Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

El cristalino ocular es un órgano transparente que enfoca finamente la luz en la retina para producir una imagen clara. El cristalino se compone de dos tipos principales de células: una monocapa de células epiteliales que cubren el hemisferio anterior y células de fibra que forman la masa a granel del tejido (Figura 1). El cristalino está envuelto por una membrana basal de colágeno conocida como cápsula del cristalino, a la que las células epiteliales están fuertemente adheridas. A medida que el cristalino crece, las células epiteliales en el ecuador proliferan y se diferencian en capas nacientes de células de fibra que se colocan en capas sobre el cristalino^de manera concéntrica ^1,2,3. El crecimiento del cristalino a lo largo de toda la vida depende de la proliferación continua de esta pequeña población de células epiteliales ecuatoriales que conforman la zona germinativa⁴. A medida que las células de fibra maduran, todos los orgánulos celulares se degradan para eliminar los objetos que dispersan la luz 5,6,7,8,9,10,11 y mantener la transparencia del tejido, y las células de fibra más internas finalmente se compactan, lo que da como resultado un centro de lente rígido ^9,12. Debido a la cápsula del cristalino circundante, no hay renovación celular en el cristalino y las fibras seminales permanecen en el centro del cristalino durante toda la vida a medida que se agregan nuevas fibras en la periferia del tejido o la corteza. Las células de fibra del cristalino tienen diferentes propiedades ópticas dependiendo de su edad y pueden proporcionar una instantánea temporal de las diferentes características biológicas en cada etapa dada¹³.

A pesar de las opciones quirúrgicas disponibles, las cataratas, definidas como cualquier opacidad en el cristalino normalmente transparente, siguen siendo la principal causa de ceguera en el mundo¹⁴. Las cataratas pueden manifestarse en el epitelio, la corteza o el núcleo del cristalino con diferentes fisiopatologías¹⁵. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares de la formación de cataratas siguen sin estar claros^16,17. Para comprender mejor cómo prevenir estos diferentes tipos de cataratas y desarrollar alternativas a la cirugía, debemos comprender mejor cómo estos diferentes tipos de células mantienen su homeostasis en el cristalino.

Las células epiteliales y de fibra desempeñan diferentes funciones fisiológicas en el cristalino. La proliferación celular, por ejemplo, está restringida al epitelio del cristalino¹⁸. Mientras tanto, las fibras de la lente comprenden la masa a granel de la lente, proporcionando estructura y propiedades refractivas a la lente⁹. Para obtener una perspectiva más matizada de los procesos biológicos involucrados en los diferentes compartimentos del cristalino, las células epiteliales y de fibra deben investigarse por separado. Aquí, presentamos un método para aislar el epitelio de la masa a granel de la célula de fibra, extraer ARNm de cada fracción y analizar estas transcripciones utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).

Figura 1: Diagrama de anatomía de la lente. El cristalino está compuesto por dos tipos de células, una monocapa de células epiteliales (azul y naranja) que cubre el hemisferio anterior y una masa a granel de fibras del cristalino (blanca). El tejido está rodeado por una fina membrana de colágeno, conocida como cápsula del cristalino (bronceado). Las células epiteliales anteriores (azul) están inactivas, mientras que las células epiteliales ecuatoriales (naranja) proliferan, se diferencian y se alargan para convertirse en nuevas capas de células de fibra (blancas) en la periferia del cristalino. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de fibras en capas concéntricas. Las células de fibra del cristalino más antiguas se compactan en el centro del tejido. Esta cifra ha sido modificada de Cheng (2024)³⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana.

1. Área de trabajo, equipo y preparación de reactivos

1. Puntas de pipeta esterilizadas en autoclave antes de su uso y designe cajas de puntas esterilizadas en autoclave para experimentos de ARN para evitar la contaminación por ARNasa.
2. Trate el área de la superficie de trabajo en la campana extractora y los morteros de homogeneización de tejidos con una solución de descontaminación de ARNasa, enjuague bien con agua desionizada y seque.
3. Remoje las herramientas de disección (pinzas curvas, pinzas rectas y tijeras de microdisección) en etanol al 70% durante 5 minutos y seque con una toallita delicada antes de usar.
4. Utilice bandejas de disección y placas de Petri nuevas para los pasos de disección y aislamiento de tejidos.
5. Alícuotas de 400 μl de reactivo frío de ácido-guanidinio-fenol de TRIzol en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sin DNAsa y ARNasa en la campana extractora.

