Medición del envejecimiento unicelular con un biomarcador basado en imágenes de la cromatina y el envejecimiento epigenético

Resumen

El protocolo presenta el flujo de trabajo de imagen y computacional para extraer y validar la cromatina y la edad epigenética (ImAge) basadas en imágenes.

Resumen

Para avanzar en la atención sanitaria personalizada y evaluar posibles estrategias de rejuvenecimiento, los biomarcadores que reflejen la edad biológica son fundamentales. Hemos introducido la cromatina basada en imagen y la edad epigenética (ImAge), un biomarcador basado en imagen derivado de la organización espacial de la cromatina y las marcas epigenéticas dentro de núcleos individuales, capturando cambios intrínsecos relacionados con la edad. ImAge captura y cuantifica eficazmente los efectos de intervenciones que modulan la edad biológica, mostrando sensibilidad a través de disminuciones significativas tras estrategias de rejuvenecimiento (como la restricción calórica y la reprogramación parcial mediante expresión transitoria de Oct4, Sox2, Klf4 y Myc (OSKM)) y aumentos tras tratamientos como la quimioterapia. Además, una menor ImAge se correlacionó con una mayor actividad locomotora, lo que sugiere que captura mejoras funcionales junto con la reversión biológica de la edad, ofreciendo una prometedora herramienta unicelular para evaluar intervenciones de longevidad. Como ImAge es un método integrador que requiere imágenes de buena calidad y un análisis computacional meticuloso, nuestro objetivo es proporcionar una orientación exhaustiva para extraerlo y validarlo. Este protocolo completo detallará el flujo de trabajo tanto para los procedimientos de laboratorio húmedo (preparación e imagen de la muestra) como para la correcta utilización de nuestra pipeline computacional de código abierto (configuración del entorno y procesamiento de los datos de imagen) para extraer y validar ImAge.

Introducción

El aumento de la esperanza de vida media y el envejecimiento de la población mundial subrayan la necesidad crítica de biomarcadores efectivos de edad funcional^{o biológica 1,2,3}. Estos biomarcadores son esenciales para predecir con precisión el riesgo y la esperanza de vida de la enfermedad, lo que puede mejorar significativamente la atención geriátrica y reducir los costes asociados. Aunque los relojes de metilación del ADN (DNAm) han logrado avances notables en la cuantificación del envejecimiento^{biológico 4,5,6}, a menudo dependen de la regresión lineal y requieren grandes cohortes, pasando por alto componentes biológicos matizados y dependientes del contexto específicos de^{los individuos 7,8}. Además, estas técnicas basadas en secuenciación requieren lisis celular, preparación compleja de muestras y reactivos costosos para cada célula, lo que las hace más costosas y desafiantes para estudios de alto rendimiento, a gran escala o longitudinales donde la destrucción de muestras es una desventaja⁹.

Para superar estas limitaciones, desarrollamos la cromatina y la edad epigenética basadas en imágenes (ImAge), una técnica novedosa diseñada para cuantificar el envejecimiento y el rejuvenecimiento a resolución de célula única. Esta técnica se aplicó y validó en sangre periférica de ratón y en varios órganos sólidos, tal como describieron Alvarez-Kuglen et ^al.1. Esta publicación describe los protocolos optimizados en detalle para que puedan ser adaptados y adoptados por otros investigadores para diversas aplicaciones.

Este enfoque difiere fundamentalmente de los relojes tradicionales de ADN al capturar trayectorias intrínsecas relacionadas con la edad basándose en la organización espacial de la cromatina y las marcas epigenéticas dentro de núcleos^{individuales 1}. Los métodos basados en imagen ofrecen ventajas claras: son inherentemente no destructivos, lo que significa que las células no se destruyen durante el procesamiento, a diferencia de los métodos basados en secuenciación. Esta naturaleza no destructiva permite crucialmente la preservación de la estructura espacial de la cromatina y las marcas epigenéticas a nivel de célula única, manteniendo el contexto espacial de las células dentro de los tejidos, una perspectiva que a menudo se pierde en los flujos de trabajo convencionales de secuenciación. Además, las técnicas de imagen suelen ser más rentables para estudios a gran escala o longitudinales, ya que no requieren reactivos costosos ni preparación compleja de bibliotecas por célula, lo que las hace adecuadas para observaciones repetidas a lo largo del^{tiempo 10,11}.

