Artículo de método

Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza

898 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19 de septiembre de 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones para la administración intranasal de IAV y el análisis posterior del daño pulmonar del ratón y los cambios transcripcionales asociados a los tipos de células pulmonares.

Resumen

La infección viral causa daño agudo y a largo plazo al alvéolo pulmonar, la estructura tisular especializada responsable del intercambio de gases entre el sistema cardiovascular y el entorno externo. La infección por el virus de la influenza A (IAV) en ratones representa un modelo traslacional para la respuesta del pulmón humano a la infección viral e induce cambios de estado celular transitorios y persistentes en el alvéolo. En algunos casos, los estados celulares aberrantes inducidos por una lesión viral que no se resuelven con el tiempo pueden afectar permanentemente la función crítica de intercambio de gases del pulmón. Este artículo demuestra métodos para la infección intranasal de ratones con A/PR/8/34 IAV y la caracterización de alteraciones transitorias y duraderas en la composición celular y la estructura tisular de los pulmones dañados. Este modelo permite una investigación detallada de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la reparación pulmonar y la disfunción crónica. Este enfoque también ofrece una plataforma para evaluar intervenciones terapéuticas destinadas a promover la regeneración pulmonar efectiva y restaurar la función respiratoria después de una lesión viral.

Introducción

Los pulmones juegan un papel crucial en el suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos locales. Las células endoteliales (CE) que pueblan los pequeños vasos sanguíneos capilares de los pulmones son esenciales para el buen funcionamiento del tejido pulmonar, manteniendo la integridad vascular y el intercambio gaseoso eficiente1. Las CE forman el nicho vascular y se comunican recíprocamente con otras células, como las células epiteliales, las células inmunitarias y las células mesenquimales. Esto contribuye a la regulación del desarrollo pulmonar y de la reparación de tejidos en respuesta a una lesión o enfermedad2.

La infección por el virus de la influenza H1N1 A es un problema mundial3. Los pacientes con infección por H1N1 a menudo son diagnosticados con daño alveolar difuso exudativo (DAD)4. La infección por H1N1 puede provocar daños pulmonares graves y consecuencias graves, como neumonía, lesión pulmonar aguda grave (LPA) y síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)5. El daño surge principalmente del virus que infecta las células epiteliales pulmonares, lo que provoca una respuesta inmune excesiva que resulta en inflamación, daño tisular y acumulación de líquido en los pulmones. Las células epiteliales que recubren las vías respiratorias y los alvéolos, que son responsables del intercambio de gases, son dañadas directamente por el virus H1N1, lo que lleva a la alteración de la estructura normal del pulmón 6,7. Ha quedado claro que otros tipos de células, aunque no están directamente infectadas por IAV, pueden dañarse en respuesta a la infección 8,9. El daño tisular después de la infección por influenza, por lo tanto, afecta a todos los compartimentos celulares del pulmón, y recientemente se ha demostrado que la infección por IAV causa cambios transitorios y persistentes en el estado celular en múltiples compartimentos celulares9. Esta plasticidad celular en respuesta a la enfermedad puede ser útil o perjudicial para la reparación exitosa de los tejidos y justifica más estudios.

El modelo experimental más adoptado para estudiar la influenza y su patogénesis es la infección intranasal de ratones con el virus de la influenza A/PR/8/3410. Es una técnica importante que permite el estudio de la gravedad de la enfermedad, la mortalidad y la infectividad viral. La infección intranasal de ratones imita la ruta natural de infección en humanos y permite el estudio de las respuestas inmunitarias adaptativas e innatas contra el virus. En 1934, se aisló una cepa específica del virus de la influenza A "A/PR/8/34" de un paciente en Puerto Rico11. Esta cepa del virus de la influenza ahora se ha adaptado a los ratones y ya no infecta productivamente a los humanos. Debido a las similitudes en los sistemas inmunológicos de ratones y humanos, los ratones son el modelo animal más popular para la investigación de IAV12. En este método, la cepa A/PR/8/34 H1N1 se administra directamente a los ratones a través de las fosas nasales, imitando una infección natural13. Es un método fácil, rentable y conveniente para estudiar los efectos de la infección viral en el tejido pulmonar del huésped en condiciones de tipo salvaje (WT) y knockout (KO). Las técnicas alternativas tienen ventajas y desventajas en comparación con el modelo intranasal. La inoculación intratraqueal (IT) permite la administración precisa del virus a los pulmones, pero esta técnica no imita completamente la infección por inhalación y no proporciona información sobre la toxicidad en el tracto respiratorio superior. La inoculación IT también requiere una gran habilidad para reducir el riesgo de lesión traqueal13,14. La inoculación por inhalación de aerosol (AR) imita la ruta natural de la infección y crea una patología pulmonar más uniforme en comparación con la infección intranasal, pero puede ser difícil mantener una concentración uniforme del virus en el aerosol y lograr una administración precisa del aerosol viral. La seguridad también es una preocupación importante del método de inoculación AR10. Por lo tanto, la técnica de inoculación intranasal de la administración de IAV es un enfoque crucial para la investigación centrada en los pulmones sobre los efectos posteriores de la infección viral en la lesión y reparación de tejidos. A diferencia de los modelos químicos o mecánicos, proporciona una forma más realista y menos invasiva de estudiar el daño pulmonar inducido por la influenza y las interacciones huésped-patógeno.