2. Disección de lentes de ratón

1. Eutanasia a ratones adultos usando sobredosis de CO₂ seguida de dislocación cervical como medida secundaria.
2. Enuclee los ojos con pinzas curvas.
   1. Presione suavemente el tejido que rodea el ojo con las pinzas, haciendo que el ojo sobresalga de la cuenca. Cierre las pinzas debajo del ojo y retírelas tirando constantemente hacia arriba.
   2. Transfiera los ojos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 750-1000 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Para la disección, transfiera los ojos a los pocillos en una bandeja de disección con 1x PBS nuevo.
4. Bajo un microscopio de disección, use fórceps rectos para sostener la base del nervio óptico y corte el nervio lo más cerca posible del ojo con unas tijeras de microdisección afiladas.
5. Inserte con cuidado fórceps finos y rectos en la abertura donde se había conectado el nervio óptico y pellizque para mantener el tejido en su lugar.
6. Inserte la punta de las tijeras de microdisección en la misma abertura y corte con cuidado desde el polo posterior del ojo hacia la unión córnea-escleral. No inserte los instrumentos demasiado profundamente para evitar dañar la lente.
   NOTA: La lente de roedor ocupa un gran volumen en el ojo y, por lo tanto, se recomiendan cortes poco profundos para evitar perforar la lente.
7. Cortar a lo largo de la unión córnea-escleral con las tijeras de microdisección, separando al menos la mitad de la circunferencia del ojo.
8. Use las pinzas rectas para invertir suavemente los tejidos oculares mientras empuja la córnea, extruyendo la lente a través de la incisión corneal-escleral.
9. Retire con cuidado los tejidos grandes adheridos del cristalino con unas pinzas rectas finas.
10. Si es necesario, enrolle suavemente la lente en una toallita limpia y delicada con fórceps curvos para eliminar cualquier resto de tejido extralenticular adherente.
    NOTA: Pase el pañuelo rápidamente por la toallita de trabajo y no permita que se seque excesivamente. Puede haber pequeñas opacidades en la superficie del cristalino debido a puntos secos en la cápsula del cristalino. Estas opacidades son generalmente reversibles cuando la lente se vuelve a colocar en PBS 1x y no afectarán los pasos posteriores.
11. Transfiera la lente limpia a una placa de Petri de 6 cm con 1x PBS.
12. Con unas pinzas rectas finas, perfore superficialmente la cápsula del cristalino cerca del ecuador y retire suavemente la cápsula del cristalino de la masa a granel de la fibra. Las células epiteliales del cristalino permanecerán unidas a la cápsula. Retire con cuidado cualquier trozo de fibra grande de la cápsula que pueda haberse desprendido con la descapsulación.
13. Sujete suavemente la cápsula con pinzas finas y rectas y gire el PBS 1x para eliminar las fibras restantes. Cualquier célula de fibra suelta se disociará de la cápsula y las células epiteliales.

3. Aislamiento de ARN

NOTA: En la Figura 2 se muestra un flujo de trabajo resumido para el aislamiento de ARN.

