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Artículo de método

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

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DOI:

10.3791/69079

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10 de octubre de 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla la separación del epitelio del cristalino ocular del ratón y la masa a granel de las células de fibra, seguida del aislamiento de ARN y el análisis de qPCR. Este método permite separar los compartimentos de las células del cristalino para un análisis más detallado del transcriptoma y los procesos biológicos en las células epiteliales frente a las células de fibra diferenciadas.

Resumen

El cristalino es un tejido transparente especializado en la cámara anterior del ojo que se compone de dos tipos principales de células, células epiteliales y células de fibra. Una monocapa de células epiteliales del cristalino cubre el hemisferio anterior del cristalino, mientras que la mayor parte del cristalino está compuesto por una masa de células de fibra del cristalino. Una membrana basal de colágeno, conocida como cápsula, rodea y encapsula todo el tejido. Las células epiteliales del cristalino están fuertemente adheridas a la cápsula del cristalino y se pueden separar fácilmente de la masa de fibra a granel despegando la cápsula del tejido. Las dificultades para obtener una concentración suficiente de ARN a partir del bajo número de células epiteliales en la monocapa del cristalino han impedido previamente el estudio de los transcriptomas de células epiteliales frente a las células de fibra. Este protocolo presenta un método para separar y aislar limpiamente los compartimentos de células epiteliales y de fibra y los pasos de concentración de ARN para permitir experimentos transcriptómicos posteriores en muestras de células epiteliales de un solo par de lentes de ratón. La capacidad de investigar los principales tipos de células del cristalino individualmente ayuda a investigar los mecanismos biológicos del mantenimiento y la desregulación del cristalino, lo que permite la caracterización de alteraciones específicas del tipo de célula responsables de las patologías del cristalino relacionadas con la edad.

Introducción

El cristalino ocular es un órgano transparente que enfoca finamente la luz en la retina para producir una imagen clara. El cristalino se compone de dos tipos principales de células: una monocapa de células epiteliales que cubren el hemisferio anterior y células de fibra que forman la masa a granel del tejido (Figura 1). El cristalino está envuelto por una membrana basal de colágeno conocida como cápsula del cristalino, a la que las células epiteliales están fuertemente adheridas. A medida que el cristalino crece, las células epiteliales en el ecuador proliferan y se diferencian en capas nacientes de células de fibra que se colocan en capas sobre el cristalinode manera concéntrica 1,2,3. El crecimiento del cristalino a lo largo de toda la vida depende de la proliferación continua de esta pequeña población de células epiteliales ecuatoriales que conforman la zona germinativa4. A medida que las células de fibra maduran, todos los orgánulos celulares se degradan para eliminar los objetos que dispersan la luz 5,6,7,8,9,10,11 y mantener la transparencia del tejido, y las células de fibra más internas finalmente se compactan, lo que da como resultado un centro de lente rígido 9,12. Debido a la cápsula del cristalino circundante, no hay renovación celular en el cristalino y las fibras seminales permanecen en el centro del cristalino durante toda la vida a medida que se agregan nuevas fibras en la periferia del tejido o la corteza. Las células de fibra del cristalino tienen diferentes propiedades ópticas dependiendo de su edad y pueden proporcionar una instantánea temporal de las diferentes características biológicas en cada etapa dada13.

A pesar de las opciones quirúrgicas disponibles, las cataratas, definidas como cualquier opacidad en el cristalino normalmente transparente, siguen siendo la principal causa de ceguera en el mundo14. Las cataratas pueden manifestarse en el epitelio, la corteza o el núcleo del cristalino con diferentes fisiopatologías15. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares de la formación de cataratas siguen sin estar claros16,17. Para comprender mejor cómo prevenir estos diferentes tipos de cataratas y desarrollar alternativas a la cirugía, debemos comprender mejor cómo estos diferentes tipos de células mantienen su homeostasis en el cristalino.