Aquí, establecemos un método reproducible para la infección intranasal de ratones con el virus de la influenza A (A / PR / 8/34) y para caracterizar los cambios celulares y estructurales a corto y largo plazo en el alvéolo pulmonar que resultan de la lesión viral. Los estudios que utilizan este método pueden ayudar en el descubrimiento de mecanismos de daño y reparación del tejido pulmonar para identificar nuevos objetivos terapéuticos para enfermedades pulmonares.

Protocolo

Trabajar con el virus de la influenza A en un modelo animal se considera nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y nivel de bioseguridad animal 2 (ABSL2). Todos los procedimientos en animales utilizados para generar estos datos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud (Protocolo # 24-452). Este protocolo también está aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad del Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud. Antes de comenzar este protocolo, se recomienda que los usuarios busquen la aprobación de su comité institucional de cuidado y uso de animales y del comité institucional de bioseguridad.

1. Preparación del material de trabajo

NOTA: Todo el trabajo con el virus de la influenza debe realizarse en hielo en un gabinete de bioseguridad. Expulse las puntas y cualquier otra cosa que entre en contacto con el virus en un recipiente con lejía al 10%. Los cubos de hielo, las pipetas y las cajas de puntas deben rociarse con una solución de lejía al 10% en lugar de sumergirse. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Deseche los desechos sólidos en un contenedor de desechos de riesgo biológico y deseche los desechos líquidos por el fregadero, enjuagando con agua.

  1. Descongele el caldo congelado (0,5 ml) de virus en hielo en un gabinete de bioseguridad.
  2. Coloque un contenedor de residuos que contenga lejía al 10% en agua del grifo. Coloque dos cajas de plástico o cartón para congelador que puedan contener hasta 100 tubos de muestra en un congelador a -80 °C para preenfriar.
  3. Preetiquete 160 tubos de 1,5 ml para alícuotas de virus. Los tubos con tapa de rosca son preferibles a los tubos con tapa abatible para evitar la creación de aerosoles al abrir tubos de stock viral para su uso. Coloque los tubos en hielo para que se enfríen previamente antes de hacer alícuotas de virus.
  4. Haga alícuotas de 3 μL de virus con una pipeta y puntas P20 calibradas, colocando solo el virus en tubos preenfriados y manteniendo las alícuotas en hielo en todo momento.
  5. Después de hacer las alícuotas, guárdelas en una caja de congelador preenfriada con la etiqueta "A/PR/8/34 Virus de la influenza (IAV)", el número de catálogo, el número de lote y la fecha de vencimiento.
    NOTA: Diferentes lotes de virus tienen diferente infectividad y no deben mezclarse.
  6. Coloque la caja en un congelador a -80 °C. Asegúrese de mantener todo lo más frío posible, ya que el título viral disminuirá con cada ciclo de congelación / descongelación.

