Evaluación de las respuestas foliares a metabolitos microbianos secundarios utilizando un formato de alto rendimiento

Resumen

Este protocolo describe un enfoque de alto rendimiento para evaluar la fuga iónica de la planta, la actividad de la peroxidasa y la producción de calosas en la misma muestra.

Resumen

Los microbios secretan metabolitos secundarios estructuralmente diversos durante la infección vegetal, algunos de los cuales son detectados por células vegetales, que desencadenan respuestas al estrés. En este método, la inducción de fuga iónica, actividad de peroxidasa y producción de calosas se mide en la misma muestra de disco foliar. Primero, los discos de Arabidopsis o hojas de cebada se infiltran al vacío en una placa de 96 pozos. Tras 4-6 horas, se mide la conductividad, seguida de la actividad de la peroxidasa y la deposición de calosa a las 24 horas. El péptido FLG22 induce las tres respuestas y es un control positivo asequible. Los lipopéptidos cíclicos surfactina y gramilina inducen la actividad de la peroxidasa y la fuga de iones, respectivamente, mientras que el tricoteceno, fitotóxico T-2, suprime la actividad de la peroxidasa. En general, este enfoque permite múltiples comparaciones entre genotipos vegetales o tratamientos con metabolitos. Este enfoque puede aplicarse a la genética química o a la bioprotección para identificar compuestos moduladores de estrés para estudios posteriores. En genética vegetal, este enfoque puede utilizarse para comparar respuestas entre poblaciones vegetales para el mapeo genético y para mejorar nuestra comprensión de las interacciones planta-microbio.

Introducción

Las plantas responden a diversas moléculas microbianas para activar respuestas al estrés celular, lo que puede culminar en la resistencia a enfermedades. Los patrones moleculares asociados a microbios (MAMPs), como el péptido flg22 de la flagelina bacteriana, son detectados por proteínas receptoras vegetales para iniciar una serie de respuestas celulares de señalización. Estas incluyen respuestas tempranas como cascadas de quinasas, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), picos de calcio, despolarización de membrana y respuestas tardías como la deposición de calosas y la inducción de la actividad^peroxidasa. Los metabolitos secundarios microbianos (MSM) son moléculas pequeñas (50-1.500 Daltons), moléculas estructuralmente diversas que son prescindibles para el crecimiento y desarrollo, pero que favorecen la supervivencia del microbio. Algunos HSH inducen respuestas de estrés celular en plantas, aunque los mecanismos implicados en iniciar estas respuestas siguen sin resolver ^2,3. Los mecanismos propuestos para el reconocimiento de la MSM por plantas incluyen mecanosensación, modificaciones proteicas inducidas por redox o señalización basada en^{lípidos 4,5}. En algunos casos, el MSM induce respuestas al estrés o causa daños celulares dependiendo de la concentración. Por ejemplo, la toxina T-2 induce la producción de calosa y ROS a 1 μM y causa muerte celular a 10 μM, y normalmente se describe como una^{fitotoxina 4}. Los HSH influyen en la patogénesis en algunas interacciones planta-microbio y pueden desencadenar tanto la susceptibilidad como la resistencia de las plantas. Por ejemplo, el lipopéptido cíclico gramilina induce la producción de ROS, fugas iónicas y calosas, al tiempo que aumenta la susceptibilidad de la cebada a Fusarium^{graminearum 2}. Los lipopéptidos cíclicos de siringomicina y siringopepitina inducen la producción de ROS vegetal y promueven la resistencia del huésped frente a la bacteria Pseudomonas fluorescens ³. Otros HSH, como la surfactina y la iturina, son producidos por microbios no patógenos y promueven resistencia contra infecciones patógenos posteriores induciendo respuestas al estrés de las plantas ^6,7. Estos MSM bioprotectores inducen respuestas celulares, incluyendo flujos iónicos, producción de ROS, cambios transcripcionales y producción de^calosa. Comprender las interacciones entre HSH y plantas podría ayudar a determinar el papel de los HSH en la resistencia a enfermedades e identificar genes del hospedador que puedan aprovecharse para mejorar la resistencia de los cultivos.

