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La función del proteasoma es esencial para el desarrollo y mantenimiento óptimos del sistema nervioso periférico (SNP)1,2,3,4,5,6. Tanto los estudios in vitro como in vivo con inhibidores del proteasoma demuestran que la actividad proteasómica es crucial para el neurodesarrollo, la mielinización, la excitabilidad y la función de las células gliales 7,8,9,10. Además, la quimioterapia basada en inhibidores del proteasoma induce neuropatías dolorosas en el 30-60% de los pacientes, a menudo caracterizadas por dolor crónico y alteración de la sensibilidad en las extremidades 8,9,11,12,13. Curiosamente, la administración de dosis bajas de estos mismos inhibidores reduce la sensibilidad a los estímulos dolorosos, lo que sugiere un papel complejo del proteasoma en el procesamiento sensorial 6,14,15. Sin embargo, a pesar de estos extensos estudios, la función específica de los proteasomas en el SNP ha permanecido poco conocida.
Los proteasomas son la principal maquinaria de degradación de proteínas en todos los dominios de la vida y son esenciales para mantener la homeostasis de las proteínas16. El proteasoma central 20S está compuesto por cuatro anillos heptáméricos de subunidades α, β, β α y media la degradación de proteínas independientes de la ubiquitina17,18. La asociación con partículas reguladoras forma el proteasoma tapado con 26S y 30S, que media la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina 4,17. En las neuronas, se han identificado proteasomas en todos los compartimentos celulares y se sabe que su localización subcelular influye en la función19. Sin embargo, muchos inhibidores del proteasoma de uso común carecen de especificidad para dirigirse selectivamente a poblaciones de proteasomas localizadas diferencialmente.
De hecho, utilizando inhibidores del proteasoma impermeables a la membrana y etiquetado de anticuerpos en células no permeabilizadas, se encontró que un complejo de proteasoma específico de neuronas se localizaba en la membrana plasmática en un subconjunto de neuronas somatosensoriales20. El análisis scRNA-seq de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal primaria (DRG), separadas en poblaciones NMP+ y NMP- mediante la alimentación de anticuerpos contra una subunidad de proteasoma y la clasificación FACS, dio como resultado 20 grupos celulares transcripcionalmente distintos20. Un análisis posterior reveló que las células NMP+ se agruparon en solo 3 de los 20 grupos. Utilizando conjuntos de marcadores genéticos para subtipos neuronales específicos, se identificaron 13 subtipos diferentes de neuronas somatosensoriales20. La mayoría de las neuronas NMP+ se agruparon con las neuronas sensoriales MrgprA3+ y Cysltr2+ 20. Un número mínimo de células NMP+ se agruparon en un tercer grupo, en el que no se identificaron conjuntos de genes específicos, por lo que este grupo se dejó sin asignar20. Las neuronas MrgprA3+ y Cysltr2+ son nociceptores de tipo C, sensibles al calor, estímulos mecánicos y pruritogénicos, correspondientes a los subtipos neuronales CGRP-θ y SST, respectivamente21,22. De los 20 grupos celulares identificados, 7 grupos de NMP- expresaron marcadores genéticos consistentes con células no neuronales, incluidas las células de Schwann, la glía satélite y las células inmunes, y también se dejaron sin asignar20. Estas poblaciones celulares eran esperadas, ya que no es posible separar las células no neuronales de las neuronales durante el cultivo de neuronas DRG20.
Al investigar su función, la inhibición in vitro del NMP alteró la excitabilidad neuronal a la estimulación de KCl, histamina y αβ-metilenadenosina 5'-trifosfato20. In vivo, la inhibición de NMP redujo la sensibilidad a estímulos mecánicos y dolorosos sin efectos sobre la sensación térmica20. Estos hallazgos revelan que la NMP es un regulador clave de la sensación mecánica, de dolor y picazón, y un objetivo terapéutico potencial para el manejo del dolor20. Sin embargo, los mecanismos específicos que vinculan la actividad de NMP con el desarrollo del dolor en diferentes contextos de enfermedad siguen siendo poco conocidos. Por lo tanto, se justifica una mayor investigación sobre la dinámica y la función de la expresión de NMP en afecciones asociadas con el dolor y la neuropatía.
Aquí, este artículo describe un flujo de trabajo sólido (Figura 1) para identificar y aislar poblaciones neuronales NMP+ DRG. Este enfoque permite la investigación específica del tipo de célula de la dinámica de la expresión de NMP mediante la clasificación FACS, scRNA-seq y la inmunotinción. Estos enfoques permiten un análisis de alta resolución de la expresión de NMP de una manera específica del tipo de célula, que se puede utilizar para investigar el papel de la NMP en condiciones normales y diversas asociadas al dolor.