2. Dilución de alícuotas de virus para su uso en experimentos de infección intranasal

  1. Descongele una alícuota de 3 μL de caldo viral en hielo en el gabinete de bioseguridad.
  2. Haga una dilución 1:100 (dilución A) transfiriendo 2 μL de la alícuota de 3 μL a un tubo preenfriado de 1,5 mL que contenga 198 μL de D-PBS frío.
  3. Continúe diluyendo el stock viral hasta que alcance la concentración adecuada de 0,5-1 LD50 en el fondo de la cepa de los ratones utilizados. Mantenga todo en hielo y use tubos preenfriados para evitar el sobrecalentamiento del virus.
    NOTA: Por ejemplo, para VR-95PQ, lote 70063082, infecte ratones con 12,600 a 31,500 virus CEID50 / μL (escalado por peso corporal) a una dilución de 1: 500,000.
  4. A partir de la dilución A (1:100), haga una dilución 1:50.000 (dilución B) agregando 10 μL de dilución A a 4990 μL de D-PBS frío en un tubo preenfriado de 15 mL. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 5 ml.
  5. A partir de la dilución B, haga una dilución 1:500.000 (dilución C) añadiendo 200 μL de dilución B a 1,8 mL de D-PBS en un tubo de 5 mL preenfriado. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Para determinar la dilución ideal del virus que se utilizará en la infección de los animales al comprar un nuevo lote, es posible estimar utilizando el título del virus indicado en la ficha del producto y ajustando la dilución en función del título del lote anterior. La mejor manera de determinar la dilución ideal es valorar empíricamente el nuevo lote de virus utilizando ratones C57BL/6 de tipo salvaje. Planifique un rango de diluciones que abarquen desde 1:50,000 a 1:500,000 y ordene 1-2 jaulas de ratones hembra C57BL / 6 por dilución para probar. Infectar ratones en diferentes concentraciones y controlar su pérdida de peso. Para probar los títulos virales, el estudio propone usar solo ratones hembra para reducir la variabilidad que puede ser causada por las diferencias de sexo o peso entre ratones. Los ratones hembra a menudo se enferman más que los ratones machos, posiblemente debido a su tamaño más pequeño o debido a diferencias específicas de sexo en respuesta a la infección por influenza, como ocurre en otras formas de lesión pulmonar en ratones15. Aunque esto no se estudió en detalle, se utilizaron ratones hembra en los experimentos de título porque si el título se determinaba con ratones machos, los ratones hembra podrían morir a la dosis determinada. Sin embargo, se encontró que los ratones machos se enferman apreciablemente y tienen lesiones pulmonares notables cuando se infectan con un título viral, que se determinó usando solo ratones hembras. Una dilución ideal si se usan ratones de fondo mixto o exogámicos será "1 LD50", la dilución a la que muere el 50% de los ratones C57BL / 6 de tipo salvaje. Los ratones consanguíneos son más resistentes a la infección16 y se lesionarán y se recuperarán bien con esta dilución. Si los ratones para el experimento estarán en un fondo endogámico C57BL / 6, la dosis ideal será la mitad de este "0.5 LD50". Debido a que el objetivo de estos experimentos es estudiar lesiones y reparaciones, es ideal definir una dosis en la que los ratones se enferman y pierden entre el 20 y el 25% de su peso corporal, pero la mayoría de los ratones finalmente se recuperan (Figura 1). Si todos los ratones en el estudio tienen aproximadamente el mismo peso (~ 25 g), es posible administrar el virus de la influenza a 50 μL de la dilución adecuada a cada ratón. Sin embargo, el peso de los ratones oscila entre 15 y 35 g. Por lo tanto, administre 2 μL de dilución viral por gramo de peso corporal (por ejemplo, un ratón de 15 g recibiría 30 μL de gripe, mientras que un ratón de 35 g recibiría 70 μL). Esto da como resultado un nivel más consistente de infección y daño tisular en animales de diferentes tamaños. Esta información es necesaria para planificar el volumen de dilución C.

3. Transporte de alícuotas virales a instalaciones para animales

  1. Coloque el tubo de 5 ml con la dilución viral final en el hielo y etiquete el recipiente con una etiqueta de riesgo biológico. Cubra una caja de plástico para muestras con toallas de papel para absorber posibles derrames.
  2. Coloque los materiales necesarios para la infección intranasal dentro de la caja etiquetada como riesgo biológico: una pipeta P200, una caja sin abrir de puntas de pipeta P200 filtradas, un bolígrafo y un tubo cónico de 50 ml lleno de lejía fresca al 10% para desechos virales. Como control de infecciones, llene un tubo de 1,5 ml con el mismo D-PBS frío que se usa para diluir el IAV.

4. Administración de IAV a ratones

NOTA: Trabajar con el virus de la influenza en la instalación de animales requiere una instalación de nivel de seguridad ABSL2. El EPP estándar incluye uniformes médicos, una bata de laboratorio desechable, dos gorros para el cabello, guantes dobles de nitrilo, cubiertas dobles para zapatos, gafas protectoras (gafas de seguridad) y una máscara. El virus de la influenza diluido debe mantenerse en hielo durante todo el protocolo de administración para evitar la pérdida de infectividad.