Los métodos actuales para evaluar las respuestas al estrés inducidas por el MSM suelen implicar probar una respuesta al estrés a^{la vez, 8}. Dado que el MSM secundario puede ser difícil de extraer y que puede haber una cantidad limitada de metabolitos disponibles, probar múltiples respuestas dentro de la misma muestra puede tranquilizar que el MSM tiene un efecto sobre las células vegetales. Un método de alto rendimiento para evaluar estallidos ROS apoplásticos es detectar la luminiscencia generada por luminol oxidado en presencia de peroxidasa⁹ de rábano picante. Desafortunadamente, la luminiscencia basada en luminol se apaga mediante cationes y algunos disolventes, lo que limita el uso de este ensayo para extractos que contienen sales o para moléculas no polares que deben disolverse en DMSO, lo que hace necesario un método que funcione con estos^{contaminantes 9}. Para abordar estos problemas, extendimos los métodos de corriente para evaluar tres respuestas al estrés (fuga de iones, actividad de peroxidasa y callosa) de la misma muestra foliar en un ensayo de alto rendimiento (Figura 1)10,11,12. Nuestro enfoque consiste en tratar discos foliares con MSM utilizando infiltración al vacío en una placa de 96 pozos. A continuación, se realizan mediciones de conductividad entre 4 y 6 horas después del tratamiento para evaluar la fuga de iones, seguidas de mediciones de actividad peroxidasa y deposición de calosa a las 24 horas. Nuestro enfoque ha sido optimizado para Arabidopsis y cebada, pero podría extenderse a otras especies vegetales con validación experimental. Por ejemplo, la actividad inducida de la peroxidasa de cebada no es detectable con este método, pero sí se puede detectar la supresión de la actividad por compuestos tóxicos. Por tanto, las características de las hojas o la amplitud de la respuesta inducida varían entre especies, lo que limita la aplicabilidad de este enfoque a algunas especies vegetales.

El diseño experimental con este método debe tener en cuenta los controles, la replicación y la concentración de MSM que se están utilizando para asegurar los mejores resultados. Un control negativo es esencial para identificar HSH que inducen niveles estadísticamente diferentes de respuesta al estrés en comparación con los efectos de las heridas. Idealmente, el control negativo contendría el mismo disolvente que el MSM pero careciendo del MSM. Los disolventes típicos para MSM hidrofóbicos incluyen DMSO y metanol, que inducen respuestas celulares como la producción de ROS en concentraciones^{elevadas 13,14}. En este ensayo, observamos un impacto en la actividad de la peroxidasa, donde un 10% o más de DMSO y metanol bloquean la actividad de la peroxidasa inducida por FLG22 (Figura 2). En el caso de extractos complejos, puede ser difícil desarrollar un control negativo sin MSM cuando se desconocen los metabolitos de interés. En cambio, fraccionar los extractos según el tamaño, la polaridad o la carga permitiría comparaciones relativas entre fracciones para identificar la fracción que más induce estrés para un análisis posterior. Además, incluir un control positivo, como la toxina Flg22 de 1 μM o la toxina T-2 de 10 μM, garantiza que el investigador pueda evaluar que el ensayo está funcionando. Recomendamos incluir cuatro réplicas técnicas por tratamiento e incluir controles positivos y negativos en cada placa cuando se miden varias placas dentro de un experimento.

En conjunto, este enfoque captura tres respuestas al estrés de las plantas inducidas por el MSM, ofreciendo un método accesible y rentable para estudiar las interacciones planta-MSM. El formato de alto rendimiento permite a los investigadores captar diferencias sutiles entre genotipos vegetales o extractos microbianos dentro de la misma unidad experimental. Esto permite enfoques a nivel sistémico para comprender familias de genes vegetales o realizar encuestas de poblaciones vegetales para cartografía genética. En el ámbito microbiano, este enfoque podría utilizarse para detectar posibles compuestos bioprotectores o en genómica química para identificar compuestos que potencian o suprimen respuestas específicas al estrés.

Protocolo

1. Preparación y tratamiento de muestras

NOTA: Se deben tomar todas las precauciones de seguridad y prácticas de eliminación adecuadas para minimizar el riesgo para el experimentador y el medio ambiente.

