Análisis específico del subtipo celular del proteasoma de membrana neuronal en neuronas somatosensoriales

La función del proteasoma es esencial para el desarrollo y mantenimiento óptimos del sistema nervioso periférico (SNP)1,2,3,4,5,6. Tanto los estudios in vitro como in vivo con inhibidores del proteasoma demuestran que la actividad proteasómica es crucial para el neurodesarrollo, la mielinización, la excitabilidad y la función de las células gliales 7,8,9,10. Además, la quimioterapia basada en inhibidores del proteasoma induce neuropatías dolorosas en el 30-60% de los pacientes, a menudo caracterizadas por dolor crónico y alteración de la sensibilidad en las extremidades 8,9,11,12,13. Curiosamente, la administración de dosis bajas de estos mismos inhibidores reduce la sensibilidad a los estímulos dolorosos, lo que sugiere un papel complejo del proteasoma en el procesamiento sensorial ^6,14,15. Sin embargo, a pesar de estos extensos estudios, la función específica de los proteasomas en el SNP ha permanecido poco conocida.

Los proteasomas son la principal maquinaria de degradación de proteínas en todos los dominios de la vida y son esenciales para mantener la homeostasis de las proteínas¹⁶. El proteasoma central 20S está compuesto por cuatro anillos heptáméricos de subunidades α, β, β α y media la degradación de proteínas independientes de la ubiquitina^17,18. La asociación con partículas reguladoras forma el proteasoma tapado con 26S y 30S, que media la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina ^4,17. En las neuronas, se han identificado proteasomas en todos los compartimentos celulares y se sabe que su localización subcelular influye en la función¹⁹. Sin embargo, muchos inhibidores del proteasoma de uso común carecen de especificidad para dirigirse selectivamente a poblaciones de proteasomas localizadas diferencialmente.

De hecho, utilizando inhibidores del proteasoma impermeables a la membrana y etiquetado de anticuerpos en células no permeabilizadas, se encontró que un complejo de proteasoma específico de neuronas se localizaba en la membrana plasmática en un subconjunto de neuronas somatosensoriales²⁰. El análisis scRNA-seq de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal primaria (DRG), separadas en poblaciones NMP⁺ y NMP^- mediante la alimentación de anticuerpos contra una subunidad de proteasoma y la clasificación FACS, dio como resultado 20 grupos celulares transcripcionalmente distintos²⁰. Un análisis posterior reveló que las células NMP⁺ se agruparon en solo 3 de los 20 grupos. Utilizando conjuntos de marcadores genéticos para subtipos neuronales específicos, se identificaron 13 subtipos diferentes de neuronas somatosensoriales²⁰. La mayoría de las neuronas NMP⁺ se agruparon con las neuronas sensoriales MrgprA3⁺ y Cysltr2^{+ 20}. Un número mínimo de células NMP⁺ se agruparon en un tercer grupo, en el que no se identificaron conjuntos de genes específicos, por lo que este grupo se dejó sin asignar²⁰. Las neuronas MrgprA3⁺ y Cysltr2⁺ son nociceptores de tipo C, sensibles al calor, estímulos mecánicos y pruritogénicos, correspondientes a los subtipos neuronales CGRP-θ y SST, respectivamente^21,22. De los 20 grupos celulares identificados, 7 grupos de NMP^- expresaron marcadores genéticos consistentes con células no neuronales, incluidas las células de Schwann, la glía satélite y las células inmunes, y también se dejaron sin asignar²⁰. Estas poblaciones celulares eran esperadas, ya que no es posible separar las células no neuronales de las neuronales durante el cultivo de neuronas DRG²⁰.

Al investigar su función, la inhibición in vitro del NMP alteró la excitabilidad neuronal a la estimulación de KCl, histamina y αβ-metilenadenosina 5'-trifosfato²⁰. In vivo, la inhibición de NMP redujo la sensibilidad a estímulos mecánicos y dolorosos sin efectos sobre la sensación térmica²⁰. Estos hallazgos revelan que la NMP es un regulador clave de la sensación mecánica, de dolor y picazón, y un objetivo terapéutico potencial para el manejo del dolor²⁰. Sin embargo, los mecanismos específicos que vinculan la actividad de NMP con el desarrollo del dolor en diferentes contextos de enfermedad siguen siendo poco conocidos. Por lo tanto, se justifica una mayor investigación sobre la dinámica y la función de la expresión de NMP en afecciones asociadas con el dolor y la neuropatía.