  1. Todo el trabajo con virus debe realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad. Aunque el virus de la influenza A/PR/8/34 es una cepa adaptada al ratón, los virus de la influenza son propensos a mutar y, por lo tanto, tratan el virus como si fuera potencialmente infeccioso para los humanos.
  2. Administre anestesia con isoflurano a los animales uno a la vez a un caudal de 2.5-3% en la máquina vaporizadora. Mueva a los animales de una caja de anestesia a un cono nasal antes de administrarles la influenza.
  3. Cuando un ratón está bajo anestesia, revise su respiración y pellizque el dedo del pie para ver si reacciona. Los ratones están listos para la infección por IAV cuando reaccionan a un pellizco en el dedo del pie con una pequeña convulsión o "salto", pero no si están lo suficientemente despiertos como para mover la cabeza.
  4. Con una pipeta P200 ajustada a 50 μl (o 2 μl/g de peso corporal; consulte la NOTA a continuación paso 2.5), aspire el IAV diluido (o el control de PBS) del vial con hielo y coloque la pipeta sobre la caja de puntas o la toalla de papel donde la punta no entre en contacto con los guantes ni con la superficie de la cabina de bioseguridad.
  5. Levante el ratón anestesiado desaliñándolo y sosteniéndolo en posición vertical en un ángulo de 45°. Golpee el ratón lo suficientemente fuerte como para que la tráquea se alargue para una mejor inhalación, pero no tan fuerte como para obstruir la respiración. Asegúrese de que la respiración del ratón sea superficial pero constante, sin jadear.
  6. Pipetea lentamente la dilución de IAV en las fosas nasales del ratón. Esto se puede hacer con éxito utilizando cualquiera de los dos métodos descritos en los pasos 4.6.1 y 4.6.2.
    1. Deje caer la dilución viral en las fosas nasales gradualmente, alternando entre las fosas nasales para que el virus ingrese a ambos lados de la nariz.
    2. Cree una "burbuja" de virus que abarque ambas fosas nasales, mantenida pipeteando de manera constante y lenta a medida que el ratón inhala el líquido.
      NOTA: Este estudio utilizó consistentemente el método de instilación de burbujas, que fue más controlado y reproducible. Este método permite una fácil administración de la suspensión del virus a las fosas nasales bajo anestesia y facilita la respiración natural. El método gota a gota es igualmente válido, pero cualquiera que sea el método que se utilice, se debe aplicar consistencia en el método en todos los experimentos para garantizar una menor variabilidad en los resultados.
  7. Sostenga la punta de la pipeta cerca de la nariz, pero no toque la nariz. Si el ratón se está despertando, administre la mitad de la dosis y devuélvalo al cono nasal de isoflurano antes de administrar la segunda mitad de la dosis.
  8. Si el ratón está lo suficientemente despierto como para sacudir la cabeza, toser o escupir el virus, se necesita más anestesia para evitar causar virus en aerosol y asegurar una buena infección. Si el ratón no está despierto, administre la dosis completa. Si el mouse se volvió a colocar en el cono de la nariz, repita el paso 4.6 para administrar el IAV restante.
  9. Expulse la punta en un contenedor de residuos que contenga lejía fresca al 10%. Use una punta nueva para cada jaula de ratones.
  10. Después de cada administración de IAV, sostenga el ratón en posición vertical durante 1-2 minutos para mantener las vías respiratorias abiertas y asegurarse de que la gripe se haya administrado adecuadamente a los pulmones. Si el virus de la gripe se ha administrado con éxito a los pulmones del ratón, se pueden sentir crepitaciones colocando un dedo sobre cada lado del pecho del ratón.
  11. Después de que el ratón haya comenzado a recuperarse, vuelva a colocarlo en la jaula para que se recupere por completo. Los ratones se recuperarán rápidamente del isoflurano, pero deben ser monitoreados hasta que sean ambulatorios.
  12. Registre eventos como crepitaciones en el pecho y respiración profunda que indiquen que el IAV se ha inhalado bien, o burbujas y pulverización nasal que indiquen que parte de él ha sido expulsado de las fosas nasales del ratón. Lleve un registro de esta información en una hoja de cálculo de registro de lesiones (Archivo complementario 1) y un cuaderno de laboratorio.
  13. Repita los pasos 4.2-4.12 para cada ratón que se infecte.

5. Transporte de regreso al laboratorio

  1. Vuelva a colocar 50 ml de lejía cónica que contenga lejía y puntas en la caja de plástico del portamuestras, junto con la dilución sobrante de IAV (si corresponde) y los artículos de laboratorio utilizados para la infección por influenza.
  2. Una vez de vuelta en el laboratorio, incube todo lo que haya entrado en contacto con el virus con lejía al 10%. Rocíe cubos de hielo, pipetas y cajas de puntas con una solución de lejía al 10% en lugar de sumergirlos. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Deseche los desechos sólidos en el contenedor de desechos de riesgo biológico y deseche los desechos líquidos por el fregadero, enjuagando con agua.

6. Seguimiento de ratones y procedimientos experimentales adicionales

  1. Controle la puntuación de la condición corporal (BCS)17 y el peso corporal de todos los ratones de control (PBS) e infectados por IAV diariamente después de la infección por influenza, comenzando el día después de la infección (día 1) o 3 días después de la infección (día 4). Es poco probable que los ratones infectados con IAV pierdan peso sustancial hasta el día 4 después de la infección (Figura 1).
    NOTA: Los ratones que pierden más del 30% de su peso corporal o alcanzan una puntuación de condición corporal de 1 deben ser sacrificados.
  2. Si lo desea, administre EdU a ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) o en el agua potable para controlar la proliferación celular después de la infección por influenza.
    NOTA: Muchos tipos de células en el pulmón del ratón proliferan después del daño inducido por IAV9. Es posible administrar otros medicamentos, alimentos especiales o agua especial según se desee para fines experimentales específicos. Tenga en cuenta que los ratones no comen ni beben tanto como de costumbre durante su recuperación de la influenza, por lo que un método de administración basado en inyecciones puede ser más deseable; por otro lado, puede ser difícil inyectar a los ratones un BCS de 2-2,5.