1. Cultivo de plantas
   1. Cultiva Arabidopsis hasta la etapa de 4-5 semanas en mezcla de suelo Cornell (300 turbera: 630 vermiculita: 1 fertilizante de liberación lenta: 4,2 cal) con dos plantas por maceta en 24 macetas por bandeja. Riega las plantas según sea necesario desde abajo añadiendo agua a la bandeja. Ajusta las condiciones de la cámara de crecimiento a 21 ^°C de forma continua con 16 h de luz y 8 h de oscuridad, y mantén una humedad aproximada del 30-50%. Utiliza las^{hojas totalmente} expandidas de la 5 a la 9 para experimentar y cosechar por la mañana.
   2. Cultiva cebada hasta que la primera y segunda hoja verdadera estén completamente expandidas en 75 tierra para macetas: 24 tierra negra: 1 mezcla de suelo cal. Planta una semilla por maceta en 24 parcelas por bandeja, regando según sea necesario. Ajusta las condiciones de la cámara de crecimiento a 21 ^°C con 16 h de luz y 8 h de oscuridad a aproximadamente un 30-50% de humedad. Toma muestras de la primera y segunda hoja completamente expandida y cosecha por la mañana.
2. Recoge tres discos foliares por planta usando un barrenador de corcho de 4 mm de diámetro, evitando la vena central. Evita macerar el tejido usando un barrenador afilado con movimiento de torsión.
3. Colocar inmediatamente y con delicadeza los discos de hoja en un pozo de una placa de 96 pozos en 196 μL de Milli-Q_{H 2}O estéril. Continúa recogiendo discos hasta que se haya recogido el número requerido de muestras.
4. Añadir metabolitos secundarios o tratamientos con disolventes a la concentración deseada a un volumen final de 200 μL en pozos individuales.
5. Coloca la placa de 96 pozos con la tapa abierta en un frasco de campana con boquilla de vacío.
6. Conecta la manguera de vacío a la boquilla del juguete y activa la presión de vacío hasta que el vacío alcance las 9,8 libras/pulgada cuadrada (normalmente 10 segundos). Repite este proceso una vez más.
7. Coloca la tapa sobre la placa e incuba sobre un agitador orbital (55 rpm) bajo luz (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) colocada a 23 cm sobre el agitador durante 4 horas.

2. Mediciones de fugas iónicas

1. Lava la sonda con agua Milli-Q y aplica suavemente Kimwipe para que se seque. Fíjate en la lectura de conductividad del agua para referencia.
2. A las 4-6 horas del tratamiento, muestrear y registrar la conductividad de los pozos individuales sumergiendo la sonda en el líquido que rodea el disco foliar. Sujeta la placa en un ángulo de 45° para asegurarte de que la sonda esté completamente emersa.
3. Enjuaga la sonda entre muestras sumergiéndola en agua Milli-Q y secando la sonda con un Kimwipe. Ocasionalmente, prueba la conductividad del agua para asegurar que las lecturas de la sonda se mantengan estables.
4. Coloca una película plástica de sellado en la placa y vuelve a colocarla en el agitador orbital para incubarla durante la noche.

3. Mediciones de la actividad de la peroxidasa

1. Prepara el sustrato de peroxidasa fresco cada día en una solución de 50 mL. Calienta 40 mL de agua estéril destilada a 70 ^°C en un vaso con una barra de revolteo y disuelve 50 mg de ácido 5-aminosalicílico (1 mg/mL) en el agua calentada. Añade agua hasta 50 mL y ajusta el pH a 6 usando NaOH. La solución es fotosensible, así que cúbrelo con papel de aluminio o usa un tubo ámbar.
2. En un tubo cónico ámbar de 50 mL, se produce una solución al 1% de H₂O₂ añadiendo 1,7 mL de 30% de_{H 2}O₂ a 48,3 mL de Milli-Q H₂O.
3. Inmediatamente antes del ensayo, añadir 10 μL de la solución al 1% de_H2O2 por mililitro de solución 5-aminosalicílica necesaria para que el ensayo genere el medio del ensayo.
4. Para muestrear los discos foliares tratados, toma 50 μL de cada pozo en el momento deseado. Transfiere a una placa clara y de fondo plano de 96 pozos y añade 50 μL del medio de ensayo, mezclando pipeteando 5 veces.
5. Incuba la reacción a temperatura ambiente durante 3 minutos y detén la reacción añadiendo 20 μL de NaOH 2 N, golpeando suavemente para mezclar.
6. Mide la absorbancia de los pozos a 595 nm en un lector de placas.