Una ventaja clave de ImAge es su capacidad para revelar trayectorias relacionadas con la edad como características principales intrínsecas de los propios datos, sin requerir regresión en edad cronológica. ImAge ha demostrado una fuerte correlación con la edad cronológica en células mononucleares de la sangre periférica de ratón, y varios órganos^{sólidos 1}. De forma crucial, ImAge captura eficazmente las perturbaciones esperadas de la edad biológica, mostrando un aumento tras el tratamiento de quimioterapia y una disminución con la restricción calórica y la reprogramación parcial mediante expresión transitoria de OSKM en el hígado y el músculo esquelético. Además, se ha observado que las lecturas ImAge se correlacionan inversamente con la actividad locomotora en ratones cronológicamente idénticos, lo que indica su utilidad para medir aspectos de la edad biológica y funcional.

La implementación de la metodología ImAge requiere experiencia tanto en procedimientos experimentales de laboratorio^{húmedo 12} como en análisis^{computacionales 1} (Figura 1); Por ello, este artículo ofrece protocolos integrales y paso a paso para ambos aspectos. Este protocolo optimizado pretende facilitar la adopción generalizada de ImAge, permitiendo a los investigadores investigar los cambios asociados a la edad en la cromatina y la organización epigenética a resolución unicelular en diversos tipos celulares y tejidos. En este protocolo, H3K27ac y H3K27me3, dos marcadores que proporcionan suficiente contraste y resolución para determinar ImAge, fueron seleccionados como marcas representativas. Los investigadores pueden replicar este protocolo para cuantificar el envejecimiento biológico, evaluar el impacto de las intervenciones de longevidad y explorar la heterogeneidad inherente dentro de los procesos de envejecimiento y rejuvenecimiento a nivel individual del organismo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevan a cabo según directrices y protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Instituto de Investigación Scripps (Protocolo 09-0004-6). Los datos presentados en este manuscrito se obtuvieron con ratones machos i4F, de edades comprendidas entre los 2 y los 14 meses. Se extrajeron órganos de interés (hígado y músculo esquelético) de ratones i4F de 13,8 meses y ratones de control de camada tratados durante 1 semana con una dosis baja de doxiciclina (0,2 mg/ml⁾¹⁴. Los núcleos se aislaron de muestras de jóvenes (3,2 meses), de edad (13,8 meses) y de edad tratadas con doxiciclina para sobreexpresar factores OSKM (OSKM de edad avanzada).

