Este informe describe la construcción y el uso de una almohadilla térmica portátil, fácil de ensamblar y de bajo costo para usar en pequeños mamíferos anestesiados.
Artículo de investigación
Este informe describe la construcción y el uso de una almohadilla térmica portátil, fácil de ensamblar y de bajo costo para usar en pequeños mamíferos anestesiados.
La anestesia disminuye la temperatura corporal central y esto compromete seriamente el estado fisiológico de un animal de experimentación. Es importante destacar que la hipotermia altera muchos aspectos de la función neuronal. Al registrar la actividad del sistema nervioso en animales anestesiados, se debe estabilizar la temperatura central del animal. Aunque las almohadillas térmicas comerciales para animales pequeños están fácilmente disponibles, generalmente son caras, algo voluminosas y requieren cables de alimentación y una fuente de 120/240 V. En consecuencia, transportar un animal anestesiado de un lugar (por ejemplo, quirófano) a otro (por ejemplo, una plataforma de imágenes) implica mover cables de alimentación. Además, los dispositivos comerciales no siempre son compatibles con marcos estereotáxicos personalizados, platinas de microscopio o cajas de retención. Este informe describe una almohadilla térmica de bajo costo, alimentada por batería y con temperatura controlada para ratones y ratas y documenta su validez y utilidad. El dispositivo monitorea la temperatura central de un animal de forma continua y ajusta automáticamente la almohadilla térmica para mantener la normotermia. Se puede construir en menos de 30 minutos, los componentes están disponibles y el costo es inferior a $ 100. El dispositivo es portátil, lo que lo hace conveniente para los investigadores que realizan procedimientos como preparaciones quirúrgicas en un lugar y transportan al animal anestesiado a otro lugar para grabaciones experimentales. El dispositivo puede mantener un ratón anestesiado normotérmico ±0,7 ° durante más de 6 h sin calor suplementario (por ejemplo, lámpara de calor), a pesar de la diferencia de > 15 ° entre la temperatura ambiente y la temperatura corporal central. Este informe demuestra cómo se puede utilizar la almohadilla de calentamiento para obtener imágenes in vivo de la actividad neuronal durante un período prolongado en ratones.
Los métodos actuales para investigar la actividad neuronal in vivo en los cerebros de ratones y ratas utilizan sofisticadas técnicas de imagen funcional y / o matrices de electrodos múltiples 1,2,3,4. En muchos de estos estudios, el animal de experimentación está profundamente sedado o en un plano quirúrgico de anestesia. Sin embargo, es bien sabido que la anestesia incapacita la termorregulación en los animales; La temperatura central de un animal anestesiado desciende rápidamente. Por ejemplo, en ratas y ratones, la inyección intraperitoneal de un anestésico de uso común, la ketamina, conduce rápidamente a la hipotermia 5,6,7. De hecho, la hipotermia complica la anestesia general tanto en humanos como en roedores 8,9,10,11. En consecuencia, se requiere un dispositivo para mantener la temperatura corporal central de un animal para una amplia gama de experimentos en animales anestesiados 12,13,14,15,16,17,18.
La hipotermia es un problema particular en neurociencia. La baja temperatura afecta el cerebro y la función neuronal de varias maneras. La hipotermia leve durante la anestesia fortalece la barrera hematoencefálica contra agresiones experimentales como la perfusión con soluciones hiperosmolares19; La hipotermia más severa altera la barrera hematoencefálica20. La hipotermia reduce la velocidad de conducción nerviosa en los nervios central21 y periférico22 y altera muchos aspectos de la transmisión sináptica23,24 (cf. en animales de sangre fría25). Claramente, mantener la temperatura corporal central de un animal de experimentación es fundamental cuando se estudia la actividad neuronal, enfatizando la importancia de algún tipo de dispositivo de calentamiento, especialmente para los animales anestesiados.