7. Recolección de tejido pulmonar para enfoques posteriores

  1. Recolecte tejido pulmonar para aplicaciones posteriores, incluido el análisis de inmunofluorescencia, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular en las instalaciones de ratones o en el laboratorio en un gabinete de bioseguridad.
  2. Eutanasia a los ratones uno a la vez usando CO2. No se disloque cervicalmente para evitar dislocarse la tráquea. La toracotomía bilateral suele ser un método de eutanasia secundaria aprobado.
    NOTA: Este estudio sigue las pautas de cuidado animal aprobadas por la institución y el protocolo de eutanasia CO2 y ha utilizado este método de manera consistente en estudios anteriores sobre la influenza sin introducir una variabilidad significativa en la lesión pulmonar o los resultados histopatológicos. La ketamina / xilacina también se puede usar para sacrificar ratones para evitar daños causados por la inhalación de CO2 . Sin embargo, la inhalación deCO2 es un método aceptable si la adquisición de ketamina/xilacina es demasiado costosa o si obtener una licencia de la DEA es demasiado difícil.
  3. Diseccionar la cavidad torácica y exponer la caja torácica y la tráquea.
  4. Corta el diafragma y disecciona con cuidado para no perforar los pulmones. Corta a lo largo de los lados de la caja torácica y retira la caja torácica en la parte superior. Corte las clavículas y diseccione el hueso y el tejido blando de la parte frontal de la tráquea.
  5. Diseccionar el músculo y el tejido que rodea la tráquea hasta que los anillos del cartílago sean visibles, pero no perforar la tráquea. Con fórceps curvos, empuje el esófago hacia afuera desde detrás de la tráquea y diseccione de la tráquea.
  6. Pase un trozo de sutura detrás de la tráquea y haga un nudo de sutura suelto (enrolle dos veces un extremo alrededor de una pinza con otro, agarre el extremo suelto de la sutura y tire del extremo suelto a través de los bucles).
  7. Perfunda el sistema circulatorio con D-PBS. Sujete un vaso grande (debajo de la extremidad anterior o en la parte inferior del diafragma) y perfunda D-PBS a través del ventrículo derecho (parte inferior del corazón, hacia arriba) empujando lentamente el extremo de la jeringa. Si la aguja no es visible a través de la pared del corazón, es probable que esté en el ventrículo izquierdo. Esto elimina la sangre de los pulmones.
    NOTA: No empuje burbujas. Si hay burbujas en la línea, expúlselas antes de empujar D-PBS con la jeringa. Si la muerte de las células endoteliales es una preocupación, es más suave usar la perfusión por gravedad en lugar de empujar PBS a mano.
  8. Si recolecta tejido solo para histología o inmunofluorescencia, continúe con el paso 7.9; si se recolecta solo para suspensión unicelular, corte todos los lóbulos pulmonares y colóquelos en PBS en hielo, luego continúe con el paso 7.11.
  9. Inflado pulmonar para inmunofluorescencia o histología aguas abajo:
    1. Inflar los pulmones en paraformaldehído (PFA) al 2% y deshidratar a través de etanol para la inclusión de parafina o inflar en PFA al 2% y deshidratar a través de sacarosa para criosección.
    2. Para las técnicas de detección de ARN como RNAscope o la reacción en cadena de hibridación (HCR), fije los pulmones en PFA al 4%. Para una mejor fijación, infle los pulmones en agarosa de fusión ultrabaja al 2% e inmediatamente seccione un micrótomo vibratorio en PFA al 2% o 4% en una placa de cultivo de tejidos para inmunofluorescencia aguas abajo.
  10. Inflado pulmonar a mano:
    1. Infle los pulmones a mano con una jeringa y una aguja de 21-23 G con o sin tubo o usando la gravedad colocando un tubo de PFA en un soporte de anillo a 30 cm por encima de la superficie del banco.
    2. Después de aislar la tráquea, inserte la aguja en la parte superior de la tráquea, bisele hacia arriba, sin perforar la parte inferior de la tráquea, y apriete la sutura alrededor de la tráquea y la aguja antes de insertar el líquido.
      NOTA: El uso de una aguja afilada conlleva un ligero riesgo de punción traqueal en comparación con una aguja de punta roma, y los investigadores deben tener mucho cuidado durante el procedimiento para evitar cualquier daño. Si una aguja afilada perfora la tráquea, se debe usar una aguja de punta roma.
  11. Para crear una suspensión unicelular para citometría de flujo posterior o análisis de secuenciación unicelular, extraiga el tejido pulmonar del D-PBS y pique el tejido pulmonar con unas tijeras, luego corte con una cuchilla de afeitar durante 2-3 minutos para lograr piezas de tejido aún más finas.
  12. Disociar en tampón de digestión que contiene 480 U/mL de colagenasa I, 100 μL/mL de dispasa y 2 μL/mL de ADNasa en D-PBS, a 37 °C durante 30-35 min. Filtre a través de filtros de 100 μm y 40 μm, lisar los glóbulos rojos restantes utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) y volver a suspender en BSA al 1% en PBS para su procesamiento y análisis posteriores.
    NOTA: Para detectar la infección viral y la eliminación después de la infección en los pulmones, es posible evaluar la carga viral mediante el ensayo qRT-PCR o TCID50 en homogeneizados pulmonares para medir la replicación viral. La neuraminidasa y la tinción de la cápside también se pueden usar para detectar infecciones virales. La eliminación viral debe ocurrir entre los días 8 y 9 después de la infección18,19, mientras que la reparación y regeneración del tejido pulmonar continúa durante varias semanas9.