4. Imagen de calosas y análisis de imágenes

1. Tras tomar muestras de los pozos para el ensayo de peroxidasa, se elimina el líquido restante de los pozos y se añade 100 μL de una solución de ácido acético y etanol (1:3) para fijar y desteñir. Coloca una tapa sobre la placa e incuba la placa sobre un agitador (60 rpm) en una campana extractora durante 24 horas a temperatura ambiente.
2. Sustituye la solución destincadora por una nueva y incuba durante otras 24 horas a temperatura ambiente.
3. Extrae la solución antitinente y añade 100 μL de 150 mM K_{, 2}HPO₄ a cada pozo. Coloca el plato sobre el coctelero y incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Retira la solución de lavado K_{2HPO 4} y añade 100 μL de 150 mM K₂HPO₄ con 0,1 mg/mL azul de anilina. Cubre la placa de 96 pozos con una tapa y papel de aluminio y incuba en un agitador durante al menos 2 horas (Arabidopsis) o durante toda la noche (cebada).
   NOTA: El azul de anilina es sensible a la luz y debe fabricarse fresco para cada réplica técnica.
5. Retira la solución azul de anilina y la sustituye por glicerol al 50%. Cubre las placas de 96 pozos con papel de aluminio y guárdalas a 4 °C hasta que estén listas para la imagen.
6. Coloca una gota de solución de glicerol al 50% sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Coge suavemente un disco de hoja con unas pinzas y colócalo con el lado abaxial hacia arriba sobre el portaobjetos. Cubre con una capa de 1,5 de cobertura, minimizando las burbujas de aire, y añade un 50% adicional de glicerol si es necesario para rellenar debajo de la cubierta.
7. Enfoca el material de la hoja usando luz blanca transmitida (campo brillante) bajo un objetivo 20x seco.
8. Selecciona la longitud de onda de excitación a 370 nm y la longitud de onda de emisión a 509 nm para la imagen azul de anilina y establece un tiempo de exposición. Optimiza el tiempo de exposición para permitir suficiente señal pero evitando la sobresaturación de los píxeles. Para la comparación cuantitativa de imágenes, asegúrese de que la intensidad y el tiempo de exposición del láser sean consistentes para todas las réplicas biológicas, tratamientos y réplicas técnicas.
9. Para cada disco hoja, selecciona tres campos de visión diferentes y adquiere imágenes para cada uno usando los parámetros establecidos en el paso 4.8. Adquiere todas las imágenes con material vegetal llenando completamente el campo de visión con regiones mínimas de fondo (material no vegetal). Adquiere imágenes en un único plano z en la superficie de la hoja.
   NOTA: Tener algo de fondo puede ser inevitable y puede corregirse en pasos posteriores de cuantificación de imagen. En este ejemplo, las imágenes se toman utilizando un microscopio de epifluorescencia vertical con una lámpara de mercurio y el cubo de filtro DAPI (excitación 360/40 nm, emisión 460/50 nm). En los casos en que no hay lámpara de mercurio disponible, se puede utilizar una fuente de luz LED de longitud de onda múltiple.
10. Para cuantificar las manchas calosas a partir de imágenes, descarga e instala el software gratuito de procesamiento de imágenes FIJI utilizando las instrucciones en línea en https://imagej.net/Fiji/Downloads. Abre FIJI e importa las imágenes de azul anilina para su análisis. Para este análisis, utiliza .tiff archivos con una resolución de al menos 300 dpi. Exporta archivos de imagen en .tiff formato usando el software de microscopio antes del análisis, o deja que FIJI abra los archivos.
    NOTA: Fiji puede abrir la mayoría de los tipos de archivos propietarios (por ejemplo, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Configura la escala de la imagen (haz clic en Analizar | Ajusta la escala), usando los valores de distancia del montaje del microscopio.
12. Convierte la imagen a una imagen en escala de grises de 32 bits (haz clic en Imagen | Tipo | 32 bits).
13. Ajustar el umbral (haz clic en Imagen | Ajustar | umbral) para incluir solo la señal de fluorescencia que representa la tinción azul de anilina haciendo clic en Auto y ajustando manualmente los valores mínimos y máximos en la curva umbral. Una vez finalizado el umbral, haz clic en Aplicar | Conviertir a Mask. Utilizando software de hojas de cálculo, escribe los parámetros umbral seleccionados para cada imagen.
    NOTA: Debido a la autofluorescencia inherente de las muestras vegetales y al despejamiento del tejido vegetal, el umbral puede variar entre muestras. Para la reproducibilidad, es esencial registrar el umbral de cada imagen y ser consistente en el ajuste de los valores umbral entre muestras.
14. Cuantifique el número y tamaño de los puntos azul de anilina usando Analizar partículas (clic en Analizar | Analizar partículas) usando los ajustes por defecto. Para ver los valores medios de todos los puntos en la imagen, selecciona Resumir en el cuadro emergente y luego haz clic en OK.
15. Copia y pega estos resultados desde la casilla de Resumen en la hoja de cálculo con los parámetros umbral para un análisis posterior. Los valores incluidos en esta cuantificación incluyen el Recuento (número de puntos azul de anilina), Área total (área total en unidades² de puntos azul anilina), Tamaño medio (tamaño medio en^{unidades 2} de puntos azul anilina), %Área (porcentaje de cobertura media en unidades² de fluorescencia azul anilina frente al área total), Perímetro (perímetro medio de puntos) e IntDen (indicación de intensidad de fluorescencia de la tinción azul de anilina).
16. Repite los pasos 4.11-4.15 para todas las imágenes adquiridas durante el experimento. Al cerrar una imagen con umbral desde FIJI, selecciona No guardar para evitar cambiar la imagen de datos en bruto por la máscara umbral.
17. Si alguna imagen contiene área con fondo no vegetal, mide el área del tejido vegetal delimitando manualmente la región del tejido vegetal usando las herramientas de selección Polygon o a mano alzada y midiendo el Área (haz clic en Analizar | Medida). Copia este valor en la hoja de cálculo de cada imagen.
18. En una hoja de cálculo, promedia los valores de las tres imágenes de campo de visión de una réplica biológica. Si algunas imágenes del experimento contienen área no vegetal (véase el paso 4.17), corrige todos los valores basándose en el área de tejido vegetal en cada imagen. Por ejemplo, divide el valor de Count por el área de tejido vegetal de cada imagen antes de hacer gráficos y comparaciones estadísticas.