1. Deposite 2 cápsulas de lentes o 2 masas a granel de fibra en los respectivos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 400 μl de reactivo TRIzol frío.
   NOTA: Las masas de fibra deben moverse del plato al tubo con fórceps curvos para recoger el tejido.
2. Tape herméticamente y mueva los tubos a una campana extractora de productos químicos para los pasos posteriores.
3. Homogeneice suavemente las masas a granel de la fibra de la lente con un mortero de gránulos limpio.
   NOTA: Asegúrese de romper la masa de fibra por completo.
4. Incube muestras (cápsulas de lentes o masas a granel de fibra homogeneizada) en TRIzol durante 30 min a temperatura ambiente en la campana extractora.
5. En la campana extractora, agregue 200 μL de cloroformo por 400 μL de reactivo TRIzol a cada tubo. Cierre bien los tubos y agite vigorosamente con la mano durante 15 s, manteniendo el pulgar en la parte inferior del tubo y el índice en la tapa.
   NOTA: Los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml indicados en la lista de materiales se utilizan debido al sello hermético. Si usa otras marcas de tubos de microcentrífuga, pruebe el cierre y el sello del tubo antes de agitarlos, ya que la solución de TRIzol y cloroformo puede filtrarse por debajo de la tapa de los tubos que no tienen un sello hermético.
6. Incube las muestras durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir la separación de fases.
   NOTA: Debe haber una capa de reactivo TRIzol rosa en la parte inferior del tubo que contenga lípidos y proteínas, una capa blanca entre las fases que contenga ADN y una fase acuosa transparente en la parte superior que contenga ARN. La capa blanca de ADN puede ser más difícil de ver en las muestras de células epiteliales.
7. Centrifugar muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   NOTA: Mueva con cuidado los tubos dentro y fuera de la centrífuga, teniendo cuidado de no alterar las fases de transferencia.
8. Ensamble tubos y reactivos a partir de un kit de limpieza y concentración de ARN. Los tubos de la columna de centrifugación se colocan en un tubo de recolección del kit.
9. En la campana extractora, transfiera cuidadosamente la fase acuosa transparente (la capa superior) a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml, tomando nota del volumen.
   NOTA: Evite molestar, tocar o extraer la capa blanca de ADN debajo de la fase acuosa. Incline el tubo al transferir la fase acuosa para evitar perturbar la capa blanca. Es preferible dejar una pequeña cantidad de la fase acuosa en el tubo en lugar de contaminar la muestra. Por lo general, para 200 μL de cloroformo agregado, se pueden recuperar 180-190 μL de fase acuosa.
10. Agregue etanol de 200 grados a la fase acuosa en una proporción volumétrica de 1: 1.
    NOTA: El tampón de unión al ARN del kit concentrador se puede agregar en una proporción volumétrica de 2: 1 a la fase acuosa antes de agregar etanol. Este paso se omite para aumentar el rendimiento de ARN y porque el ARN tiene suficiente pureza después del aislamiento.
11. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces o pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la solución mezclada a una columna de centrifugación de ARN utilizando una pipeta.
    NOTA: Tenga cuidado de no tocar el filtro con la punta de la pipeta.
12. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
    NOTA: Se recomienda etiquetar la tapa de la columna y el lateral del tubo de recogida para mantener organizados los conjuntos de tubos y en caso de que el tapón se rompa en el paso de centrifugación posterior.
13. Deseche el flujo continuo y agregue 400 μL de tampón de preparación de ARN a la columna de centrifugación.
14. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
15. Deseche el flujo continuo y agregue 700 μL de tampón de lavado de ARN a la columna de centrifugación.
16. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
17. Deseche el flujo continuo y agregue 400 μL de tampón de lavado de ARN a la columna de centrifugación.
18. Centrifugar columnas de centrifugación a 16.000 x g durante 1 min a 4 °C.
19. Deseche el flujo y centrifugue una vez más a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C para asegurarse de que la columna de centrifugado esté seca.
20. Mueva la columna de centrifugación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado.
21. Agregue 15 μL de agua libre de ARNasa al filtro de membrana. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Tenga cuidado de no tocar el filtro con la punta de la pipeta.
22. Centrifugar la columna de centrifugación a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C para eluir el ARN purificado.
    NOTA: La tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml permanecerá abierta durante la centrifugación. Coloque con cuidado las columnas de centrifugación y los tubos de microcentrífuga de modo que las tapas abiertas descansen contra la tapa del rotor para que no se balancee ni se rompa durante la centrifugación. Las tapas deben seguir la dirección de rotación del rotor.
23. Retire y deseche las columnas de centrifugado. El ARN estará en el líquido recogido en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
24. Cierre herméticamente los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e incube las muestras de ARN a 55-65 °C durante 10 min para promover la resolubilización.
25. Coloque inmediatamente las muestras en hielo después del paso de calentamiento.
26. Almacene las muestras a -80 °C o transcriba inversamente en ADNc para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Las muestras de ARN se almacenaron hasta por 3 meses sin pérdida de concentración notable. Alícuotas de muestras de ARN en volúmenes más pequeños para su almacenamiento para minimizar los ciclos de congelación y descongelación y evitar la degradación.