Hay varias almohadillas térmicas disponibles comercialmente para animales pequeños, muchas de las cuales incluyen controladores con retroalimentación de sonda de temperatura para mantener al animal a una temperatura central constante 26,27,28,29,30,31,32. Estos dispositivos comerciales son confiables y estables, pero a menudo voluminosos y costosos. Se han descrito otras unidades de calefacción homeotérmica más especializadas para roedores, pero tienen una aplicabilidad limitada para uso general 33,34,35,36,37. Además, los dispositivos de calefacción homeotérmicos comúnmente disponibles tienen fuentes de alimentación que deben enchufarse a una toma de corriente de 120 V o 240 V. Estos factores pueden ser limitantes. El requisito de una alimentación de 120/240 V puede ser especialmente molesto si un animal está preparado quirúrgicamente para la experimentación en un lugar diferente de donde se lleva a cabo la grabación real. El transporte de la preparación, incluso una distancia corta, requiere mover un controlador/fuente de alimentación y un cable de alimentación. Además, las fuentes de alimentación/controladores para almohadillas térmicas pueden introducir ruido en los registros electrofisiológicos.
En estudios que utilizan imágenes funcionales in vivo de la actividad de las neuronas sensoriales en ratones, estas agravaciones se han superado mediante el diseño de una almohadilla térmica homeotérmica extremadamente económica, fácil de construir y sumamente portátil. Esta almohadilla térmica funciona con una pequeña batería de polímero de litio (LiPo), como las que se utilizan para alimentar drones. Este dispositivo requiere habilidades mínimas para construirlo. Todas las piezas son artículos listos para usar, disponibles por pedido en línea. Las únicas herramientas necesarias son un destornillador pequeño, un soldador y un cortador / pelacables. El costo total está muy por debajo de los $ 100 y toda la construcción toma menos de 30 minutos. El pequeño tamaño y la disposición flexible de sus componentes hacen que la almohadilla térmica homeotérmica se adapte fácilmente a un marco estereotáxico personalizado, plataformas de grabación, jaulas de observación o, como en este informe, la etapa de un microscopio confocal vertical.
Aunque esta almohadilla térmica homeotérmica se ha utilizado ampliamente para obtener imágenes de calcio in vivo de la actividad neuronal en ganglios sensoriales craneales expuestos quirúrgicamente38,39, cualquier estudio que utilice pequeños roedores sedados o anestesiados se beneficiaría de este dispositivo. La experiencia ha demostrado que, cuando se alimenta con baterías LiPo completamente cargadas, la almohadilla térmica mantiene estable la temperatura corporal central de un ratón anestesiado durante más de 6 h.
Todos los elementos necesarios para construir la almohadilla térmica están disponibles comercialmente. El uso de ratones y todos los procedimientos con animales descritos para validar este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami, IPROTO202200000139. Los animales utilizados para probar y validar este dispositivo fueron ratones C57BL/6, 18-30 g de ambos sexos. Los ratones específicamente para imágenes de calcio fueron ratones transgénicos que expresan GCaMP6 en neuronas sensoriales. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Herramientas para el montaje
Las herramientas que se requerían consistían en un pequeño destornillador plano (por ejemplo, cabeza de 2 mm), un soldador y un cortador/pelador de alambre.
2. Montaje de la almohadilla térmica
Se dispusieron los elementos necesarios para la construcción (Figura 1). Estos incluían (A) una almohadilla térmica de silicona de 12V 15W 50 mm x 100 mm (50 mm x 100 mm era un tamaño conveniente para ratones, mientras que las almohadillas térmicas de goma de silicona más grandes son más apropiadas para ratas); (B) termistor de perlas; (C) JST-XH conector macho de enchufe de enchufe de equilibrio de 2 pines; (D) Conector de enchufe JST macho de 2 pines con cables de 20 AWG; (E) Batería LiPo de 7,4 V y 1200 mAh; (F) circuito controlador de temperatura; y (G) una longitud corta de cable de conexión de 20 AWG.