Aquí, este artículo describe un flujo de trabajo sólido (Figura 1) para identificar y aislar poblaciones neuronales NMP⁺ DRG. Este enfoque permite la investigación específica del tipo de célula de la dinámica de la expresión de NMP mediante la clasificación FACS, scRNA-seq y la inmunotinción. Estos enfoques permiten un análisis de alta resolución de la expresión de NMP de una manera específica del tipo de célula, que se puede utilizar para investigar el papel de la NMP en condiciones normales y diversas asociadas al dolor.

Todos los métodos descritos con animales de experimentación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Stritch de la Universidad Loyola de Chicago.

1. Preparación de soluciones de digestión, medios DRG y medios FACS

1. Prepare una solución salina completa (CSS) que contenga 137 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 1 mM de MgCl_{2,6H 2}O, 25 mM de sorbitol, 10 mM de HEPES y 3 mM de CaCl_{2,2H 2}O. Ajuste el pH a 7,2 con NaOH y esterilice con filtro.
2. Prepare la solución de trabajo de la mezcla de enzimas de disociación tisular (trituración moderada) combinando 190 μL del stock (5 mg/mL en H₂O), 84 μL de EDTA 50 mM y 6,5 mL de CSS. Preparar fresco y filtrar y esterilizar antes de usar.
3. Preparar una mezcla de enzimas de disociación tisular (baja trituración)-solución de papaína que contenga 190 μL de solución madre de mezcla de enzimas, 150 μL de papaína, 84 μL de EDTA 50 mM y 6,5 mL de CSS. Preparar fresco y filtrar y esterilizar antes de usar.
4. Preparar la solución de BSA/TI/DMEM combinando 7,5 mg de inhibidor de tripsina y 7,5 mg de BSA en 5 ml de medio DMEM/F12. Preparar fresco y filtrar-esterilizar.
5. Prepare los medios neuronales DRG combinando un 10% de suero fetal bovino (FBS), un 1% de penicilina/estreptomicina, un 1% de glutamina y un 2% de suplemento 50x B27 en 430 ml de DMEM/F12.
6. Prepare el tampón FACS combinando FBS al 1%, 1x PBS, HEPES 25 mM y penicilina/estreptomicina al 1% en agua esterilizada en autoclave. Preparar fresco y filtrar-esterilizar.
7. Veinticuatro horas antes del inicio del protocolo, recubrir dos tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml llenándolos con tampón FACS y colocándolos a 4 °C.

2. Preparación de la suspensión de neuronas DRG unicelulares

1. Coseche todos los DRG de 4-6 ratones P20-P23 siguiendo los métodos descritos anteriormente^20,23.
2. Transfiera los DRG a un tubo cónico de 15 ml y agregue 7 ml de solución de trabajo de mezcla de enzimas de disociación tisular (trituración moderada). Incubar con agitación suave (girando) a 37 °C durante 20 min.
3. Centrifugar los ganglios a 120 × g durante 2 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo y vuelva a suspender los ganglios en 7 ml de solución de trabajo de mezcla de enzimas de disociación tisular (baja trituración) y papaína. Incubar con agitación suave (girando) a 37 °C durante 15 min.
4. Centrifugar a 120 × g durante 2 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los ganglios en 500 μL de solución de BSA/TI/DMEM.
5. Triture los ganglios 12-16x con una pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego tapada de 1 ml.
6. Filtre los desechos celulares pasando las células a través de un filtro celular de 40 μm. Lave el colador con 1 ml de solución BSA/TI/DMEM para asegurar la recolección de todas las neuronas DRG. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
7. Centrifugar a 120 × g durante 2 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de medio DRG.
   NOTA: Esta es la suspensión de neuronas DRG de una sola célula.