5. Análisis de datos

1. Evalúa la calidad del experimento comparando controles positivos con controles negativos dentro de la misma placa usando una prueba t. Si los controles positivos no produjeron cambios significativos en las respuestas al estrés, reevaluar condiciones experimentales como la salud de las plantas, el momento del tratamiento, el control negativo y el posible deterioro de los HSH.
2. Pruebas de significación
   1. Si todas las réplicas técnicas de un tratamiento se evalúan dentro de la misma placa, analiza las diferencias entre tratamientos individuales y el control negativo utilizando enfoques estadísticos estándar como una ANOVA unidireccional con una prueba de Tukey.
   2. Si se evaluaron réplicas técnicas de un tratamiento en varias placas, normalizar cada muestra respecto al control negativo para minimizar la influencia del error placa a placa. Divide cada valor por la media de las muestras control negativas dentro de la misma placa. Someter los valores normalizados a métodos estadísticos estándar.

Resultados

Con este método, se puede determinar si un HSH activa un subconjunto de respuestas al estrés celular de las plantas. Los resultados de este ensayo proporcionan cuantificación de la actividad de la peroxidasa, la fuga de iones y la producción de calosas para determinar si un MSM induce respuestas diferenciales en comparación con un control negativo. Un resultado positivo para un compuesto se indicaría por una diferencia significativa respecto al control negativo, como se muestra en el ionóforo gramilina, que induce fuga iónica y producción de calosas (Figura 3)². Incluir un control positivo, como 1 μM flg22, que induce las tres respuestas, garantiza el rendimiento intacto de la planta y las condiciones experimentales (Figura 3)^11,15. Gramillin y FLG22 se disuelven en agua, mientras que la surfactina hidrofóbica y la toxina T-2 se disuelven en DMSO. Para preparar moléculas hidrofóbicas, primero preparamos un stock de 10 mM en DMSO. Este material se utiliza para crear una concentración final de 10 μM en agua Milli-Q para el tratamiento foliar que contiene un 0,1% de DMSO. La surfactina (10 μM) induce la actividad de la peroxidasa y la callosa, mientras que la toxina T-2 (10 μM) suprime la actividad de la peroxidasa e induce la producción de calosa, probablemente debido a la muerte celular ^2,6,16. Utilizar agua o DMSO al 0,1% como controles negativos es apropiado para los tratamientos indicados, ya que ambos controles producen resultados similares (Figura 2).