Figura 1: Diseño de piezas para la construcción de almohadillas térmicas homeotérmicas. Estos incluían (A) una almohadilla térmica de silicona de 12V 15W 50 mm x 100 mm (50 mm x 100 mm era un tamaño conveniente para ratones, mientras que las almohadillas térmicas de goma de silicona más grandes son más apropiadas para ratas); (B) termistor de perlas; (C) JST-XH conector macho de enchufe de 2 pines de equilibrio; (D) Conector de enchufe JST macho de 2 pines con cables de 20 AWG; (E) Batería LiPo de 7,4 V y 1200 mAh; (F) circuito controlador de temperatura; y (G) una longitud corta de cable de conexión de 20 AWG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los dos cables de la almohadilla térmica de silicona se insertaron en los terminales # 2 y # 4 del circuito de control de temperatura, y los tornillos de los terminales se apretaron como se muestra en la Figura 2. Los cables se estañaron antes de conectarlos al terminal de la placa de control.

Figura 2: La almohadilla térmica de silicona está conectada al circuito de control de temperatura. La sonda de termistor que viene con el circuito de control de temperatura se muestra aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los cables del enchufe JST macho de 2 pines se conectaron al circuito de control de temperatura como se muestra en la Figura 3. El cable rojo (positivo) se conectó al terminal # 1 y el cable negro (negativo) al terminal # 2. Se agregó un puente de cable de conexión corto de 20 Ga entre los terminales # 1 y # 3 (Figura 3). Se rescató un trozo corto de cable de conexión de los cables de las almohadillas térmicas. Como se indicó anteriormente, los cables se estañaron antes de sujetarlos en el terminal del tablero de control.

Figura 3: Los cables del enchufe JST están conectados a los terminales 1 y 2 del circuito de control de temperatura. El cable rojo (positivo) debe conectarse al terminal 1 y el cable negro (negativo) al terminal 2. Los terminales 1 y 3 están conectados con un cable de conexión corto. Para mayor claridad, no se muestran las conexiones de almohadillas térmicas de silicona (Figura 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Configuración del termistor y la sonda
Los cables del enchufe JST-XH se soldaron al termistor de perlas. Es importante destacar que los cables del termistor y las juntas de soldadura se aislaron cuidadosamente con tubos retráctiles para evitar cortocircuitos en el termistor. La sonda de termistor enviada con el controlador de temperatura se desenchufó, se retiró y se reemplazó con la sonda de termistor de perlas, como se muestra en la Figura 4. El termistor de perlas servía como sonda térmica rectal para controlar la temperatura central del ratón o la rata.

Figura 4: Preparación de la sonda térmica rectal. (A) El enchufe JST-HX está soldado al termistor de perlas. (B) Se retira la sonda de termistor que viene con el controlador de temperatura. (C) El cable del termistor de perlas está conectado al controlador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Integración final y montaje
La construcción se completó ( Figura 5). El dispositivo estaba listo para usar y podía montarse en una plataforma adecuada para la experimentación. La batería LiPo se conectó al enchufe JST para proporcionar energía al controlador. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de la unidad completamente operativa. En algunos casos, el circuito del controlador de temperatura se montó en espaciadores altos (por ejemplo, tornillos de nailon # 6 de 1 ") unidos en sus cuatro esquinas. De esta manera, la batería LiPo de 7,4 V encaja de manera ordenada y conveniente debajo del circuito del controlador de temperatura.

Figura 5: Un dispositivo de almohadilla térmica homeotérmica completamente terminado, que funciona en una habitación con una temperatura ambiente de 22 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Operación y uso del dispositivo
Para operar la almohadilla térmica homeotérmica, se colocó una pequeña cantidad de vaselina en el termistor de perlas, que luego se insertó suavemente en el recto de un ratón anestesiado o sedado. Para este informe, se anestesiaron ratones de 18 a 30 g con ketamina / xilacina (80 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilacina) con dosis de refuerzo posteriores de ketamina para mantener un plano quirúrgico de anestesia. Los cables del termistor estaban pegados con cinta adhesiva a la cola del animal para evitar que la sonda se desprendiera. El animal fue colocado boca abajo sobre la almohadilla térmica de silicona. El dispositivo se alimentaba enchufando la batería LiPo de 7,4 V. Se presionó el botón Set en el controlador del termostato. "H" (calefacción) apareció junto a la temperatura establecida. El botón Set se presionó una vez más para activar el ajuste de temperatura. Se presionó el botón Arriba o Abajo para cambiar la temperatura establecida a la especificación deseada. Por ejemplo, se utilizó una temperatura establecida de 37 °. El botón Set se mantuvo presionado durante 3 s (o no se presionó ningún botón durante 6 s) y el dispositivo pasó a funcionar por completo. Las instrucciones para configurar la temperatura también se incluyeron en la hoja de especificaciones que viene con el circuito del controlador de temperatura.