4. Medición de la concentración de ARN mediante un espectrofotómetro UV-Vis

1. Mantenga las muestras de ARN en hielo, encienda el NanoDrop (espectrofotómetro UV-Vis) y permita que el instrumento se inicialice.
2. En el menú Ácidos nucleicos , seleccione el módulo de cuantificación de ARN.
3. Ponga en blanco el espectrofotómetro UV-Vis pipeteando 2,0 μl de eluyente del paso de concentración de ARN en el pedestal, en este caso, agua de grado molecular. Baje el brazo del instrumento y lea la muestra en blanco.
4. Levante el brazo del instrumento, limpie el pedestal del sensor con una toallita limpia y seca para tareas delicadas y, seguida, otra toallita humedecida con agua desionizada, seguida de una toallita seca una vez más.
5. Si lo desea, introduzca los detalles de la muestra en la interfaz del espectrofotómetro UV-Vis.
6. Cargue 2,0 μl de la muestra de ARN en el pedestal, baje el brazo y cuantifique.
7. Repita los pasos 4.4 a 4.6 para limpiar el pedestal entre muestras.
8. Cuando haya terminado, guarde y exporte el experimento para una mayor cuantificación si es necesario.

5. Transcripción inversa

1. Utilizando una transcriptasa inversa altamente procesiva y termoestable, transcriba inversamente 2,0 μg de ARN de fibra de lente y todo el ARN epitelial extraído utilizando el protocolo recomendado por el fabricante. Mezcle los reactivos y el ARN para cada muestra en un tubo de PCR limpio. Mantenga todas las soluciones y muestras de ARN en hielo.
   NOTA: Esta transcriptasa puede transcribir inversamente hasta 2,5 μg de ARN por reacción. Se supone una conversión completa de ARN a ADNc, por lo que la concentración inicial de ARN se utiliza como concentración presunta de ADNc.
2. Ejecute la reacción en el termociclador utilizando las condiciones enumeradas en la Tabla 1.
3. Almacene el ADNc transcrito de forma inversa a -80 °C o continúe con el paso de qPCR.
   NOTA: las muestras de ADNc se almacenaron hasta por 4 meses sin degradación notable, ya que el ADNc es más estable que el ARN. Es probable que las muestras se puedan almacenar durante más tiempo, siempre que se minimicen los ciclos de congelación y descongelación.

Tabla 1: Condiciones del termociclador para la transcripción inversa. Estas condiciones están en sintonía con una transcriptasa inversa específica, altamente procesiva y termoestable. Las condiciones de funcionamiento pueden variar según la enzima y el kit utilizado.

6. PCR cuantitativa en tiempo real

1. Antes de iniciar las reacciones, prepare las soluciones madre de ADNc a la concentración deseada diluyéndolas con agua de grado molecular. En estos experimentos, se utilizará 1 μL de ADNc a 5 ng/μL para reacciones de 5 ng/pocillo. Mantenga todas las soluciones y muestras de ADNc en hielo.
   NOTA: Se recomiendan las placas de matriz TaqMan (formato de 0,1 ml) para acomodar reacciones de 5-50 ng de ADNc por pocillo. Hacer alícuotas de ADNc es útil para limitar los ciclos de congelación y descongelación. En este estudio, las muestras se limitaron a un máximo de 5 ciclos de congelación y descongelación.
2. Prepare una mezcla maestra de trabajo compuesta por Advanced Master Mix y sondas según las recomendaciones comerciales. Consulte la sección 7 para ver un ejemplo de preparación. Mantenga todas las soluciones y muestras de ADNc en hielo.
   NOTA: Comúnmente se usa un par de sondas con dos colorantes diferentes por pocillo. Por ejemplo, en este estudio, Crygs-FAM-MGB se utilizó como sonda de gen de interés y Ppia-VIC-MGB como control interno. Las recomendaciones comerciales para las concentraciones finales de la sonda y el cebador son 250 nM y 900 nM, respectivamente. Si un objetivo está muy expresado, es posible que se necesite una sonda limitada por cebador para evitar el agotamiento de los reactivos de reacción.
3. Cargue el material de ADNc (1 μL) en los pocillos apropiados en la placa qPCR, seguido de la mezcla maestra de trabajo (9 μL). Mezcle las soluciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente mientras agrega la mezcla maestra. Asegúrese de que la gota de ADNc se mezcle con la solución y evite las burbujas.
   NOTA: Dependiendo de la sensibilidad del objetivo, es posible que sea necesario cargar la placa en hielo.
4. Selle la placa de qPCR aplicando cuidadosamente una cubierta adhesiva óptica. Use un aplicador de película adhesiva para alisar la cubierta y asegurar un sello hermético alrededor de cada pocillo.
5. Placas de vórtice a 1000 RPM durante 10 s para mezclar.
6. Centrifugar placas a 1000 x g durante 2 min a temperatura ambiente para asegurarse de que no haya burbujas de aire en el fondo de los pocillos.
7. Cargue la placa en un termociclador de PCR cuantitativo y ejecute utilizando los ciclos enumerados en la Tabla 2.
   NOTA: Los protocolos de qPCR convencionales suelen estar limitados a 40 ciclos. Es poco probable que aumentar el recuento de ciclos produzca resultados significativos, ya que en 40 ciclos, una sola copia objetivo puede producir teóricamente aproximadamente 1 billón de amplicones¹⁹.