En nuestros cribados preliminares de 100 MSM disponibles comercialmente, observamos inducción calosa para la mayoría de los compuestos que hemos estudiado (>70%), mientras que la fuga de iones y la actividad de la peroxidasa se desencadenan por menos compuestos (30% y 35%). La mayoría de estos compuestos son producidos por especies de Fusarium , incluyendo siete tricotecenos diferentes como el desoxinivalenol (DON) y la toxina T-2. Aunque se continúa la replicación para confirmar estos resultados, indican tendencias similares a las observadas en nuestros controles positivos (Figura 3), donde la calosa fue inducida por todos los tratamientos y la fuga iónica o peroxidasa fue desencadenada por algunos, pero no todos los tratamientos.

Figura 1: Visión general del procedimiento para evaluar las respuestas celulares inducidas por HSH en hojas. Los discos foliares se colocan en una placa de 96 pozos que contiene los tratamientos de interés, y los discos se infiltran por vacío. Cada placa contiene cuatro réplicas de un control negativo (agua con disolvente) y un control positivo (toxina flg22 o T-2). Tras 4-6 horas, se mide la conductividad del líquido que rodea el disco foliar como cuantificación de la fuga de iones. Tras 24 horas, la actividad de la peroxidasa se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico utilizando el líquido que rodea el disco foliar, y el disco foliar se destiñe y procesa para cuantificación de calosa. Abreviatura: MSM = metabolito microbiano secundario. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: El efecto del disolvente sobre la fuga de iones inducida por FLG22 o la actividad de la peroxidasa. Se trataron cuatro muestras replicadas de Arabidopsis con 1 μM flg22 combinado con DMSO o metanol (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Los gráficos de barras muestran la conductividad media de la muestra tras 4 horas o la actividad de la peroxidasa (OD₆₀₀) a las 24 horas después del tratamiento de un solo experimento (n = 4, DA). El experimento se repitió dos veces con resultados similares. La diferencia significativa respecto al control del agua se determinó mediante la prueba t y se indicó con un asterisco (p < 0,05). Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; MeOH = metanol. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Inducción de fuga iónica, actividad de peroxidasa o deposición de calosa en discos foliares de Arabidopsis por moléculas derivadas de microbianos. Los tratamientos incluyeron el péptido inmunogénico y no tóxico flg22 (1 μM), los lipopéptidos cíclicos gramilina y surfactina (10 μM), y la toxina T-2 (10 μM)^2,6. Todos los datos se normalizaron a agua + 0,1% DMSO control. Los gráficos de caja y bigote muestran la conductividad de la muestra tras 4 horas, la actividad de la peroxidasa (OD₆₀₀) tras 24 horas, o el número de depósitos calosos tras 24 horas de un solo experimento (n = 4-16 plantas). Los diagramas de caja indican una 'x' para mostrar el valor de la media, y las cajas indican el primer cuartil, mediana y tercer cuartil del tratamiento. Las observaciones más altas y más bajas que no son valores atípicos se indican con los bigotes (>rango intercuartílico de 1,5x, indicado por círculos). La diferencia significativa respecto al control del agua se indica con un asterisco y fue determinada mediante ANOVA unidireccional con una prueba de Tukey (p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Las comunidades microbianas colonizadoras de plantas secretan diversos HSH para facilitar la formación de biofilmes, suprimir microbios competidores e influir en el hospedador^{vegetal 17}. Mientras que algunos HSH no tienen impacto en la planta, otros inducen una muerte celular rápida, suprimen la función celular o inducen resistencia de la planta¹⁷. Algunos HSH influyen en la resistencia de las plantas al microbio productor de MSH, y los genotipos resistentes pueden seleccionarse en función de la insensibilidad^{al HSH 2,3,18}. Otros HSH inducen resistencia sistémica y proporcionan protección contra patógenos microbianos, que se ha utilizado en agricultura para desarrollar productos bioprotectores que supriman la enfermedad⁸. Para desarrollar estrategias de mejora de cultivos efectivas y sostenibles, es esencial identificar los HSH beneficiosos y los genes de las plantas que permiten una respuesta óptima al MSH.