Las células epiteliales y de fibra desempeñan diferentes funciones fisiológicas en el cristalino. La proliferación celular, por ejemplo, está restringida al epitelio del cristalino18. Mientras tanto, las fibras de la lente comprenden la masa a granel de la lente, proporcionando estructura y propiedades refractivas a la lente9. Para obtener una perspectiva más matizada de los procesos biológicos involucrados en los diferentes compartimentos del cristalino, las células epiteliales y de fibra deben investigarse por separado. Aquí, presentamos un método para aislar el epitelio de la masa a granel de la célula de fibra, extraer ARNm de cada fracción y analizar estas transcripciones utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Figura 1: Diagrama de anatomía de la lente. El cristalino está compuesto por dos tipos de células, una monocapa de células epiteliales (azul y naranja) que cubre el hemisferio anterior y una masa a granel de fibras del cristalino (blanca). El tejido está rodeado por una fina membrana de colágeno, conocida como cápsula del cristalino (bronceado). Las células epiteliales anteriores (azul) están inactivas, mientras que las células epiteliales ecuatoriales (naranja) proliferan, se diferencian y se alargan para convertirse en nuevas capas de células de fibra (blancas) en la periferia del cristalino. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de fibras en capas concéntricas. Las células de fibra del cristalino más antiguas se compactan en el centro del tejido. Esta cifra ha sido modificada de Cheng (2024)38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana.

1. Área de trabajo, equipo y preparación de reactivos

  1. Puntas de pipeta esterilizadas en autoclave antes de su uso y designe cajas de puntas esterilizadas en autoclave para experimentos de ARN para evitar la contaminación por ARNasa.
  2. Trate el área de la superficie de trabajo en la campana extractora y los morteros de homogeneización de tejidos con una solución de descontaminación de ARNasa, enjuague bien con agua desionizada y seque.
  3. Remoje las herramientas de disección (pinzas curvas, pinzas rectas y tijeras de microdisección) en etanol al 70% durante 5 minutos y seque con una toallita delicada antes de usar.
  4. Utilice bandejas de disección y placas de Petri nuevas para los pasos de disección y aislamiento de tejidos.
  5. Alícuotas de 400 μl de reactivo frío de ácido-guanidinio-fenol de TRIzol en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sin DNAsa y ARNasa en la campana extractora.

2. Disección de lentes de ratón

  1. Eutanasia a ratones adultos usando sobredosis de CO2 seguida de dislocación cervical como medida secundaria.
  2. Enuclee los ojos con pinzas curvas.
    1. Presione suavemente el tejido que rodea el ojo con las pinzas, haciendo que el ojo sobresalga de la cuenca. Cierre las pinzas debajo del ojo y retírelas tirando constantemente hacia arriba.
    2. Transfiera los ojos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 750-1000 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  3. Para la disección, transfiera los ojos a los pocillos en una bandeja de disección con 1x PBS nuevo.
  4. Bajo un microscopio de disección, use fórceps rectos para sostener la base del nervio óptico y corte el nervio lo más cerca posible del ojo con unas tijeras de microdisección afiladas.
  5. Inserte con cuidado fórceps finos y rectos en la abertura donde se había conectado el nervio óptico y pellizque para mantener el tejido en su lugar.
  6. Inserte la punta de las tijeras de microdisección en la misma abertura y corte con cuidado desde el polo posterior del ojo hacia la unión córnea-escleral. No inserte los instrumentos demasiado profundamente para evitar dañar la lente.
    NOTA: La lente de roedor ocupa un gran volumen en el ojo y, por lo tanto, se recomiendan cortes poco profundos para evitar perforar la lente.
  7. Cortar a lo largo de la unión córnea-escleral con las tijeras de microdisección, separando al menos la mitad de la circunferencia del ojo.
  8. Use las pinzas rectas para invertir suavemente los tejidos oculares mientras empuja la córnea, extruyendo la lente a través de la incisión corneal-escleral.
  9. Retire con cuidado los tejidos grandes adheridos del cristalino con unas pinzas rectas finas.
  10. Si es necesario, enrolle suavemente la lente en una toallita limpia y delicada con fórceps curvos para eliminar cualquier resto de tejido extralenticular adherente.
    NOTA: Pase el pañuelo rápidamente por la toallita de trabajo y no permita que se seque excesivamente. Puede haber pequeñas opacidades en la superficie del cristalino debido a puntos secos en la cápsula del cristalino. Estas opacidades son generalmente reversibles cuando la lente se vuelve a colocar en PBS 1x y no afectarán los pasos posteriores.
  11. Transfiera la lente limpia a una placa de Petri de 6 cm con 1x PBS.
  12. Con unas pinzas rectas finas, perfore superficialmente la cápsula del cristalino cerca del ecuador y retire suavemente la cápsula del cristalino de la masa a granel de la fibra. Las células epiteliales del cristalino permanecerán unidas a la cápsula. Retire con cuidado cualquier trozo de fibra grande de la cápsula que pueda haberse desprendido con la descapsulación.
  13. Sujete suavemente la cápsula con pinzas finas y rectas y gire el PBS 1x para eliminar las fibras restantes. Cualquier célula de fibra suelta se disociará de la cápsula y las células epiteliales.