Tabla 2: Condiciones del termociclador para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Estas condiciones están en sintonía con una serie específica de ensayos comerciales de expresión génica. Se utilizan parámetros predeterminados, con la excepción de aumentar los ciclos de amplificación de 40 a 45.

7. Ejemplo de cálculo de volumen para qPCR

NOTA: Un código fuente R para una calculadora de volumen para las ecuaciones descritas a continuación está disponible en el Archivo complementario 1. Esta calculadora es para las sondas Taqman y la mezcla maestra enumeradas en la Tabla de materiales.

1. Determine el número de pocillos a pipetear y calcule un mínimo de 12,5% de exceso. Esta constante de exceso (k_exceso) compensa el error de pipeteo y garantiza que haya suficiente solución. Para este ejemplo, se utilizarán 96 pocillos como objetivo para la preparación de muestras.
   Ecuación:
   
   Ejemplo:
   
   NOTA: Si el exceso del 12,5% no es un número entero, una manera fácil de garantizar números "agradables" en los pasos posteriores es redondear al pozo más cercano y ajustar k_Exceso en consecuencia.
2. Calcule el volumen de mezcla maestra de trabajo. En estos experimentos, se utilizan 1 μL de ADNc y 9 μL de mezcla maestra de trabajo por pocillo. Los volúmenes de ADNc y mezcla maestra se pueden ajustar según sea necesario.
   Ecuación:
   
   Ejemplo:
   
3. Calcule el modificador de concentración (k_Conc). Este modificador se utiliza para crear una mezcla maestra de trabajo más concentrada que se diluirá a 1x cuando se mezcle con ADNc.
   Ecuación:
   
   Ejemplo:
   
4. Calcule el volumen de la sonda (20x).
   Ecuación:
   
   Ejemplo:
   
5. Calcule el volumen de stock de mezcla maestra (2x).
   Ecuación:
   
   Ejemplo:
   
6. Lleve la mezcla maestra de trabajo al volumen calculado utilizando H₂O de grado molecular.
   Ecuación:
   
   
   
   
   
   Ejemplo:
   
   
   
   
   

Archivo complementario 1: Un código fuente R para una calculadora de volumen. Haga clic aquí para descargar este archivo.

El epitelio y las fibras del cristalino se aislaron de ratones de tipo salvaje de 6 a 7 semanas de edad. Se utilizaron tres ratones para estos experimentos, y se agruparon 2 cápsulas de lentes o 2 masas de células de fibra de cada ratón para obtener una réplica biológica. Como se describe en el protocolo, el ARN se extrajo mediante la separación de fases de reactivos TRIzol. En promedio, un par de masas a granel de epitelio y fibra del cristalino produjeron 0,8 μg (DE ± 0,2) y 9,7 μg (DE ± 2,3) de ARN, respectivamente. La concentración promedio en una elución de 15 μL fue de 55,4 ng/μL (DE ± 16,3) y 650,0 ng/μL (DE ± 152,2) para las muestras de epitelio y fibra, respectivamente. Usando reacciones de 5 ng / pocillo, esto teóricamente permite un promedio de 160 reacciones de un solo par de epitelio de lente aislado usando este protocolo. Las purezas promedio de ARN medidas por las proporciones A260/280 fueron 1,92 (DE ± 0,05) para el epitelio y 2,05 (DE ± 0,01) para las fibras, lo que indica una contaminación mínima de proteínas. Generalmente, una relación A260/280 de ~2.0 se considera pura para el ARN20. En general, este aislamiento produjo una concentración suficiente de ARN de alta pureza para transcribir inversamente a ADNc y realizar experimentos repetidos de qPCR.