Resultados

En comparación con los ratones no infectados tratados con PBS, los ratones infectados con IAV demostrarán daño tisular heterogéneo (Figura 1A). El daño tisular se puede cuantificar utilizando un algoritmo de agrupación de k-medias en MATLAB20 (Figura 1B). Los ratones infectados con IAV comenzarán a perder peso entre 3 y 4 días después de la infección. Con un título ideal, los ratones perderán entre el 20 y el 30% de su peso corporal inicial, y la pérdida de peso máxima se producirá entre 8 y 10 días después de la infección (dpi) (Figura 1C). A los 11-12 ppp, los ratones deberían haber comenzado a aumentar de peso y deberían volver a estar dentro del 10-15% de su peso corporal inicial a los 14 ppp. Para estudios de regeneración, es útil si la mayoría de los ratones en el experimento pierden peso y experimentan daño tisular pero no mueren. Sin embargo, debido a la heterogeneidad en el daño tisular (Figura 1A, B) y la posible variabilidad en la administración intranasal, es normal que varios ratones en un experimento no pierdan peso o experimenten daño tisular y que varios ratones pierdan >30% de peso corporal, lo que resulta en eutanasia (Figura 1D). Los experimentos que se esfuerzan por determinar una diferencia en la supervivencia y la pérdida de peso entre, por ejemplo, ratones con KO de un gen en particular y sus controles WT pueden necesitar ajustar el título y la dosis de IAV y deberán realizar un cálculo de potencia para determinar el tamaño de la muestra necesario para detectar tal diferencia en estos dos parámetros.

Además de los cambios en la estructura general del tejido y la salud del ratón, se producen cambios transcripcionales en todos los compartimentos celulares pulmonares en el transcurso de la respuesta del tejido al daño. Esto incluye tanto los estados celulares transitorios que finalmente se resuelven a medida que se repara el tejido, incluidos los estados celulares epiteliales transitorios o intermedios y los estados de células inmunitarias mieloides, como los estados celulares persistentes que no contribuyen a la reparación funcional, incluidas las células epiteliales Krt5+ y las células endoteliales TrkB+9. Por ejemplo, en el endotelio capilar del pulmón del ratón, surge un estado celular endotelial transitorio estimulado por interferón a 6 dpi, caracterizado por una alta expresión de genes estimulados por interferón (Figura 2A). Este estado se resuelve en 11-19 ppp (Figura 2A). A los 11 ppp surge un estado endotelial capilar inducido por lesión (iCAP), caracterizado por una alta expresión de Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 y Bnip3 (Figura 2B). A diferencia del estado de las células endoteliales estimuladas por interferón, el estado de las células endoteliales iCAP persiste en regiones de tejido gravemente dañado y todavía está presente un año después de la infección (Figura 2C). Los estados celulares epiteliales alveolares transitorios, incluidas las células transicionales alveolares y los estados de células epiteliales alveolares inmaduras tipo I (AT1), también surgen después de la infección (Figura 2D). Finalmente, la infección da como resultado la pérdida de muchos macrófagos alveolares endógenos (aMAC_a) y su reconstitución tanto de monocitos inflamatorios (iMON) como de aMAC endógenos. Los macrófagos alveolares a 1 año de la infección tienen diferentes estados transcripcionales (aMAC_a y aMAC_b) dependiendo de su origen (Figura 2E)9. Los estados celulares transitorios y persistentes que surgen después de una lesión pulmonar aguda justifican un estudio adicional, ya que su comportamiento anormal dentro del nicho puede contribuir de manera productiva o negativa a la reparación exitosa del tejido y la función tisular posterior. Los datos de secuenciación de ARN unicelular se han publicado previamente9 y se depositan en el Gene Expression Omnibus como GEO: GSE262927.

