
3. Active la imagen del canal azul (generalmente etiquetada como "Color_3") haciendo clic en la imagen. Conviértalo a escala de grises de 8 bits haciendo clic en: Imagen > Escriba > 8 bits.
   NOTA: La conversión en escala de grises minimiza los artefactos de color y mejora el análisis basado en la intensidad.
4. Mida la intensidad de gris de la imagen de 8 bits.
   1. Establezca las medidas seleccionando: Analizar > Establecer mediciones; seleccione Área y Valor de gris medio.
   2. Con la herramienta de selección de rectángulos, dibuje una región de interés (ROI) de tamaño uniforme y mida la intensidad de los grises seleccionando Analizar > Medir o pulsando Ctrl + M.
      NOTA: Se debe utilizar el mismo tamaño de ROI en todas las muestras. Las dimensiones absolutas del ROI pueden variar según el aumento y la resolución de la imagen adquirida, por lo que los investigadores deben estandarizar el tamaño del ROI dentro de su conjunto de datos para garantizar la comparabilidad. Cada píxel de la imagen en escala de grises de 8 bits tiene un valor de intensidad que va de 0 a 255, donde 0 representa el negro puro, 255 representa el blanco puro y los valores intermedios representan varios tonos de gris.
   3. Para reducir el sesgo, extraiga de tres a cinco ROI dentro de las regiones anatómicamente consistentes del cerebro en todas las muestras. Evite las regiones con artefactos o tinciones inconsistentes.
      NOTA: La consistencia de la colocación se puede lograr haciendo referencia a puntos de referencia anatómicos y asegurando que el posicionamiento del ROI sea simétrico entre los grupos experimentales.
   4. Promedie los valores medios de gris de los ROI para cada imagen para obtener un único valor de intensidad por cerebro. Utilice este promedio para la comparación estadística entre grupos.

Resultados

Este protocolo se probó en un modelo de pez cebra parkinsoniano. El compromiso de la BHE es un fenómeno bien documentado en pacientes con EP ^16,17,18 y en varios modelos animales parkinsonianos 19,20,21. Para investigar la integridad de la BHE en el modelo parkinsoniano de pez cebra adulto, se comparó la extravasación de colorante EB en...

Discusión

La evaluación de la integridad de la BHE es esencial para comprender la fisiopatología de las enfermedades relacionadas con el cerebro, ya que una BHE comprometida puede causar y empeorar la progresión de la enfermedad⁴. Aunque el pez cebra adulto ha surgido como un modelo eficaz para estudiar enfermedades neurodegenerativas, los métodos para evaluar la integridad de la BHE en esta especie siguen estando poco desarrollados⁸. El protocolo pr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa en polvo	Vivantis	PC0701
El tinte azul de Evan	Sigma-Aldrich	E2129
Imagen de FijiJ	Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.		Enlace para descargar: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Cámara de microscopio	ShenZhen Hayear Electronics Co. Ltd.	HY-500M
Paraformaldehído (PFA) en polvo	Sigma-Aldrich	158127
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Cloruro de sodio (NaCl)	Productos químicos HmbG	7647-14-5
Estereomicroscopio	Corporación Olympus	SZ40
Unidad de filtro de jeringa, 0.45µ m	Merck Millipore	SLHV004SL