3. Alimentación de anticuerpos para etiquetar neuronas positivas para NMP

1. Divida la suspensión de neuronas DRG en dos tubos de 1,5 ml, cada uno con 500 μl, y etiquete los dos tubos: "primario" y "no primario".
2. Agregue 20 μL de anticuerpo antiproteasoma 20S subunidad alfa 2 (PSMA2) de cabra al tubo marcado como "primario" (dilución 1:25).
   1. Opcional: Para probar la integridad de la membrana y la especificidad del anticuerpo PSMA2, incluya una muestra adicional de DRG primarios incubados con cadena pesada de antineurofilamentos de pollo (NF-H) (1:1.000) seguida de antipollo (p. ej., conjugado con 488) secundario (1:250) (paso 3.10).
      NOTA: El control de etiquetado anti-NF-H no debe dar como resultado ningún etiquetado celular si la membrana neuronal está intacta.
3. Incubar las células bajo agitación suave durante 30 min a 37 °C.
4. Filtrado en caliente, esterilizado 1x PBS durante la incubación de anticuerpos primarios.
5. Centrifugar los tubos a 200 × g durante 2 min y eliminar el 90% del sobrenadante (desechar).
6. Resuspender las neuronas en 500 μL de PBS 1x caliente. Incubar los tubos con agitación suave durante 3 min a 37 °C.
7. Repita los pasos 3.5-3.6 para un total de tres lavados.
8. Mientras se realizan los pasos de lavado, prepare un anticuerpo secundario diluyendo 4 μL de IgG anti-cabra (fluoróforo de 555 nm) en 1.000 μL de medios DRG calientes (dilución 1:250).
9. Después del tercer lavado, vuelva a suspender los tubos "primarios" y "no primarios" en 500 μL de la solución de anticuerpos secundarios.
   NOTA: A partir de este momento, proteja los tubos de la luz envolviéndolos con papel de aluminio.
10. Incubar los tubos con agitación suave durante 40 min a 37 °C.
11. Lave las celdas repitiendo los pasos 3.5-3.6 para un total de tres lavados.
12. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las neuronas en 300 μL de tampón FACS. Transfiera las celdas resuspendidas a tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml separados y colóquelos sobre hielo en un cubo de hielo con tapa para protegerlo de la luz.
13. Coloque los tubos de fondo redondo pretratados que contienen tampón FACS del día anterior en el cubo de hielo con los tubos que contienen las celdas y continúe con el paso de clasificación FACS.

4. Separación de neuronas NMP positivas (NMP⁺) y NMP negativas (NMP^-) mediante clasificación FACS

1. Inmediatamente después de la alimentación con anticuerpos y el etiquetado de las neuronas DRG, lleve las células y los tubos recubiertos a un clasificador FACS.
2. Agregue 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (1: 1,000) a los tubos "primarios" y "no primarios". Incubar durante 10-30 min en hielo.
   NOTA: 7-AAD se utiliza para excluir las células muertas del proceso de clasificación.
3. Retire el tampón FACS de los tubos que se recubrieron durante la noche y reemplácelos con 1 ml de tampón FACS nuevo. Estos tubos sirven como tubos de recolección para las neuronas clasificadas.
4. Use el tubo etiquetado "sin primario" para establecer parámetros y compuertas para neuronas no marcadas.
5. Aplique la activación de dispersión directa (FSC) para aislar células consistentes con el tamaño de las neuronas sensoriales. Los diámetros de las neuronas sensoriales varían de 10 a 50 μm.
6. Aplique la compuerta de dispersión lateral (SSC) para excluir células muertas y desechos (dispersión lateral inferior) y para aislar eventos consistentes con la granularidad de las neuronas DRG (dispersión lateral más grande).
7. Cargue el tubo "primario" y establezca los parámetros de compuerta según lo establecido con la muestra "no primaria" para detectar poblaciones neuronales no marcadas (NMP^-) y 555-positivas (NMP⁺).
8. Usando una boquilla de 100 μm y una presión de clasificación de 15-20 psi, clasifique las neuronas en 555⁺ y 555^-.
9. Proceda al análisis posterior de las neuronas clasificadas.