figure-results-1
Figura 1: Monitoreo de lesiones pulmonares y salud animal. (A) Tinción de hematoxilina y eosina (HE) de secciones de tejido pulmonar de un pulmón infectado (tratado con PBS) a la izquierda y un pulmón infectado con IAV a la derecha. En comparación con el pulmón no lesionado, el pulmón infectado por IAV muestra daño tisular heterogéneo. Barras de escala, 1 mm. (B) Utilizando un algoritmo de agrupación en clústeres de k-medias en MATLAB20, el daño tisular se puede caracterizar como grave (rojo), dañado (verde) o normal (azul). Es importante tener en cuenta que en el lóbulo pulmonar tratado con PBS a la izquierda, las estructuras de las vías respiratorias se clasifican como "graves" debido a la densidad y la intensidad de tinción de las células epiteliales de las vías respiratorias. Sin embargo, todavía es posible discernir fácilmente la diferencia entre los pulmones tratados con PBS e infectados por la influenza dada esta línea de base. Barras de escala, 1 mm. (C) Ejemplo de curva de pérdida de peso de un experimento representativo de infección por IAV en el que se recolectaron pulmones de ratón a los 13 días después de la infección (dpi). La curva contiene datos de seis ratones de tipo salvaje, y los puntos representan la media, mientras que las barras de error representan el error estándar de la media. (D) Ejemplo de curva de supervivencia de un experimento representativo de infección por IAV en el que se recolectaron pulmones de ratón a los 14 días después de la infección (dpi). La curva contiene datos de siete ratones de tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Monitorización de los cambios en el estado de las células endoteliales capilares después de la infección por IAV. (A) Surge un estado de EC estimulado por interferón a 6 dpi que se resuelve entre 11-19 dpi. El nuevo análisis de los datos publicados de secuenciación de ARN unicelular de pulmones de ratón en varios momentos diferentes después de la infección por influenza muestra que la puntuación del módulo de interferón en todos los tipos de células endoteliales capilares es más alta a 6 dpi. Los datos se volvieron a analizar utilizando R, y la puntuación del módulo de interferón se basa en la expresión de 87 genes estimulados por interferón dentro de cada tipo de célula. CAP1, célula endotelial capilar tipo 1; iCAP, célula endotelial inducida por lesiones; CAP2, célula endotelial capilar tipo 2; EC, célula endotelial. (B) Por el contrario, un estado de CE inducido por lesiones caracterizado por la expresión de Ntrk2 (TRKB) surge a los 11 ppp y persiste hasta un año después de la infección. Barra de escala, 500 μm. (C) Los datos transcripcionales de la secuenciación de ARN unicelular de células endoteliales capilares pulmonares después de la infección por influenza demuestran la naturaleza dinámica del estado de las células endoteliales capilares durante la reparación de tejidos. (D) Las células epiteliales alveolares también experimentan plasticidad celular después de la infección por influenza. Un tipo de célula de transición alveolar surge entre 6-11 dpi y se resuelve en 19 dpi. Un estado de célula AT1 inmadura (AT1_c) surge a 11 ppp y persiste hasta 90 ppp. (E) Después de la infección, se pierden muchos macrófagos alveolares existentes (aMAC_a) y se observa una afluencia de monocitos inflamatorios (iMON) a 6 dpi. La población de macrófagos alveolares se reconstituye tanto por los aMAC existentes para regenerar la población aMAC_a como por los monocitos inflamatorios, que generan la población aMAC_b. Aunque ambos representan un estado de macrófagos alveolares, los aMAC resultantes se pueden distinguir transcripcionalmente. Los gráficos en (C-E) indican el porcentaje de células en cada población en cada punto de tiempo en el conjunto de datos longitudinal de infección por influenza y se generaron usando R. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Registro de lesiones de muestra, registro de peso y registro de puntuación de condición corporal (BCS) para monitorear animales después de la infección por influenza. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí, hemos informado de un método conveniente para transferir el virus de la influenza a ratones para iniciar un daño rápido y efectivo a los pulmones de ratón y estudiar los mecanismos de regeneración exitosa y reparación displásica. Demostramos que la inoculación intranasal de A/PR/8/34 IAV puede ser una técnica libre de estrés. Se necesitan menos de 2 minutos por ratón para completar la inoculación después de la anestesia con isoflurano. Es una técnica sencilla y no invasiva de inoculación viral que sigue la vía natural de la infección y permite estudiar la respuesta tanto del tejido como del sistema inmune de una manera más fisiológicamente relevante. El virus inoculado a través de las fosas nasales del ratón puede inducir inmunidad tanto mucosa como sistémica21. Más importante aún, el daño causado por la infección viral es claramente visible en cortes de tejido pulmonar teñidos con tinción de hematoxilina y eosina (HE)22 (Figura 1). Se ha publicado previamente una línea de tiempo completa de los cambios transcripcionales esperados en los tipos de células pulmonares en cada compartimento del pulmón9. Aquí, hemos vuelto a analizar un subconjunto de estos datos para demostrar que en los compartimentos inmunitarios endotelial, epitelial alveolar y mieloide capilar de los pulmones de ratón, se producen cambios transcripcionales transitorios y persistentes en el transcurso de la respuesta a la infección por influenza de ratones no infectados hasta un año después de la infección (Figura 2).