3. Aislamiento de ARN

NOTA: En la Figura 2 se muestra un flujo de trabajo resumido para el aislamiento de ARN.

  1. Deposite 2 cápsulas de lentes o 2 masas a granel de fibra en los respectivos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 400 μl de reactivo TRIzol frío.
    NOTA: Las masas de fibra deben moverse del plato al tubo con fórceps curvos para recoger el tejido.
  2. Tape herméticamente y mueva los tubos a una campana extractora de productos químicos para los pasos posteriores.
  3. Homogeneice suavemente las masas a granel de la fibra de la lente con un mortero de gránulos limpio.
    NOTA: Asegúrese de romper la masa de fibra por completo.
  4. Incube muestras (cápsulas de lentes o masas a granel de fibra homogeneizada) en TRIzol durante 30 min a temperatura ambiente en la campana extractora.
  5. En la campana extractora, agregue 200 μL de cloroformo por 400 μL de reactivo TRIzol a cada tubo. Cierre bien los tubos y agite vigorosamente con la mano durante 15 s, manteniendo el pulgar en la parte inferior del tubo y el índice en la tapa.
    NOTA: Los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml indicados en la lista de materiales se utilizan debido al sello hermético. Si usa otras marcas de tubos de microcentrífuga, pruebe el cierre y el sello del tubo antes de agitarlos, ya que la solución de TRIzol y cloroformo puede filtrarse por debajo de la tapa de los tubos que no tienen un sello hermético.
  6. Incube las muestras durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir la separación de fases.
    NOTA: Debe haber una capa de reactivo TRIzol rosa en la parte inferior del tubo que contenga lípidos y proteínas, una capa blanca entre las fases que contenga ADN y una fase acuosa transparente en la parte superior que contenga ARN. La capa blanca de ADN puede ser más difícil de ver en las muestras de células epiteliales.
  7. Centrifugar muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    NOTA: Mueva con cuidado los tubos dentro y fuera de la centrífuga, teniendo cuidado de no alterar las fases de transferencia.
  8. Ensamble tubos y reactivos a partir de un kit de limpieza y concentración de ARN. Los tubos de la columna de centrifugación se colocan en un tubo de recolección del kit.
  9. En la campana extractora, transfiera cuidadosamente la fase acuosa transparente (la capa superior) a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml, tomando nota del volumen.
    NOTA: Evite molestar, tocar o extraer la capa blanca de ADN debajo de la fase acuosa. Incline el tubo al transferir la fase acuosa para evitar perturbar la capa blanca. Es preferible dejar una pequeña cantidad de la fase acuosa en el tubo en lugar de contaminar la muestra. Por lo general, para 200 μL de cloroformo agregado, se pueden recuperar 180-190 μL de fase acuosa.
  10. Agregue etanol de 200 grados a la fase acuosa en una proporción volumétrica de 1: 1.
    NOTA: El tampón de unión al ARN del kit concentrador se puede agregar en una proporción volumétrica de 2: 1 a la fase acuosa antes de agregar etanol. Este paso se omite para aumentar el rendimiento de ARN y porque el ARN tiene suficiente pureza después del aislamiento.
  11. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces o pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la solución mezclada a una columna de centrifugación de ARN utilizando una pipeta.
    NOTA: Tenga cuidado de no tocar el filtro con la punta de la pipeta.
  12. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
    NOTA: Se recomienda etiquetar la tapa de la columna y el lateral del tubo de recogida para mantener organizados los conjuntos de tubos y en caso de que el tapón se rompa en el paso de centrifugación posterior.
  13. Deseche el flujo continuo y agregue 400 μL de tampón de preparación de ARN a la columna de centrifugación.
  14. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
  15. Deseche el flujo continuo y agregue 700 μL de tampón de lavado de ARN a la columna de centrifugación.
  16. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
  17. Deseche el flujo continuo y agregue 400 μL de tampón de lavado de ARN a la columna de centrifugación.
  18. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 1 min a 4 °C.
  19. Deseche el flujo y centrifugue una vez más a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C para asegurarse de que la columna de centrifugado esté seca.
  20. Mueva la columna de centrifugación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado.
  21. Agregue 15 μL de agua libre de ARNasa al filtro de membrana. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Tenga cuidado de no tocar el filtro con la punta de la pipeta.
  22. Centrifugar la columna de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C para eluir el ARN purificado.
    NOTA: La tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml permanecerá abierta durante la centrifugación. Coloque con cuidado las columnas de centrifugación y los tubos de microcentrífuga de modo que las tapas abiertas descansen contra la tapa del rotor para que no se balancee ni se rompa durante la centrifugación. Las tapas deben seguir la dirección de rotación del rotor.
  23. Retire y deseche las columnas de centrifugado. El ARN estará en el líquido recogido en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  24. Cierre herméticamente los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e incube las muestras de ARN a 55-65 °C durante 10 min para promover la resolubilización.
  25. Coloque inmediatamente las muestras en hielo después del paso de calentamiento.
  26. Almacene las muestras a -80 °C o transcriba inversamente en ADNc para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Las muestras de ARN se almacenaron hasta por 3 meses sin pérdida de concentración notable. Alícuotas de muestras de ARN en volúmenes más pequeños para su almacenamiento para minimizar los ciclos de congelación y descongelación y evitar la degradación.