5. Secuenciación de ARN unicelular de neuronas NMP⁺ y NMP^-

1. Transfiera las celdas clasificadas a tubos de 1,5 ml y colóquelas en hielo. Transportar las células a un núcleo de secuenciación unicelular.
2. Realice la secuenciación de ARN de una sola célula en las neuronas clasificadas NMP⁺ y NMP^- a una profundidad de 30.000 a 100.000 lecturas por célula.
3. Analice los datos de scRNA-seq utilizando varios programas de software disponibles gratuitamente para generar grupos de células de acuerdo con perfiles específicos de expresión génica. Para más detalles sobre los pasos de análisis y los programas utilizados anteriormente, consulte Villalón Landeros et ^al.20.
4. Construya una lista de marcadores genéticos específicos para identificar poblaciones neuronales individuales utilizando bases de datos disponibles como https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ o https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
5. Utilice la lista de marcadores genéticos específicos para identificar los grupos de células resultantes.
   NOTA: El análisis scRNA-seq realizado anteriormente fue realizado por una empresa consultora independiente (www.cmcherryconsulting.com).

6. Cultivos primarios de neuronas NMP⁺ y NMP^- enriquecidas

1. El día antes del experimento, coloque cubreobjetos redondos de 12 mm en una placa de cultivo de 24 pocillos (1 cubreobjetos/pocillo) y lave con etanol al 70% durante 15 min. Luego, enjuague con agua estéril 3 veces y seque al aire en una campana de cultivo de tejidos estéril.
2. Una vez que los cubreobjetos estén secos, cúbralos con 0,1 mg/ml de bromhidrato de poli-L-lisina (PLL) y colóquelos a 4 °C durante la noche.
3. El día del experimento, retire el PLL, enjuague los cubreobjetos con agua estéril 3 veces y déjelos secar en una campana de cultivo de tejidos.
   NOTA: El PLL se puede guardar y reutilizar.
4. Diluya 10 μL de laminina de 1 mg/mL en 125 μL de medios DRG y coloque 20-30 μL en el centro de cada cubreobjetos.
5. Cubra los cubreobjetos con laminina durante al menos 40 minutos antes de usarlos.
6. Transfiera las células clasificadas por FACS a un tubo de 1,5 ml y centrifugue a 200 × g durante 5 min para recolectar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las neuronas en 50 μL de medio DRG caliente.
7. Aspire la laminina del cubreobjetos y deje que se seque.
8. Siembra 15-20 μL de neuronas resuspendidas en cada cubreobjetos. Mueva con cuidado la placa con cubreobjetos sembrados a una incubadora de cultivo de tejidos e incube durante al menos 30 minutos (no más de 1 h) para permitir que las células se adhieran.
9. Vuelva a colocar la placa en una campana de cultivo de tejidos y agregue 1 ml de medio DRG tibio estéril a cada pocillo que contenga células en cubreobjetos.
   NOTA: Baje la punta de la pipeta hasta la esquina inferior del pocillo y dispense lentamente para evitar tocar el cubreobjetos y alterar las células. Agregar medios demasiado rápido puede crear turbulencias y desalojar células.
10. Mantener los cultivos a 37 °C con 5% de CO₂/95% de humedad con 75% de cambios de medios cada 2-3 días.