1. Imagen de muestras

1. Preparación de muestras
   1. Recoger órganos de interés (hígado y músculo esquelético) de ratones recién diseccionados (u otras especies de interés) y congelar rápidamente con nitrógeno líquido. Guarda las muestras a -80 °C hasta que estén listas para usar.
   2. Transfiere órganos y tejidos a un mortero preenfriado y colocado sobre hielo seco. Vierte nitrógeno líquido sobre el tejido congelado y muele usando un mano de mano preenfriado. Pulveriza la muestra usando el mortero y el mano preenfriados hasta obtener un polvo uniformemente fino.
   3. Aliquot trituró tejido con una espátula metálica preenfriada en varios tubos y almacena muestras no utilizadas a -80 °C.
      NOTA: Las muestras de tejido molido en los tubos pueden almacenarse a -80 °C o proceder con el aislamiento de núcleos.
   4. Extraer núcleos de alicotas congeladas, utilizando un kit de tampón de lisis de núcleos disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante.
   5. Cuenta los núcleos usando Trippan Blue. Mezcla núcleos y azul de tripán en igual proporción en un tubo separado. Transfiere 10 μl de la solución de núcleos de Trypan Blue a un hemocitómetro o a un contador celular automatizado.
   6. Diluir muestras en PBS + 0,5% BSA de modo que se puedan plasmar 10.000 núcleos en un volumen de 20-30 μL/pozo.
2. Preparación del emplatado
   1. Introduce todos los metadatos relevantes para la preparación del chapado y el análisis computacional en el Platemap (proporcionado en el Archivo Suplementario 1). Registra los identificadores de muestra (por ejemplo, números o caracteres) en la misma disposición que la placa real del pozo en la pestaña SampleID. Registrar las condiciones experimentales, incluyendo la antigüedad de la muestra, en el mismo diseño que la placa real del pozo en la pestaña de estado.
      NOTA: La información proporcionada en la pestaña de condición se utilizará para identificar el grupo de edad de cada muestra (es decir, joven o mayor). Estos grupos de edad identificados servirán posteriormente como referencias para construir el modelo de predicción del envejecimiento (ImAge). Por lo tanto, la pestaña de condición debe contener datos que puedan asociarse con la edad, junto con otras condiciones experimentales relevantes según sea necesario.
   2. Registra los biomarcadores objetivo (por ejemplo, H3K27me3) en la misma disposición que la placa real del pozo en la pestaña # (# se reemplaza por un número). Verifica que todas las combinaciones de metadatos coincidan y se reflejen correctamente en un formato de tabla consecutivo en la pestaña de mapas de planchas.
      NOTA: Cada columna de la tabla debe corresponder a un nombre de pestaña designado (por ejemplo, "sampleID"). Se proporciona una pestaña adicional etiquetada como "metadatos" para documentar los objetivos del proyecto y manchar detalles; Esta información no se utilizará en el análisis de datos. Utiliza esta pestaña según lo consideres necesario.
   3. Exporta el mapa de tabulación como formato de archivo csv con el nombre corto y descriptivo del proyecto (por ejemplo, project.csv).
      NOTA: La pestaña de metadatos proporciona una plantilla para resumir los objetivos del proyecto y la información sobre inmunomanchaciones. El uso de la pestaña de metadatos en la plantilla de Platemap es opcional para el propio proceso de platema. Sin embargo, se requieren otras pestañas, incluyendo sampleID, channel# (# se reemplaza por un número), para el análisis computacional.
3. Placar 10.000 núcleos/pozo en un volumen de 20 - 30 μL en una placa de pozo (por ejemplo, placas de 384 pozos). Placa giratoria a 1.000 x g (aceleración nueve, desaceleración 4) durante 10 minutos a 4 °C.
4. Corrige con un volumen 1:1 de paraformaldehído (PFA) al 8% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: Realizar los pasos de la PFA en una campana extractora y desechar los residuos según los procedimientos de seguridad institucional.
5. Retira la solución. Añade 30 μL de 0,1 M glicina en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retira la solución. Lava con 100 μL de PBS 2x y añade 30 μL de PBS para su almacenamiento.
   NOTA: Las células pueden almacenarse a 4 °C o proceder inmediatamente con la inmunomarcaje.
6. Inmunomarcado
   1. Elimina PBS. Añade 30 μL de solución bloqueante (2% BSA y 0,5% Triton X-100 en PBS) e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Quita la solución de bloqueo.
   2. Añadir 25 μL de anticuerpos primarios: anti-H3K27ac de ratón (1:250) y anti-H3K27me3 de conejo (1:250) diluidos en tampón bloqueante (0,4 - 2 μg/mL). Incubar durante la noche a 4 °C.
   3. Retira la solución primaria de anticuerpos. Lava con 100 μL de PBS 3 veces durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   4. Añade 25 μL de anticuerpos secundarios: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) y Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) diluidos en buffer bloqueante (1 - 10 μg/mL). Incubar durante 2 horas a 4 °C o 1 hora a temperatura ambiente.
   5. Lava con 100 μL de PBS 3 veces durante 3 minutos a temperatura ambiente. Tinte con DAPI/Hoechst a 30 μL de concentración de 0,01 mg/mL. Lava con 100 μL de PBS.
      NOTA: Guarda el plato a 4 °C en papel de aluminio o procede inmediatamente a la imagen. DAPI/Hoechst es necesario para el paso de segmentación de núcleos.
7. Imagen
   1. Celdas de imagen en un generador de alta resolución para máxima resolución (para este conjunto de datos se usó 20x, pero se recomienda 63x).
      NOTA: Aunque la imagen puede realizarse con cualquier imagen de alto contenido, este protocolo asume una estructura plana de carpetas de imágenes adquiridas y un formato genérico de imagen (por ejemplo, .tiff) como salida de imagen adquirida (Figura 2).
   2. Recoge múltiples campos por pozo y múltiples pilas z, idealmente cubriendo de arriba a abajo los núcleos celulares. Una cobertura de 10 μm junto con el eje z (por ejemplo, 20 cortes z a un paso z de 0,5 μm) suele cubrir la mayoría de los núcleos de las células del ratón. El tamaño y la cobertura requerida dependen de la especie y los tipos celulares de interés. La imagen representativa se muestra en la Figura 3.
   3. Transfiere los datos de imagen al ordenador donde se realizará el análisis computacional, siguiendo la estructura de carpetas presentada en la Figura 2.
   4. Añadir el prefijo anotado entre corchetes del nombre del proyecto definido en el paso 1.2.2 anterior a la carpeta de datos de imagen (por ejemplo, [proyecto]original_folder_name)