4. Medición de la concentración de ARN mediante un espectrofotómetro UV-Vis

  1. Mantenga las muestras de ARN en hielo, encienda el NanoDrop (espectrofotómetro UV-Vis) y permita que el instrumento se inicialice.
  2. En el menú Ácidos nucleicos , seleccione el módulo de cuantificación de ARN.
  3. Ponga en blanco el espectrofotómetro UV-Vis pipeteando 2,0 μl de eluyente del paso de concentración de ARN en el pedestal, en este caso, agua de grado molecular. Baje el brazo del instrumento y lea la muestra en blanco.
  4. Levante el brazo del instrumento, limpie el pedestal del sensor con una toallita limpia y seca para tareas delicadas y, seguida, otra toallita humedecida con agua desionizada, seguida de una toallita seca una vez más.
  5. Si lo desea, introduzca los detalles de la muestra en la interfaz del espectrofotómetro UV-Vis.
  6. Cargue 2,0 μl de la muestra de ARN en el pedestal, baje el brazo y cuantifique.
  7. Repita los pasos 4.4 a 4.6 para limpiar el pedestal entre muestras.
  8. Cuando haya terminado, guarde y exporte el experimento para una mayor cuantificación si es necesario.

5. Transcripción inversa

  1. Utilizando una transcriptasa inversa altamente procesiva y termoestable, transcriba inversamente 2,0 μg de ARN de fibra de lente y todo el ARN epitelial extraído utilizando el protocolo recomendado por el fabricante. Mezcle los reactivos y el ARN para cada muestra en un tubo de PCR limpio. Mantenga todas las soluciones y muestras de ARN en hielo.
    NOTA: Esta transcriptasa puede transcribir inversamente hasta 2,5 μg de ARN por reacción. Se supone una conversión completa de ARN a ADNc, por lo que la concentración inicial de ARN se utiliza como concentración presunta de ADNc.
  2. Ejecute la reacción en el termociclador utilizando las condiciones enumeradas en la Tabla 1.
  3. Almacene el ADNc transcrito de forma inversa a -80 °C o continúe con el paso de qPCR.
    NOTA: las muestras de ADNc se almacenaron hasta por 4 meses sin degradación notable, ya que el ADNc es más estable que el ARN. Es probable que las muestras se puedan almacenar durante más tiempo, siempre que se minimicen los ciclos de congelación y descongelación.
PasoTemperatura (°C)Tiempo (min)Ciclos
Recocido25101
Transcripción inversa50101
Inactivación enzimática8551
Sostener4∞1

Tabla 1: Condiciones del termociclador para la transcripción inversa. Estas condiciones están en sintonía con una transcriptasa inversa específica, altamente procesiva y termoestable. Las condiciones de funcionamiento pueden variar según la enzima y el kit utilizado.