Encontrar HSH beneficiosos se complica por el hecho de que estos compuestos se producen enzimáticamente, donde se requieren múltiples enzimas para el producto^{terminado 2}. Esto dificulta determinar qué gen atacar para abolir la producción de HSH en estudios genéticos. La biosíntesis enzimática da lugar a múltiples variaciones estructurales del mismo MSM con bioactividades potencialmente^{diferentes 19}. Separar y purificar estos HSH para encontrar las moléculas bioactivas puede ser lento o imposible. En algunos casos, solo se pueden purificar bajas concentraciones de HSH individuales, requiriendo múltiples rondas de^{purificación 2}. Una vez obtenido un compuesto o extracto bioactivo, se pueden utilizar varios enfoques para entender cómo el microbio podría estar afectando a la planta.

Los esfuerzos anteriores se han centrado en monitorizar el impacto del MSM en la reprogramación transcripcional o la bioprotección en plantas^{modelo 20}. Para evaluar las respuestas de los HSH más allá de las plantas modelo, los ensayos de alto rendimiento que capturan respuestas a diversos HSH y requieran un mínimo de HSH son potencialmente útiles. Trabajos recientes indican que los estallidos ROS son una respuesta temprana común a los HSH, incluyendo gramillina, surfactina, siringomicina y siringopepitina ^2,3,7. Un ensayo basado en luminol detecta la explosión apoplástica de ROS generada por peroxidasas y oxidasas de NADPH y es susceptible de pruebas de alto rendimiento²¹. Desafortunadamente, los ROS intracelulares inducidos por HSH, como la surfactina, no son detectables con este^{método 7}. Cuantificar la actividad de la peroxidasa ofrece una alternativa más sensible que el ensayo basado en luminol para detectar la activación transitoria de enzimas productoras de ROS durante el^{estrés 11}. Nuestra observación de que la surfactina induce la actividad de la peroxidasa está en línea con trabajos recientes que muestran que la actividad de la peroxidasa es desencadenada por la surfactina y la beauvericina en Arabidopsis (Figura 3)². Además, demostramos que flg22 y el ionóforo gramilina inducían fugas iónicas, y todos los compuestos probados, incluyendo flg22, toxina T-2, surfactina y gramillina, inducen calosa como se esperaba (Figura 3^)2,4,7.

Al evaluar múltiples respuestas dentro de la misma muestra, minimizamos la variación experimental en la evaluación de cada uno de estos rasgos por separado y permitimos la correlación entre rasgos para estudios a nivel sistémico sobre respuestas al estrés de las plantas. Evaluar múltiples tratamientos o genotipos dentro de la misma unidad experimental también permite la fenotipización a nivel poblacional para la genética poblacional. Por ejemplo, se utilizó un enfoque similar para identificar un QTL subyacente a la producción de ROS inducida por FLG22 en la^{cebada 22}. Este ensayo también puede utilizarse para análisis de genética química para encontrar moduladores de las respuestas al estrés de las plantas o para identificar posibles HSH bioprotectores a partir de extractos microbianos.

Para asegurar que el método experimental funciona dentro del sistema de interés, los investigadores deben considerar los siguientes factores y limitaciones:

Calidad del tejido foliar
Asegúrate de que el tejido foliar de la planta no esté estresado antes de la cosecha. Las señales de estrés de las plantas varían entre especies, pero generalmente incluyen marchitamiento, amarillamiento, enrojecimiento, manchas, enrollamiento excesivo de las hojas o enrollamiento. El muestreo del tejido foliar provoca heridas, por lo que evitar una maceración excesiva del tejido reducirá el error de fondo debido al manipulación.

Especies vegetales
Este protocolo está optimizado para su uso con cebada y hojas de Arabidopsis. Las hojas de cebada requieren un tiempo de tinción más largo para la calosa que Arabidopsis, probablemente debido a la cera cuticular más gruesa de las gramíneas, lo que aumenta la hidrofobicidad y limita la difusión de los tratamientos hacia la hoja²³. Esto también puede explicar parcialmente la falta de inducción de actividad de la peroxidasa mediante nuestro método, aunque pudimos observar la supresión de la actividad de la peroxidasa por compuestos tóxicos similar a lo que presentamos en Arabidopsis (Figura 3). Intentamos aumentar el número de discos foliares por muestra a 5, ajustar el pH a 5, 6 o 7, aumentar el número de infiltraciones en vacío a 10 y modificar la concentración del sustrato o cambiar el sustrato a^{guaiacol 24}. Aunque observamos un aumento de la actividad de la peroxidasa con más discos foliares y rondas de infiltración, las diferencias entre el control negativo y el flg22 siguieron siendo pequeñas (aumento del 10% con flg22) o no significativas entre los experimentos. Sabemos que la cebada responde a flg22 induciendo la producción de ROS, la producción de calosas y la expresión^{de peroxidasa 25,26}. En las raíces de maíz, los extractos proteicos mostraron actividad de peroxidasa inducida por el MAMP, lo que sugiere que puede ser necesario extraer proteína para ver la inducción, en lugar de detectar la actividad proteica que se filtra de discos foliares, como se hace en nuestro ensayo²⁴. En nuestro ensayo, la herida induce claramente actividad de peroxidasa en la muestra de control negativa, porque esta actividad desaparece cuando las células mueren debido a la exposición a toxinas. Es posible que el tratamiento con FLG22 induca las mismas peroxidasas que la herida, de modo que parezca que no se ha producido inducción. Por otro lado, nuestro ensayo puede no ser lo suficientemente sensible para detectar cambios sutiles, o las peroxidasas pueden no difundirse bien en la solución.