2. Análisis computacional de datos de imagen

1. Preparación de requisitos de software del sistema (Requerida solo para la configuración inicial)
   1. Instala Windows Subsystem for Linux (WSL) si estás funcionando en un equipo con Windows siguiendo las instrucciones en https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Instala Anaconda o Miniconda siguiendo las instrucciones en https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
2. Preparación del entorno computacional (necesaria solo para la configuración inicial)
   1. Descarga los scripts de flujo de trabajo desde el repositorio de github https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Descomprime el archivo descargado.
      NOTA: La ubicación de almacenamiento de datos puede designarse arbitrariamente; sin embargo, se recomienda seleccionar un directorio distinto de la ubicación de almacenamiento de archivos del sistema (por ejemplo, la unidad C en Windows).
   2. Organizar el repositorio ImAge clonado para que coincida con la estructura de carpetas asumida para la ejecución correcta del script (Figura 2).
   3. Abre la aplicación de terminal si funcionas en Linux o macOS. Abre la app WSL si estás usando Windows.
   4. Cambia la carpeta al archivo del repositorio clonado. A partir de ahí, el término Comando: denota una instrucción para copiar y pegar el código subsecuente en la aplicación del terminal, seguida de pulsar la tecla Enter .
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      NOTA: Sustituye "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" por la configuración específica de usuario. Por ejemplo, cuando el repositorio se descomprime en la carpeta "analysis" de la unidad D y se accede desde WSL, esto será "/mnt/d/analysis".
   5. Crea un nuevo entorno computacional con Python versión 3.10 usando conda (aplicación de línea de comandos instalada con Anaconda/miniconda).
      Comando: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. Activa el entorno recién creado.
      Comando: conda activar ImAge_workflow
   7. Instala poetry (un gestor de paquetes en python) usando pip installer (instalador de paquetes python al crear el entorno ImAge_workflow).
      Comando: instalar pip poesía
   8. Instala paquetes de Python previos usando Poetry.
      Command: poetry install
      PRECAUCIÓN: Asegúrate de que la carpeta actual es la carpeta ImAge_workflow, lo cual puede verificarse ejecutando un comando: pwd.
   9. Configura CUDA dentro del entorno Conda para habilitar la funcionalidad de unidad de procesamiento gráfico (GPU) en el paso de segmentación para un cálculo más rápido (solo aplicable para Linux o PC con Windows con GPU Nvidia).
      Comando: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIJO/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir en $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; hacer si [ -d "$dir/lib" ]; luego exporta LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      NOTA: Los scripts detectan automáticamente la disponibilidad de la GPU en el servidor. Si no hay GPUs disponibles, por defecto funcionará en la CPU.
3. Ejecuta los cálculos como se describe a continuación.
   NOTA: El análisis computacional consta de cuatro pasos: segmentación de núcleos, extracción de características de imagen, construcción del eje de envejecimiento (ImAge) y predicción de ImAge. Cada proceso se realiza usando scripts en Python; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features y o4_ImAge_validation. Todos estos pasos están incluidos en un único script Python, main.py. Las lecturas ImAge extraídas pueden visualizarse usando un gráfico de caja y violín como se presenta en Figura 4. La lectura ImAge también puede extraerse en un formato de tabla sencillo (formato estándar .csv archivo), con muestras representadas como filas y las correspondientes lecturas y metadatos como columnas. Los usuarios tienen la flexibilidad de realizar análisis numéricos adicionales en las lecturas de ImAge según sea necesario. Estos gráficos y el archivo CSV pueden obtenerse usando un solo script en Python, visualization.py. El proceso de predicción ImAge utiliza señales bootstrap obtenidas de células individuales dentro del mismo tejido. Estas señales bootstrapadas son señales promediadas derivadas de muestreo aleatorio e iteraciones repetidas. Este enfoque pretende asegurar que el análisis capture las lecturas más fiables y representativas, con la incertidumbre del análisis proporcional a la heterogeneidad inherente del tejido.
   1. Abre la aplicación de terminal si funcionas en Linux o macOS. Abre la app WSL si estás usando Windows.
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      PRECAUCIÓN: Asegúrate de que la carpeta actual es la carpeta ImAge_workflow, lo cual puede verificarse ejecutando un comando: pwd.
   2. Activa el entorno.
      Comando: conda activar ImAge_workflow
   3. Configura los parámetros de análisis en el flujo de trabajo/archivo main.py en el editor de código o texto (por ejemplo, la app Notepad, Microsoft Visual Studio Code, etc.).
      1. Establece el nombre del proyecto en la variable p a un identificador corto y seguro para el sistema de archivos usado para organizar las salidas (por ejemplo, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Establece la lista de canales para la extracción de características en el capítulo de caracteres. Incluye el canal de segmentación si se requieren características de ese canal para el análisis (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Mapea identificadores de canales de imagen desde nombres de archivos hasta columnas de mapas de placas usando imageIndex. Determina el formato de etiqueta de canal que utiliza el sistema de imagen para adquirir datos de imagen y utiliza esa etiqueta como clave. Asigna cada etiqueta a la cabecera exacta y sensible a mayúsculas y minúsculas en el mapa de placas guardado en el paso 1.2.2 (por ejemplo, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
         PRECAUCIÓN: Los nombres de las columnas son sensibles a mayúsculas minúsculas y deben corresponder al archivo de tu mapa de matrículas.
      4. Establece ubicaciones de datos: orgDataLoadPath a la raíz del conjunto de datos, orgDataSubfolder a la subcarpeta de imagen si es necesario, y resultsSavePath a la raíz de salida.
      5. Confirma la extensión del nombre de archivo en imageFileFormat y edita imageFileRegEx para usar grupos de captura con nombre en Python para todas las partes requeridas: fila, col, campo, zposición y canal. Utiliza la siguiente sintaxis: (? P\d+), donde GROUP se reemplaza por fila, col, campo, zposición o canal.
         NOTA: Actualiza la regex si los nombres de archivo difieren; todos los grupos nombrados deben analizar correctamente. Por ejemplo, el nombre del archivo r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff debe convertirse a lo siguiente: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Configura el canal de segmentación en segmentation_ch al canal nuclear utilizado para la detección de objetos (por ejemplo, segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Decide si usar la corrección de iluminación configurando illumiCorrection. Configura en Verdadero para calcular y aplicar modelos BaSiC; configurado en False para procesar imágenes en bruto.
         NOTA: Para placas con ≥ 25 pozos, se recomienda la corrección de iluminación para reducir el sesgo sistemático.
      8. Establece el tamaño físico del vóxel en micrómetros en voxel_dim como [z, y, x]. Utiliza metadatos del microscopio para determinar el espaciado (por ejemplo, voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Guarda el archivo y cierra el editor tras verificar cada parámetro
   4. Ejecuta scripts para obtener lecturas ImAge y realizar validaciones. Mientras ejecutas el script, no cierres la terminal ni la app WSL.
      Comando: flujo de trabajo/main.py en Python
      NOTA: El script (main.py) abarca todos los pasos, incluyendo segmentación, extracción de características, construcción del eje ImAge y predicción por defecto. El script generará un tiempo estimado de finalización para cada paso (por ejemplo, segmentación de núcleos). Cada proceso (por ejemplo, o1_illumination_correction) generará archivos intermedios en formato .pickle que contienen los resultados de cada proceso. Sin embargo, esto está destinado únicamente a la transferencia de datos entre procesos para garantizar un procesamiento estandarizado y no está destinado a la manipulación por parte de los usuarios en este artículo. No obstante, si los usuarios necesitan manipular o adoptar estos archivos, consulte la documentación incluida en cada función de Python para la forma y los tipos de datos¹³.
   5. Visualiza los resultados y exporta las lecturas en bruto de ImAge para análisis adicionales en software externo. Comando: flujo de trabajo/visualization.py en Python
      NOTA: Este paso produce cifras y tablas de lecturas de ImAge, y los archivos están ubicados en fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN y export_o4_ImAge_validation, respectivamente (Figura 2).