Cuando la temperatura central del animal era inferior a la temperatura establecida (por ejemplo, 37 °), el relé que alimentaba la almohadilla térmica de silicona se cerraba. Se entregó corriente a la almohadilla térmica de silicona, se encendió la luz roja y la almohadilla de silicona comenzó a calentarse hasta que la sonda rectal excedió la temperatura establecida en una cantidad determinada ("histéresis"; la configuración de fábrica fue de 0,5 °). Cuando la sonda rectal excedió la temperatura establecida más histéresis (en este ejemplo, 37.5 °), el relé se abrió, la luz roja se apagó, se cortó la energía de la almohadilla térmica de silicona y la almohadilla térmica y el animal comenzaron a enfriarse (suponiendo que la temperatura ambiente < 37.5 °). Cuando la sonda rectal bajó a la temperatura establecida menos histéresis (por ejemplo, 36,5 °), el relé se cerró y se entregó energía nuevamente a la almohadilla térmica de silicona para calentar al animal. La histéresis se puede configurar presionando el botón Set tres veces y usando los botones Arriba o Abajo . Con el dispositivo se proporcionaron instrucciones más detalladas para operar el controlador de temperatura, incluido un control de interfaz en serie, si era de interés para los usuarios.
6. Procedimientos de seguimiento
Al final de los experimentos descritos en este informe, los ratones fueron sacrificados humanamente con una sobredosis de ketamina, CO2 y dislocación cervical. Específicamente, a los animales se les inyectó una dosis de ketamina 2x, seguida de CO2 de un cilindro presurizado administrado a 10 SCFH (pies cúbicos estándar por hora) y, finalmente, dislocación cervical.
Se han evaluado y validado dos métodos: la almohadilla térmica homeotérmica.
Primero, en una prueba analítica crítica del dispositivo, un ratón macho pequeño (18,5 g) se mantuvo bajo anestesia profunda durante 6 h en la almohadilla de calentamiento en un ambiente relativamente fresco. Específicamente, al ratón se le inyectó una mezcla de ketamina / xilacina (80 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilacina) y se mantuvo en la almohadilla térmica al aire libre, sin tapa, en una habitación con aire acondicionado (temperatura ambiente, 20,3 °). Se administraron inyecciones de refuerzo de ketamina según fuera necesario para mantener al ratón en un plano quirúrgico de anestesia. El ratón mantuvo una frecuencia respiratoria normal durante las 6 h completas, variando desde un mínimo estimado de 110 / min hasta un máximo de 215 / min, dependiendo del tiempo transcurrido después de la inyección de refuerzo de ketamina (consistente con el efecto conocido de la ketamina sobre la respiración). La temperatura central del animal se controló con la sonda de termistor de perlas del dispositivo y, de forma independiente, con una sonda rectal comercial RET-4 (Physitemp) insertada en paralelo con la sonda de termistor de perlas. Además, se mantuvo un registro de la temperatura de la superficie de la almohadilla térmica de caucho de silicona directamente debajo del ratón anestesiado. El controlador se configuró en 35 °. Los datos indican que la temperatura central del ratón varió menos de 1,3 ° durante las 6 h, a pesar de la diferencia de 15 ° entre la temperatura ambiente ambiente (20 °) y la temperatura central establecida (35 °) (Figura 6). Es importante destacar que la temperatura central del ratón se mantuvo en 35±0,6 ° sin ningún dispositivo de calentamiento suplementario (lámpara de calor, manta, etc.). La batería LiPo se cambió una vez durante el período de 6 h.