6. PCR cuantitativa en tiempo real

  1. Antes de iniciar las reacciones, prepare las soluciones madre de ADNc a la concentración deseada diluyéndolas con agua de grado molecular. En estos experimentos, se utilizará 1 μL de ADNc a 5 ng/μL para reacciones de 5 ng/pocillo. Mantenga todas las soluciones y muestras de ADNc en hielo.
    NOTA: Se recomiendan las placas de matriz TaqMan (formato de 0,1 ml) para acomodar reacciones de 5-50 ng de ADNc por pocillo. Hacer alícuotas de ADNc es útil para limitar los ciclos de congelación y descongelación. En este estudio, las muestras se limitaron a un máximo de 5 ciclos de congelación y descongelación.
  2. Prepare una mezcla maestra de trabajo compuesta por Advanced Master Mix y sondas según las recomendaciones comerciales. Consulte la sección 7 para ver un ejemplo de preparación. Mantenga todas las soluciones y muestras de ADNc en hielo.
    NOTA: Comúnmente se usa un par de sondas con dos colorantes diferentes por pocillo. Por ejemplo, en este estudio, Crygs-FAM-MGB se utilizó como sonda de gen de interés y Ppia-VIC-MGB como control interno. Las recomendaciones comerciales para las concentraciones finales de la sonda y el cebador son 250 nM y 900 nM, respectivamente. Si un objetivo está muy expresado, es posible que se necesite una sonda limitada por cebador para evitar el agotamiento de los reactivos de reacción.
  3. Cargue el material de ADNc (1 μL) en los pocillos apropiados en la placa qPCR, seguido de la mezcla maestra de trabajo (9 μL). Mezcle las soluciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente mientras agrega la mezcla maestra. Asegúrese de que la gota de ADNc se mezcle con la solución y evite las burbujas.
    NOTA: Dependiendo de la sensibilidad del objetivo, es posible que sea necesario cargar la placa en hielo.
  4. Selle la placa de qPCR aplicando cuidadosamente una cubierta adhesiva óptica. Use un aplicador de película adhesiva para alisar la cubierta y asegurar un sello hermético alrededor de cada pocillo.
  5. Placas de vórtice a 1000 RPM durante 10 s para mezclar.
  6. Centrifugar placas a 1000 x g durante 2 min a temperatura ambiente para asegurarse de que no haya burbujas de aire en el fondo de los pocillos.
  7. Cargue la placa en un termociclador de PCR cuantitativo y ejecute utilizando los ciclos enumerados en la Tabla 2.
    NOTA: Los protocolos de qPCR convencionales suelen estar limitados a 40 ciclos. Es poco probable que aumentar el recuento de ciclos produzca resultados significativos, ya que en 40 ciclos, una sola copia objetivo puede producir teóricamente aproximadamente 1 billón de amplicones19.
PasoTemperatura (°C)Tiempo (s)Ciclos
Inactivación de uracilo-N-glicosilasa (UNG)501201
Desnaturalización951201
Desnaturalización95145
Recocido6020
Sostener4∞1

Tabla 2: Condiciones del termociclador para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Estas condiciones están en sintonía con una serie específica de ensayos comerciales de expresión génica. Se utilizan parámetros predeterminados, con la excepción de aumentar los ciclos de amplificación de 40 a 45.

7. Ejemplo de cálculo de volumen para qPCR

NOTA: Un código fuente R para una calculadora de volumen para las ecuaciones descritas a continuación está disponible en el Archivo complementario 1. Esta calculadora es para las sondas Taqman y la mezcla maestra enumeradas en la Tabla de materiales.

  1. Determine el número de pocillos a pipetear y calcule un mínimo de 12,5% de exceso. Esta constante de exceso (kexceso) compensa el error de pipeteo y garantiza que haya suficiente solución. Para este ejemplo, se utilizarán 96 pocillos como objetivo para la preparación de muestras.
    Ecuación:
    figure-protocol-1
    Ejemplo:
    figure-protocol-2
    NOTA: Si el exceso del 12,5% no es un número entero, una manera fácil de garantizar números "agradables" en los pasos posteriores es redondear al pozo más cercano y ajustar kExceso en consecuencia.
  2. Calcule el volumen de mezcla maestra de trabajo. En estos experimentos, se utilizan 1 μL de ADNc y 9 μL de mezcla maestra de trabajo por pocillo. Los volúmenes de ADNc y mezcla maestra se pueden ajustar según sea necesario.
    Ecuación:
    figure-protocol-3
    Ejemplo:
    figure-protocol-4
  3. Calcule el modificador de concentración (kConc). Este modificador se utiliza para crear una mezcla maestra de trabajo más concentrada que se diluirá a 1x cuando se mezcle con ADNc.
    Ecuación:
    figure-protocol-5
    Ejemplo:
    figure-protocol-6
  4. Calcule el volumen de la sonda (20x).
    Ecuación:
    figure-protocol-7
    Ejemplo:
    figure-protocol-8
  5. Calcule el volumen de stock de mezcla maestra (2x).
    Ecuación:
    figure-protocol-9
    Ejemplo:
    figure-protocol-10
  6. Lleve la mezcla maestra de trabajo al volumen calculado utilizando H2O de grado molecular.
    Ecuación:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Ejemplo:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Archivo complementario 1: Un código fuente R para una calculadora de volumen. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Resultados