Resultados

Las imágenes representativas deben estar bien pobladas para obtener células individuales, pero los núcleos individuales no deben estar en contacto entre sí, ya que eso degradaría la calidad de la segmentación de núcleos celulares. La Figura 3 muestra la imagen representativa para obtener resultados robustos de análisis computacional.

Los resultados presentados en este manuscrito de métodos están adaptados del manuscrito ImAge de Á...

Discusión

Preparación de muestras
Para la preparación de la muestra, recolecta rápidamente los tejidos de interés y congela inmediatamente en nitrógeno líquido. Al moler tejido con un mortero y un mortero, se puede usar una cubierta de silicona para evitar la pérdida de muestras. Añade más nitrógeno líquido si el tejido es difícil de pulverizar. Para tejidos más frágiles, las muestras también pueden procesarse frescas (en lugar de congeladas) para reducir la interrupción mecáni...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich & nbsp;	A9647
Anti-IgG Anti-Ratón Donkey (H+L) Anticuerpo Secundario Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa 488	Invitrogen	A-21202
Anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo Secundario Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
Glicina	Bio-Rad	161-0718
Histona H3K27ac anticuerpo (mAb)	Motivo activo	39685
Anticuerpo histona H3K27me3 (pAb)	Motivo activo	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Kit de aislamiento de núcleos: Preparación EZ de núcleos	Sigma-Aldrich	NUC101
Opereta CLS High Content Imager	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldehído 16% de solución acuosa de grado EM	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
Microplaca de 384 pozos de Fenoplaca	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
Solución Trippan Blue, 0,4%	Gibco y nbsp;	15250061