Figura 6: Validación de la almohadilla térmica homeotérmica. Un ratón anestesiado se mantuvo en una plataforma en una habitación abierta (temperatura ambiente, 20 °C) sin ninguna otra fuente de calor durante 6 h. El dispositivo se configuró para mantener la temperatura central del ratón a 35 °C. (A) La configuración experimental. (B) Temperaturas registradas por la sonda de termistor de perlas rectales del dispositivo (representadas por puntos rojos); por una sonda rectal independiente RET-4 (Physitemp) (representada por puntos morados); y por una sonda de temperatura separada colocada en la almohadilla térmica de silicona debajo del mouse (representada por círculos de cuerpo negro, puntos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En segundo lugar, la almohadilla térmica alimentada por batería se usa ampliamente para imágenes de calcio confocal de escaneo in vivo de la actividad ganglionar sensorial en ratones transgénicos que expresan GCaMP6 en neuronas sensoriales38,39. Los experimentos suelen durar 6 h o más, y el ratón permanece en un plano quirúrgico de anestesia durante la duración. La experiencia ha demostrado que mantener la temperatura central del ratón a 31,5 °C durante la preparación quirúrgica y la obtención de imágenes es óptimo. La preparación quirúrgica consiste en exponer unilateralmente los ganglios del trigémino y/o geniculado en ratones profundamente anestesiados. Esta cirugía se lleva a cabo en una sala separada de donde se realizan las imágenes, lo que requiere el transporte del ratón anestesiado fijado en un dispositivo estereotáxico hecho a medida con la almohadilla de calentamiento conectada a una distancia de aproximadamente 40 m. La temperatura ambiente varía de 20 a 24 °C. La temperatura central del ratón, medida por la sonda de temperatura rectal del dispositivo (termistor de perlas), se ha mantenido constante y el animal se ha mantenido en condiciones fisiológicas estables durante las 6+ h sin ningún calentamiento auxiliar. La actividad neuronal se ha mantenido robusta (Figura 7), validando la confiabilidad de la almohadilla de calentamiento alimentada por batería para mantener al animal normotérmico.

Figura 7: Almohadilla de calentamiento en uso durante la obtención de imágenes in vivo de la actividad neuronal. La almohadilla térmica mantiene estable la temperatura central de un ratón anestesiado y admite registros robustos y confiables de la actividad neuronal durante varias horas. (A) Vista que muestra el ratón colocado en la almohadilla térmica, su cabeza estabilizada con un soporte hecho a medida bajo el objetivo de larga distancia de 20x de un microscopio confocal. Como se muestra aquí, la temperatura central del ratón se mantiene a 31,5 °C para la obtención de imágenes. Un láser de escaneo (488 nm) ilumina el ganglio geniculado expuesto quirúrgicamente e imagina la actividad evocada por el gusto en las neuronas sensoriales gustativas que expresan el reportero sensible al calcio, GCaMP6s. La gran variedad blanca (abajo a la derecha) guía los estímulos gustativos hacia la cavidad oral. (B) Ejemplos representativos de 5 neuronas ganglionares geniculadas que muestran respuestas evocadas por el gusto (cambio en la fluorescencia de GCaMP6s, ΔF / F) después de una presentación de 5 s de solución de sacarosa de 300 mM en la cavidad oral. Estas respuestas se tomaron al comienzo del experimento. Las marcas en la línea roja indican la entrega de estímulos. (C) Ejemplos de respuestas de 5 neuronas ganglionares diferentes registradas 6 h después. El ratón se había mantenido en la almohadilla de calentamiento en un plano quirúrgico de anestesia durante todo el tiempo. Las amplitudes, duraciones y latencias de las respuestas evocadas por el sabor son notablemente similares a las registradas varias horas antes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Estas pruebas validan el controlador homeotérmico y establecen firmemente la capacidad del dispositivo de almohadilla térmica para mantener un roedor anestesiado a una temperatura central constante durante largos períodos.
DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Las tablas de datos completas para la Figura 6 y la Figura 7 se incluyen en el Archivo complementario 1.
Expediente complementario 1: Tablas de datos para la Figura 6 y la Figura 7. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Este informe describió una almohadilla térmica homeotérmica pequeña, portátil y alimentada por baterías para mantener la normotermia en ratones y ratas anestesiados. Este dispositivo ha mantenido estable la temperatura corporal central de ratones profundamente anestesiados durante varias horas sin ninguna fuente de calor suplementaria, a pesar de una gran diferencia entre la temperatura ambiente y la temperatura corporal central. Se ilustró la utilidad de esta almohadilla térmica para obtener imágenes confocales in vivo de la actividad de los ganglios craneales en ratones.
Todos los componentes del dispositivo están disponibles en línea. El costo total de todos los componentes es inferior a $100. Se utilizan herramientas comúnmente disponibles para construir la unidad. No se requieren habilidades especializadas, aparte de la soldadura rudimentaria, para construir el dispositivo. La almohadilla de calentamiento funciona con una batería LiPo de alta capacidad, comúnmente utilizada para drones. Finalmente, todo el dispositivo se puede ensamblar en menos de 30 minutos cuando las piezas se colocan como se describe. Esta pequeña almohadilla térmica homeotérmica alimentada por batería es especialmente útil para situaciones experimentales en las que los animales anestesiados se preparan en un sitio (como una sala quirúrgica) y se transportan a otro (como una plataforma de imágenes) para procedimientos experimentales. Debido a que el dispositivo funciona con baterías, no hay cables de alimentación para desconectar ni una unidad de termocontrolador separada para mover. Además, al funcionar con baterías, no genera ruido eléctrico para las grabaciones electrofisiológicas, un problema persistente con los dispositivos comerciales alimentados por 120/240 V. Finalmente, la almohadilla térmica se puede adaptar fácilmente a marcos estereotáxicos hechos a medida, cajas de retención, jaulas de animales u otras situaciones.
La principal limitación de la almohadilla térmica es que la carga de la batería LiPo puede no durar lo que dure un experimento. Por lo general, una batería de 1200 mAh completamente cargada alimenta la unidad durante 4-6 h, dependiendo de la diferencia de temperatura entre el animal y la habitación. Una solución simple es tener una batería de respaldo lista y/o usar una batería LiPo de mayor capacidad de 2200 mAh.
A pesar de su facilidad de construcción y conveniencia, existen trampas en torno a este dispositivo. Las baterías LiPo, como las que se utilizan para alimentar la almohadilla térmica, pueden ser peligrosas40,41. Aunque se utilizan comúnmente para alimentar drones y juguetes, las baterías LiPo tienen ciertos riesgos. En particular, la sobrecarga de las baterías LiPo es un grave riesgo de incendio42. Se advierte a los usuarios que no dejen la batería LiPo cargando durante la noche o más. Otra preocupación es la posibilidad de cortocircuitar accidentalmente la batería durante la construcción al conectar inadvertidamente los terminales 1 y 2 con el cable de conexión corto (Figura 3). Además, es fundamental mantener la polaridad correcta en los cables del conector de la batería, de modo que el cable rojo (positivo) esté conectado al terminal 1 y el cable negro (negativo) esté conectado al terminal 2 (Figura 3) del circuito de control de temperatura. Invertir la polaridad puede destruir el circuito eléctrico. Finalmente, se insta a los usuarios a estañar los cables antes de insertarlos en el circuito de control de temperatura. Esto ayudará a evitar que los cables se salgan accidentalmente durante el uso.
En resumen, la almohadilla térmica homeotérmica a batería descrita aquí beneficiará enormemente a los estudios que utilizan ratones o ratas anestesiados.
Este trabajo fue apoyado por los números de subvención de los Institutos Nacionales de Salud DC018733 y DC017303
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