Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

Helene Keuthen; Nadiia Pozhydaieva; Katharina Höfer

doi:10.3791/69022

Artículo de método

Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

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DOI:

10.3791/69022

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14 de octubre de 2025

Helene Keuthen¹ , Nadiia Pozhydaieva¹^,²^,³ , Katharina Höfer¹^,⁴^,⁵

¹Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, ²Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, ³Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, ⁴Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), ⁵Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para reducir las modificaciones del ADN en bacteriófagos utilizando la enzima NgTET, lo que permite una mutagénesis CRISPR-Cas eficiente y sin cicatrices. Este método facilita la ingeniería genética de fagos para aplicaciones en biotecnología y terapia con fagos.

Resumen

Los bacteriófagos, virus que se dirigen específicamente a sus huéspedes bacterianos, tienen un potencial significativo para la biotecnología y la medicina, especialmente en la lucha contra infecciones resistentes a múltiples fármacos. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a la infección por fagos siguen siendo en gran medida poco explorados. La mutagénesis precisa y específica del sitio de los fagos es una herramienta poderosa para dilucidar las funciones de los genes y las interacciones entre fagos y huéspedes.

Sin embargo, un desafío importante en la mutagénesis del genoma de fagos es la presencia de modificaciones del ADN de los fagos que interfieren con las herramientas convencionales de edición del genoma como CRISPR-Cas.

Si bien los sistemas CRISPR-Cas se han utilizado con éxito para la mutagénesis dirigida en varios organismos, su efectividad en la mutagénesis de fagos a menudo está limitada por modificaciones del ADN como la glicosilación de citosina. Para superar esta barrera, desarrollamos un método eficiente que reduce temporalmente la abundancia de modificaciones del ADN de los fagos, lo que permite una orientación eficiente de CRISPR-Cas y la introducción precisa de mutaciones en los genomas de los fagos. Específicamente, utilizamos la metilcitosina dioxigenasa de translocación Ten Eleven (TET) de Naegleria gruberi (NgTET), que desmodifica iterativamente las citosinas metiladas e hidroximetiladas en el ADN. Al oxidar citosinas hidroximetiladas dentro del ADN del fago, NgTET previene la modificación posterior de la citosina como la glicosilación y mejora significativamente la eficiencia de la escisión del ADN mediada por Cas.

En conclusión, el enfoque de edición del genoma preciso y sin cicatrices que se presenta aquí permite la introducción eficiente de mutaciones puntuales mientras se mantiene la arquitectura genética nativa en los genomas de fagos. Al preservar intactos los marcos transcripcionales y traduccionales, este método minimiza las interrupciones no deseadas en redes reguladoras complejas. Esto es particularmente importante para investigar proteínas de fagos esenciales o multifuncionales. La capacidad de generar modificaciones genéticas específicas sin introducir secuencias extrañas amplía significativamente el conjunto de herramientas experimentales para la biología de fagos. Esta estrategia no solo facilita estudios funcionales detallados, sino que también mejora el potencial de ingeniería racional de fagos para aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas.

Introducción

Los bacteriófagos son virus que se dirigen específicamente a las bacterias. Han atraído un gran interés en la investigación debido a su inmenso potencial en biotecnología y medicina, particularmente en la lucha contra las bacterias multirresistentes ^1,2,3. A pesar de esto, la biología de los fagos sigue siendo relativamente poco estudiada. Una comprensión más profunda de sus mecanismos moleculares de secuestro de sus huéspedes bacterianos es esencial para aprovechar plenamente su potencial terapéutico y biotecnológico⁴. Para investigar los mecanismos m....