Este protocolo detalla la separación del epitelio del cristalino ocular del ratón y la masa a granel de las células de fibra, seguida del aislamiento de ARN y el análisis de qPCR. Este método permite separar los compartimentos de las células del cristalino para un análisis más detallado del transcriptoma y los procesos biológicos en las células epiteliales frente a las células de fibra diferenciadas.
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Artículo de método
Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra
En este artículo
Resumen
Resumen
El cristalino es un tejido transparente especializado en la cámara anterior del ojo que se compone de dos tipos principales de células, células epiteliales y células de fibra. Una monocapa de células epiteliales del cristalino cubre el hemisferio anterior del cristalino, mientras que la mayor parte del cristalino está compuesto por una masa de células de fibra del cristalino. Una membrana basal de colágeno, conocida como cápsula, rodea y encapsula todo el tejido. Las células epiteliales del cristalino están fuertemente adheridas a la cápsula del cristalino y se pueden separar fácilmente de la masa de fibra a granel despegando la cápsula del tejido. Las dificultades para obtener una concentración suficiente de ARN a partir del bajo número de células epiteliales en la monocapa del cristalino han impedido previamente el estudio de los transcriptomas de células epiteliales frente a las células de fibra. Este protocolo presenta un método para separar y aislar limpiamente los compartimentos de células epiteliales y de fibra y los pasos de concentración de ARN para permitir experimentos transcriptómicos posteriores en muestras de células epiteliales de un solo par de lentes de ratón. La capacidad de investigar los principales tipos de células del cristalino individualmente ayuda a investigar los mecanismos biológicos del mantenimiento y la desregulación del cristalino, lo que permite la caracterización de alteraciones específicas del tipo de célula responsables de las patologías del cristalino relacionadas con la edad.
Introducción
El cristalino ocular es un órgano transparente que enfoca finamente la luz en la retina para producir una imagen clara. El cristalino se compone de dos tipos principales de células: una monocapa de células epiteliales que cubren el hemisferio anterior y células de fibra que forman la masa a granel del tejido (Figura 1). El cristalino está envuelto por una membrana basal de colágeno conocida como cápsula del cristalino, a la que las células epiteliales están fuertemente adheridas. A medida que el cristalino crece, las células epiteliales en el ecuador proliferan y se diferencian en capas nacientes de células de fibra que se colocan en capa....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana.
1. Área de trabajo, equipo y preparación de reactivos
- Puntas de pipeta esterilizadas en autoclave antes de su uso y designe cajas de puntas esterilizadas en autoclave para experimentos de ARN para evitar la contaminación por ARNasa.
- Trate el área de la superficie de trabajo en la campana extractora y los morteros de homog....
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Resultados
El epitelio y las fibras del cristalino se aislaron de ratones de tipo salvaje de 6 a 7 semanas de edad. Se utilizaron tres ratones para estos experimentos, y se agruparon 2 cápsulas de lentes o 2 masas de células de fibra de cada ratón para obtener una réplica biológica. Como se describe en el protocolo, el ARN se extrajo mediante la separación de fases de reactivos TRIzol. En promedio, un par de masas a granel de epitelio y fibra del cristalino produjeron 0,8 μg (DE ± 0,2) y 9,7 μg (DE ± 2,3) de ARN, respectivamente. L.......
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Discusión
Los pasos presentados aquí demuestran la capacidad de aislar ARN de compartimentos de lentes separados que se pueden transcribir con éxito en ADNc para métodos de biología molecular. Debido a la naturaleza sensible de los métodos de análisis, es esencial que el cristalino esté limpio de tejidos adheridos en la etapa de disección. Esto puede requerir algunas iteraciones de enrollar la lente en un Kimwipe para lograr una limpieza adecuada. Se debe tener cuidado de no penetrar demasiado pro.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la subvención R01 EY032056 (a CC) del Instituto Nacional del Ojo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífuga y rotor | Fisher Scientific | 14285554PM | |
| Cloroformo, grado HPLC | Alfa Aesar | 22920 | |
| Etanol (190 grados) | Laboratorios de descontaminación | 2801 | |
| Etanol (200 grados) | Biorreactivos Fisher | BP2818 | |
| Mortero de pellets Fisherbrand | Fisher Scientific | 12-141-363 | |
| Fórceps Curvados; Pinzas para estudiantes #7 | Instrumentos de precisión del mundo | 501981 | |
| Fórceps Rectos; Dumont #5 | Herramientas de ciencia fina | 11252-40 | |
| Fórceps Rectos; Pinzas para estudiantes #4 | Instrumentos de precisión del mundo | 501978 | |
| Toallitas Kim, pequeñas | Kimberly-Clark | 34155 | Limpieza de tareas delicadas |
| Aplicador de película adhesiva MicroAmp | Biosistemas aplicados | 4333183 | |
| MicroAmp EnduraPlate Placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barras | Biosistemas aplicados | 4483485 | |
| Micropipetas | Eppendorf | 01-671-120 | |
| Microscopio, Disección | Carl Zeiss | Descubrimiento de SteREO.V8 | |
| Cubierta adhesiva óptica MiniAmp | Biosistemas aplicados | 4360954 | |
| Termociclador MiniAmp | Biosistemas aplicados | Referencia A37834 | |
| Mezclador de vórtice de placa MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Agua de grado molecular | Fisher Scientific | BP28191 | |
| Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-UNO-W | |
| Minibandejas Nunc MicroWell | Fisher Scientific | 12-565-154 | Bandeja de disección |
| Tubos de PCR | VWR | 201007-012 | |
| Placa de Petri, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Solución salina tamponada con fosfato, 1x Dulbecco | Gibco | 14190-136 | |
| Puntas de pipeta, 10 µ L Graduado | USA Científico | 1161-3700 | |
| Puntas de pipeta, 1250 µ L XL Graduado | USA Científico | 1161-1720 | |
| Puntas de pipeta, 200 µ Perfil L graduado | USA Científico | 1163-1700 | |
| Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 | Biosistemas aplicados | Referencia A28567 | |
| Transcriptasa inversa, SuperScript IV VILO | Invitrogen | 11756050 | Transcriptasa inversa altamente procesiva y termoestable |
| Kit de limpieza y concentrador de ARN 5 | Zymo | ZR1013 | |
| Agua libre de ARNasa | Biorreactivos Fisher | BP2819 | |
| Aplicación de la Aplicación de la Enfermedad | Sigma | Referencia 2020 | Solución de descontaminación de ARNasa |
| Tubos de microcentrífuga SealRite de 1,5 ml | USA Científico | 1615-5500 | |
| Vannas SuperFine 8 cm | Instrumentos de precisión del mundo | 501778 | Tijeras |
| TaqMan FAST Advanced Master Mix para qPCR | Biosistemas aplicados | 4444557 | |
| Sonda de ensayo de expresión génica TaqMan (FAM) (MTO) | ThermoFisher Scientific | 4448892 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | Solución de ácido-guanidinio-fenol |
| Mezclador de vórtice | Thermo Scientific | 88880017 |
Referencias
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
- Kuszak, J. R.
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Reimpresiones y permisos
