Análisis específico del subtipo celular del proteasoma de membrana neuronal en neuronas somatosensoriales

Summary

El proteasoma de membrana neuronal (NMP) se identificó recientemente en un subconjunto de neuronas somatosensoriales como un regulador clave del tacto, el dolor y la percepción de la picazón. Este artículo presenta un flujo de trabajo sólido para analizar la expresión y función de NMP específica del tipo de célula mediante clasificación celular, perfiles de transcriptoma y análisis inmunofluorescentes basados en cultivos.

Abstract

La señalización neuronal sensorial depende de los proteasomas funcionales y su localización subcelular influye en la función. Un complejo de proteasoma especializado, el proteasoma de membrana neuronal (NMP), se identificó recientemente en una subpoblación de neuronas somatosensoriales periféricas. La NMP se localiza exclusivamente en la membrana plasmática del soma y en los axones proximales y distales. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) reveló que, en condiciones normales, el NMP se expresa predominantemente en las neuronas MrgprA3⁺ y Cysltr2⁺, que median la sensación mecánica, de picazón y dolor. La inhibición aguda y selectiva de NMP en la piel de la pata de ratones redujo la sensibilidad mecánica y al dolor sin afectar la sensación térmica. En particular, a diferencia de la inhibición global del proteasoma, la inhibición selectiva de NMP no causa neuropatía. Los estudios in vitro sugieren que el NMP facilita la comunicación de neurona a neurona, potencialmente a través de la liberación de péptidos de señalización, y es esencial para las respuestas neuronales normales a la estimulación. Estos hallazgos identifican el NMP como un regulador clave de la diafonía neuronal sensorial requerida para el tacto normal, el dolor y la sensación de picazón. Por lo tanto, el NMP representa un objetivo potencial para el manejo del dolor. Este artículo presenta métodos para aislar poblaciones neuronales que expresan y no expresan NMP mediante alimentación de anticuerpos y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estas poblaciones son adecuadas para el perfil de expresión específico del tipo de célula a través de scRNA-seq o análisis basados en cultivos de la dinámica de expresión de NMP. Juntos, estos métodos proporcionan un flujo de trabajo sólido para investigar la dinámica de expresión de NMP y su contribución a las condiciones de enfermedad relevantes para el dolor.

Introduction

La función del proteasoma es esencial para el desarrollo y mantenimiento óptimos del sistema nervioso periférico (SNP)1,2,3,4,5,6. Tanto los estudios in vitro como in vivo con inhibidores del proteasoma demuestran que la actividad proteasómica es crucial para el neurodesarrollo, la mielinización, la excitabilidad y la función de las células gliales 7,8,9,10.^<....

Protocol

Todos los métodos descritos con animales de experimentación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Stritch de la Universidad Loyola de Chicago.

1. Preparación de soluciones de digestión, medios DRG y medios FACS

1. Prepare una solución salina completa (CSS) que contenga 137 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 1 mM de MgCl_{2,6H 2}O, 25 mM de sorbitol, 10 mM de HEPES y 3 mM de CaCl_{2,2H 2}O. Ajuste el pH a 7,2 con NaOH y esterilice con filtro.
2. Prepare la solución de trabajo de la mezcla de e....

Results

La capacidad de distinguir entre el NMP y los proteasomas intracelulares se basa en enfoques de etiquetado impermeables a la membrana. La alimentación con anticuerpos permite el uso de anticuerpos específicos de subunidades de proteasoma en neuronas vivas para etiquetar proteasomas accesibles solo desde el exterior de la célula. Debido a su tamaño e hidrofilia, los anticuerpos no pueden atravesar las membranas celulares intactas²⁴. Las neuronas vivas mantienen la i.......

Discussion

Los proteasomas son esenciales en todas las células y se pueden encontrar en todos los compartimentos de la célula¹⁹. El reciente descubrimiento de un complejo de proteasoma especializado, el NMP, en las neuronas de los sistemas nerviosos central 25,26,27 y periférico ²⁰ ha cambiado nuestra comprensión actual de la función de los proteasomas. Traba.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M de solución tampón HEPES, pH 7,3	Calidad Biológica	118-089-721	Zona de influencia FACS
10x PBS	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Zona de influencia FACS
Solución madre de paraformaldehído (PFA) al 16%; Grado EM	EMS	15710	solución fijadora
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Fisher Scientific	10-010-023	Lavados FACS
Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml	Fisher Scientific	14-959-6	Tubos FACS
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Etiquetas células muertas
Suplemento B27	Thermo Fisher Scientific	17504044	medio de cultivo
Albúmina sérica bovina	MilliporeSigma	A9647; CAS: 9048-46-8	BSA/TI/DMEM
El cloruro de calcio dihidratado (CaCl?-2H? O)	MilliporeSigma	C7902	Solución salina completa
Cadena pesada anti-neurofilamentos de pollo (NF-H)	MilliporeSigma	AB5539	anticuerpo
DMEM/F12 1:1	Thermo Fisher Scientific	11320033	medio de cultivo; BSA/TI/DMEM
IgG anticabra burro (H+L) Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	Referencia A32816	anticuerpo
Burro anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	Referencia A32790	anticuerpo
DyLight 405 burro antipollos	Inmunoinvestigación de Jackson	703-475-155	anticuerpo
EDTA	MilliporeSigma	E5134; CAS: 6381-92-6	Soluciones de trabajo de papaína Liberase TM/Liberase TL
Suero fetal bovino (FBS)	MilliporeSigma	Referencia A9647	medio de cultivo/solución tampón/bloqueo FACS
Pipeta pasteur de vidrio, 9 pulgadas	Fisher Scientific	1367820D	Valoración
Cabra anti-PSMA2	Hecho en casa	NA	anticuerpo
HEPES en polvo	MilliporeSigma	H4034	Solución salina completa
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H21492	mancha nuclear
Suero de caballo	Thermo Fisher Scientific	26050070	Solución de bloqueo
IB4, conjugado de biotina	MilliporeSigma	L2140	anticuerpo
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	plato de cultivo
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081	medio de cultivo
Trituración de liberasa baja (TL)	MilliporeSigma	54010200001	Solución madre Liberase TL
Trituración de liberasa moderada (TM)	MilliporeSigma	5401119001	Solución madre Liberase TM
El cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl?-6H? O)	MilliporeSigma	M2393	Solución salina completa
Medios de montaje	SouthernBiotech	0100-01	Fluoromount-G
Papaína	Worthington	# de catálogo: 9001-73-4	Solución de trabajo Liberase TL-papain
Penicilina/estreptomicina	MilliporeSigma	15140122	medio de cultivo/tampón FACS
Bromhidrato de poli-L-lisina (PLL)	MilliporeSigma	P4707	plato de cultivo
Cloruro de potasio (KCl)	MilliporeSigma	P5405	Solución salina completa
Conejo anti-CGRP	Inmunoestrella	24112	anticuerpo
cloruro de sodio (NaCl)	MilliporeSigma	S9888; CAS: 7647-14-5	Solución salina completa
Sorbitol	MilliporeSigma	56755-M	Solución salina completa
Conjugado de estreptavidina Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	S21374	anticuerpo
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389-500G	solución fijadora
Inhibidor de tripsina	MilliporeSigma	T9253; CAS: 9035-91-8	BSA/TI/DMEM