Hay varios pasos críticos en este protocolo, y la solución adecuada de estos pasos producirá un experimento exitoso. El virus de la influenza A/PR/8/34 es una cepa de influenza adaptada al ratón que no infecta productivamente a los humanos23, pero siempre es importante seguir todos los procedimientos de seguridad indicados durante el experimento para evitar cualquier posibilidad de infección del personal de laboratorio. La administración de anestesia con isoflurano es un paso crítico para garantizar la administración exitosa del virus, ya que los ratones no inhalarán bien el virus cuando estén despiertos. Verifique la respiración y controle el movimiento de la cabeza del ratón durante el procedimiento para asegurarse de que el virus esté inoculado en ambas fosas nasales. Si los ratones no están completamente anestesiados, se pueden generar burbujas, que limitan la inhalación del virus y generan aerosoles. Ambos resultados deben evitarse, y los ratones deben volver a colocarse en el cono nasal de isoflurano si se observan estornudos o burbujas en las fosas nasales. El monitoreo posterior a la infección, como medir la pérdida de peso, la puntuación de la condición corporal y el estado de salud, así como proporcionar un suplemento alimenticio de recuperación, también es un componente importante de este experimento. Si se observa que los ratones no pierden el peso adecuado o no tienen la cantidad esperada de daño tisular (Figura 1), es posible que la dosis sea demasiado baja; Por otro lado, si muchos ratones alcanzan el punto final de pérdida de peso corporal del 30%, es posible que la dosis sea demasiado alta. En cualquier caso, es mejor determinar la dosis adecuada a través de un título empírico de la cantidad de virus utilizando una cohorte de ratones C57BL / 6 como describimos aquí.

Dado que la infección por influenza sigue prevaleciendo en todo el mundo, causa enfermedades respiratorias graves y puede ser fatal, es de suma importancia comprender el proceso de infectividad viral y la respuesta celular a la infección y la lesión tisular en el pulmón. Por lo tanto, el método de infección intranasal descrito en este estudio puede ayudar en la identificación de importantes mecanismos reguladores y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades pulmonares. Además, las aplicaciones futuras de la técnica podrían utilizar una cepa diferente del virus de la influenza adaptado al ratón, como X31, para determinar los efectos sobre la estructura y función del tejido pulmonar en el caso de infecciones respiratorias repetitivas. Dado que muchas personas están sujetas a múltiples infecciones respiratorias a lo largo de su vida, tal extensión de este modelo podría tener implicaciones importantes para el estudio de la regeneración del tejido pulmonar y, por lo tanto, para la salud pública.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU., Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,5 mL de tubo y nbsp;Fisher Scientific02-682-557
100 & micro; Colador de células MHalcón352360
Tubo cónico de 15 mLHalcón352196
1x PBSGibc010010-023
40 y micro; Colador de células MHalcón352340
Tubo de 5 mLGlobo6101C
Tubo cónico de 50 mLHalcón352098
Material del virus de la gripe A/PR/8/34ATCC VR-95PQCada lote tiene distintos títulos virales
Búfer de lisis ACKCalidad Biológico118-156-101
Anticuerpo anti-TRKBR& Sistemas DAF1494
LejíaCloroxLejía al 10%
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA8022
Cámara de inducción de anestesia por CO2CualquieraN/A
Colagenasa Tipo IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispasaCorningCB-40235
Herramientas de disección: tijeras, pinzas curvas, pinzas rectasCualquieraN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EtanolPharmco111000200
Frascos de vidrioDWK Ciencias de la Vida986562
Cubo de hieloCualquieraN/A
IsofluranoCovetrus29404
Agujas, 21 y guion; 23 GCualquieraN/A
pipeta P20/P200 & nbsp;PipetmanF144056M/F144058M,
Puntas de pipeta P20/P200Thomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldehído (PFA) y nbsp;Termo CientíficaJ19943-k22%PFA
PipetmanCualquieraN/A
Cajas de congelador de plástico o cartónCualquieraN/A
Cuchilla de afeitarCualquieraN/A
Ring StandCualquieraN/A
Pipetas serológicas, 5 mLHalcón357543
Cámara de isoflurano para ratones de inducción con tapa deslizanteSomni Scientific
SuturaFisher ScientificNC9422522
Tubos de jeringuilla y luer-locksCualquieraN/A
Jeringuilla, 10 mLCualquieraN/A
Máquina de anestesia de mesa IsofluranoOhmedaOhmeda Isotec- 4El caudal debería ser 2,5 y guiño; 3%
Agarosa de fusión ultrabajaSigma AldrichA5030-1G
BalanzaOHAUSCS200

Referencias

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Infecci n intranasalc lulas epiteliales alveolaresestados de las c lulas endotelialessecuenciaci n de c lula nicacitometr a de flujodigesti n de tejido pulmonartinci n por inmunofluorescenciamacr fagos alveolares
Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.