Para aplicar este protocolo a otras especies vegetales, sugeriríamos usar el método tal como se describe e incluir Arabidopsis como control para asegurar que el protocolo funciona. Si la actividad de la peroxidasa parece baja, entonces aumentar el número de discos foliares por muestra, incrementar el número de infiltraciones en vacío a 5 o 10 y probar diferentes tratamientos, incluyendo otros MAMPs, ionóforos o la toxina T-2, podría dar un resultado positivo.

Tratamientos de control negativo
Este método depende de un control negativo efectivo y apropiado para las comparaciones. Idealmente, un control negativo contendría el mismo disolvente de fondo que el tratamiento de MSM de interés pero sin MSM. El disolvente de fondo sería agua o tendría el mismo impacto en las tensiones medidas que el agua. Este es un enfoque práctico en casos donde el MSM ya está purificado y puede disolverse en un disolvente de su elección. Al comparar extractos microbianos, un control negativo podría ser el subproducto de la purificación parcial del MSM, que contiene el mismo medio de fondo pero con una concentración reducida de MSM tras fraccionamiento. O el experimentador podría usar el medio de cultivo utilizado para generar el extracto que contiene MSM como control negativo. En estas muestras más complejas, el control negativo podría contener sales que inflan la medición de conductividad, o los disolventes pueden suprimir la actividad de la peroxidasa (Figura 2). Para determinar si las sales influyen en los resultados de fuga iónica, el experimentador podría probar la conductividad del control negativo y de la muestra en ausencia de un disco foliar para determinar si la muestra o la hoja está generando cambios en la conductividad. Para determinar si los disolventes están afectando a las respuestas de la peroxidasa, el experimentador puede añadir flg22 al control negativo y comparar el resultado con flg22 disuelto en agua para determinar si hay diferencia. Es posible que disolventes, compuestos teñidos o sales en exceso en un control negativo puedan ocultar los efectos del MSM sobre las respuestas al estrés vegetal descritas y, por tanto, este enfoque no será adecuado en todos los escenarios.

Tiempo de muestreo
Es importante iniciar los tratamientos por la mañana, ya que las respuestas de defensa inducibles siguen un ciclo circadiano y tienen la mayor amplitud a primera hora de la^{mañana 27}. En nuestra experiencia, Arabidopsis produce fugas iónicas en respuesta a la gramilina más rápido (4 h) que la cebada y el maíz (4-7 h), por lo que puede ser necesario un curso temporal para establecer los parámetros^{experimentales 2,28}. La respuesta celular disminuye con el tiempo y no recomendaríamos hacer pruebas de respuesta al estrés más allá de las 30+ horas tras el tratamiento.

Concentración
La concentración de MSM puede tener un impacto no lineal en la inducción de respuestas al estrés de las plantas, fenómeno llamado^{hormesis 20}. Dependiendo de la disponibilidad y solubilidad del MSM, idealmente los experimentadores probarían las respuestas al estrés de las plantas en un rango de concentraciones de MSM. Las concentraciones típicas varían entre 100 nM y 1.000 μM como punto de^{partida 2, 11 y 20}.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 5-aminosalicílico	Millipore Sigma	A79809
Bomba de vacío Barnart	Grupo de Tecnología Artesanal	400-3910
Sonda de microconductividad COND-905	Laboratorios de Investigación Lazar Inc.
Péptido FLG22	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Surfactina	Sigma-Aldrich	S3523
Toxina T-2	Cayman Chemical Company Inc	20433