El epitelio y las fibras del cristalino se aislaron de ratones de tipo salvaje de 6 a 7 semanas de edad. Se utilizaron tres ratones para estos experimentos, y se agruparon 2 cápsulas de lentes o 2 masas de células de fibra de cada ratón para obtener una réplica biológica. Como se describe en el protocolo, el ARN se extrajo mediante la separación de fases de reactivos TRIzol. En promedio, un par de masas a granel de epitelio y fibra del cristalino produjeron 0,8 μg (DE ± 0,2) y 9,7 μg (DE ± 2,3) de ARN, respectivamente. L...

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Discusión

Los pasos presentados aquí demuestran la capacidad de aislar ARN de compartimentos de lentes separados que se pueden transcribir con éxito en ADNc para métodos de biología molecular. Debido a la naturaleza sensible de los métodos de análisis, es esencial que el cristalino esté limpio de tejidos adheridos en la etapa de disección. Esto puede requerir algunas iteraciones de enrollar la lente en un Kimwipe para lograr una limpieza adecuada. Se debe tener cuidado de no penetrar demasiado pro...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la subvención R01 EY032056 (a CC) del Instituto Nacional del Ojo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Centrífuga y rotorFisher Scientific14285554PM
Cloroformo, grado HPLCAlfa Aesar22920
Etanol (190 grados)Laboratorios de descontaminación2801
Etanol (200 grados)Biorreactivos FisherBP2818
Mortero de pellets FisherbrandFisher Scientific12-141-363
Fórceps Curvados; Pinzas para estudiantes #7Instrumentos de precisión del mundo501981
Fórceps Rectos; Dumont #5Herramientas de ciencia fina11252-40
Fórceps Rectos; Pinzas para estudiantes #4Instrumentos de precisión del mundo501978
Toallitas Kim, pequeñasKimberly-Clark34155Limpieza de tareas delicadas
Aplicador de película adhesiva MicroAmpBiosistemas aplicados4333183
MicroAmp EnduraPlate Placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barrasBiosistemas aplicados4483485
MicropipetasEppendorf  01-671-120
Microscopio, DisecciónCarl ZeissDescubrimiento de SteREO.V8
Cubierta adhesiva óptica MiniAmpBiosistemas aplicados4360954
Termociclador MiniAmpBiosistemas aplicadosReferencia A37834
Mezclador de vórtice de placa MixMateEppendorf5353000529
Agua de grado molecularFisher ScientificBP28191
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen Nanodrop OneThermo ScientificND-UNO-W
Minibandejas Nunc MicroWellFisher Scientific12-565-154Bandeja de disección
Tubos de PCRVWR201007-012
Placa de Petri, 60 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713A
Solución salina tamponada con fosfato, 1x DulbeccoGibco14190-136
Puntas de pipeta, 10 µ L GraduadoUSA Científico1161-3700
Puntas de pipeta, 1250 µ L XL GraduadoUSA Científico1161-1720
Puntas de pipeta, 200 µ Perfil L graduadoUSA Científico1163-1700
Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3Biosistemas aplicadosReferencia A28567
Transcriptasa inversa, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Transcriptasa inversa altamente procesiva y termoestable
Kit de limpieza y concentrador de ARN 5ZymoZR1013
Agua libre de ARNasaBiorreactivos FisherBP2819
Aplicación de la Aplicación de la EnfermedadSigmaReferencia 2020Solución de descontaminación de ARNasa
Tubos de microcentrífuga SealRite de 1,5 mlUSA Científico1615-5500
Vannas SuperFine 8 cmInstrumentos de precisión del mundo501778Tijeras
TaqMan FAST Advanced Master Mix para qPCRBiosistemas aplicados4444557
Sonda de ensayo de expresión génica TaqMan (FAM) (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
TRIzolInvitrogen15596026Solución de ácido-guanidinio-fenol
Mezclador de vórticeThermo Scientific88880017

Referencias

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  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
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  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
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