7. Análisis de expresión de NMP específico del tipo de célula

1. Prepare una placa de cultivo de 140 mm o una bandeja de tinción de inmunofluorescencia forrándola con un trozo grande de parafilm.
2. Con unas pinzas estériles de 5/45, transfiera los cubreobjetos de la placa de cultivo de tejidos al parafilm de la bandeja de tinción, asegurándose de que el lado que contiene las neuronas DRG quede hacia arriba.
3. Agregue 100 μL de medios DRG a cada cubreobjetos en la parapelícula para evitar que las células se sequen.
   NOTA: Agregue líquidos pipeteando lentamente justo sobre el borde del cubreobjetos.
4. Diluya el anticuerpo primario anti-PSMA2 de cabra en medios DRG calientes a una dilución de 1:20.
5. Con un aspirador equipado con una punta P10 sin filtrar, retire el medio del cubreobjetos lentamente aspirando desde el borde. Agregue 100 μL de solución de anticuerpos anti-PSMA2 de cabra a los cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 40 min.
6. Aspire con cuidado la solución de anticuerpos primarios de los cubreobjetos. Añadir 100 μL de PBS (a temperatura ambiente) e incubar durante 3 min a temperatura ambiente para lavar.
7. Aspire PBS del cubreobjetos y repita la adición y aspiración de PBS para un total de tres lavados.
8. Prepare un anticuerpo secundario anti-cabra (p. ej., 555 conjugado) en medios DRG calientes a una dilución de 1:250.
9. Después del tercer lavado, agregue 100 μL del anticuerpo secundario diluido al cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 40 min.
   NOTA: A partir de este paso, proteja las células de la luz.
10. Aspire la solución de anticuerpos secundarios del cubreobjetos y lávela 3 veces como se describe en los pasos 7.6-7.7.
11. Retire el último lavado de PBS y fije las células agregando 100 μL de solución fijadora que contenga 4% de paraformaldehído (PFA), 4% de sacarosa en 1x PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
12. Aspirar el fijador y lavar 3 veces repitiendo los pasos 7.6-7.7.
13. Permeabilizar las células añadiendo 100 μL de detergente no iónico al 0,1% (por ejemplo, Triton X-100) en 1x PBS e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
14. Aspire la solución permeabilizante y lave 3 veces repitiendo los pasos 7.6-7.7.
15. Añadir 100 μL de solución bloqueante compuesta por un 5% de FBS, un 5% de suero de burro en 1x PBS e incubar a temperatura ambiente durante 40 min.
16. Preparar una mezcla de anticuerpos primarios específicos del tipo de célula neuronal DRG de acuerdo con las siguientes diluciones en la solución de bloqueo: péptido relacionado con el gen anticalcitonina de conejo (CGRP) (1:500); isolectina B4, conjugado de biotina (IB4) (1:50); pollo anti-NF-H (1:1000).
    NOTA: Estos anticuerpos no interfieren entre sí y se pueden sumar en la misma solución.
17. Retire la solución de bloqueo y agregue la mezcla de anticuerpos primarios al cubreobjetos. Incubar a temperatura ambiente durante 45 min.
18. Retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces repitiendo los pasos 7.6-7.7.
19. Prepare la solución de mezcla de anticuerpos secundaria diluyendo estreptavidina (p. ej., conjugada con 647), anti-conejo de burro (p. ej., conjugada con 488) y anti-pollo de burro (p. ej., conjugada con 405) a 1:500 cada uno.
20. Retire el último lavado de PBS y agregue 100 μL de solución de anticuerpos secundarios a los cubreobjetos. Incubar a temperatura ambiente durante 45 min.
21. Lavar 3 veces repitiendo los pasos 7.6-7.7.
22. Opcional: Prepare la tinción nuclear a 1-10 μg/ml. Agregue 100 μL de solución de tinción nuclear, incube durante 30 s a temperatura ambiente y lave 2 veces con agua desionizada (diH₂O) repitiendo los pasos 7.6-7.7.
23. Aspire el último lavado del cubreobjetos y, con unas pinzas de punta fina, levante el cubreobjetos del parafilm. Seque el exceso de líquido tocando suavemente el borde del cubreobjetos con un pañuelo sin pelusa.
24. Coloque una gota de 7 μl de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio. Coloque suavemente el cubreobjetos sobre la gota del medio de montaje, asegurándose de que las celdas estén hacia abajo y en contacto con el medio.
25. Coloque los portaobjetos de microscopio con cubreobjetos en un cajón o caja oscura y seca durante al menos 1 h para que se sequen y sellen el borde del cubreobjetos. Termine de sellar el borde de los cubreobjetos con esmalte de uñas de secado rápido y espere de 10 a 15 minutos antes de obtener imágenes.
26. Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal fluorescente o de disco giratorio equipado con los filtros de luz adecuados para visualizar la fluorescencia azul, verde, roja y roja lejana.

La capacidad de distinguir entre el NMP y los proteasomas intracelulares se basa en enfoques de etiquetado impermeables a la membrana. La alimentación con anticuerpos permite el uso de anticuerpos específicos de subunidades de proteasoma en neuronas vivas para etiquetar proteasomas accesibles solo desde el exterior de la célula. Debido a su tamaño e hidrofilia, los anticuerpos no pueden atravesar las membranas celulares intactas24. Las neuronas vivas mantienen la integridad de la membrana, evitando que los anticuerpos entren en la célula. Usando este enfoque, es posible etiquetar de manera confiable el NMP y distinguir las neuronas que lo expresan (NMP +) de las que no lo hacen (NMP-) (Figura 2A). Las células de control que reciben solo el etiquetado secundario de anticuerpos no muestran el etiquetado de NMP (Figura 2B). Además, este método demuestra que solo una subpoblación de neuronas DRG expresa el NMP. Para separar las neuronas DRG en poblaciones NMP+ y NMP- para estudios adicionales, utilice la clasificación FACS. La clasificación celular de neuronas marcadas con NMP ha arrojado resultados consistentes. El clasificador se ajusta primero para excluir las células muertas y los desechos mediante la aplicación de estrategias de activación de dispersión hacia adelante y hacia los lados para aislar eventos consistentes con el tamaño (>10 μm de diámetro) y la granularidad de las neuronas DRG. Luego, las células se clasifican en poblaciones NMP + y NMP - según la presencia o ausencia de fluorescencia positiva 555 (Figura 3A). La clasificación FACS muestra que las neuronas NMP+ DRG comprenden aproximadamente el 4% de la población celular clasificada, mientras que ~40-60% de las células son NMP- (Figura 3B).

Inmediatamente después de la clasificación FACS de las neuronas NMP+ y NMP-, scRNA-seq se realiza en estudios posteriores para analizar la expresión génica dependiente de NMP en distintas poblaciones neuronales. Los resultados representativos de este análisis de secuenciación se reportan en Villalón Landeros et al.20. Es importante destacar que las células clasificadas siguen siendo viables para el cultivo, lo que permite examinar poblaciones enriquecidas de neuronas NMP+ y NMP- con marcadores específicos del tipo de célula (NF-H, CGRP, IB4) (Figura 4). Esto demuestra que el flujo de trabajo produce poblaciones viables y analizables para análisis moleculares y basados en cultivos.

Figura 1: Flujo de trabajo para el etiquetado, la clasificación celular y el análisis posterior de neuronas NMP+ y NMP-DRG. Descripción general de los pasos necesarios para obtener neuronas DRG, identificar y aislar células que expresan NMP, seguido de scRNA-seq en profundidad para perfiles de expresión específicos del tipo de célula o análisis basados en cultivos de la dinámica de expresión de NMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Alimentación de anticuerpos en suspensión unicelular. (A) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de neuronas en suspensión que muestran el etiquetado selectivo de células NMP+ (rojas) utilizando un anticuerpo contra la subunidad de proteasoma PSMA2. (B) No se observó etiquetado en el control primario de anticuerpos. La fluorescencia verde es representativa de la autofluorescencia celular normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Clasificación celular activada por fluorescencia de neuronas NMP+ marcadas con Alexa Fluor 555. (A) El gráfico FACS (derecha) muestra la identificación de neuronas NMP+ marcadas con Alexa Fluor 555. El gráfico FACS (izquierda) no muestra detección de 555 neuronas positivas en el control no primario. (B) Cuantificación de poblaciones neuronales clasificadas que muestra que las neuronas NMP- representan ~46 % de las células clasificadas, mientras que las neuronas NMP+ representan ~4%. n = 2 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Etiquetado específico del tipo de célula en cultivos neuronales seleccionados. Tinción inmunofluorescente de cultivos neuronales en el día in vitro 4 que muestra un etiquetado representativo de los subtipos neuronales NF-H (verde), CGRP (magenta) e IB4 (amarillo). El azul representa la tinción nuclear con Hoechst. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.