Realizamos transcripción inversa y qPCR como se describe en el protocolo. Elegimos 7 genes con alta expresión conocida de transcripciones o proteínas en la lente para el análisis de qPCR en tiempo real para revelar la expresión diferencial entre los compartimentos tisulares 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. La expresión relativa se muestra como valores de 2-ΔΔCq, normalizados a células epiteliales (Figura 3). La expresión relativa media se muestra como medias geométricas con desviaciones estándar. Debido a la expresión diferencial conocida, se utilizaron conexinas para determinar la separación exitosa del epitelio y las células de fibra. Conexina 43 (Cx43; proteína de unión gap alfa 1; Gja1) se expresa en las células epiteliales del cristalino33, Cx46 (Gja3) se expresa en las células de fibra del cristalino34 y Cx50 (Gja8) se expresa tanto en las células epiteliales como en las de fibra25,29. Se observa que las fibras del cristalino expresan Gja1 y Gja8 a niveles aproximadamente 200 y 7,5 veces más bajos que el epitelio del cristalino, respectivamente. Mientras tanto, Gja3 se expresa aproximadamente 1,5 veces más en las fibras del cristalino, de acuerdo con informes anteriores28.

De manera similar, se observó una expresión diferencial con las cadherinas, a saber, E-cadherina (Cdh1) y N-cadherina (Cdh2). La expresión de la proteína E-cadherina está restringida al epitelio del cristalino, mientras que la N-cadherina se expresa tanto en el epitelio como en las fibras35. Aquí mostramos que la expresión de Cdh1 y Cdh2 son aproximadamente 330 veces y 2,4 veces más bajas en las fibras en comparación con el epitelio.

También se utilizaron dos marcadores adicionales de células epiteliales y de fibra, emparejados box 6 (Pax6) y γS-cristalina (Crygs), respectivamente, para demostrar la separación exitosa de los compartimentos del cristalino36,37. De acuerdo con los patrones de expresión observados anteriormente, Pax6 está restringido a las células epiteliales, exhibiendo una expresión 8 veces menor en las fibras. Las proteínas gamma-cristalinas se expresan principalmente en las células de la fibra del cristalino, y observamos que Crygs es aproximadamente 3 veces mayor en las fibras en comparación con el epitelio1. Estos datos indican una separación limpia del epitelio del cristalino y la masa de fibras, lo que permite el análisis transcriptómico de cada compartimento tisular para su comparación.

Figura 2: Un diagrama de flujo de trabajo de aislamiento de ARN paso a paso. (A) Separación de fases: pasos 3.1-3.11. Estos pasos representan el proceso de homogeneización del tejido primario, extracción de ARN y aislamiento del ARN mediante una separación de fases ácido-guanidinio-fenol. (B) Concentración de ARN: pasos 3.12-3.19. Estos pasos representan el lavado y la concentración de ARN aislado utilizando columnas limpias y concentradoras. (C) Elución: pasos 3.20-3.26. Estos pasos representan la elución del ARN de las columnas de limpieza y concentración utilizando agua libre de ARNasa y calentamiento para promover la solubilización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión génica relativa comparando el epitelio del cristalino aislado con la masa a granel de la célula de la fibra. Los niveles de ARN se normalizan en el compartimento epitelial. Los marcadores de células epiteliales Gja1 [codifican para la conexina 43 (Cx43)], Chd1 (codifica para E-cadherina) y Pax6 (codifican para el factor de transcripción Pax6) muestran una expresión elevada en las células epiteliales en comparación con las células de fibra. Los marcadores celulares de fibra Gja3 (codifica para Cx46) y Crygs (codifica γS-cristalina) muestran una expresión elevada en comparación con el epitelio. Los marcadores expresados tanto en el epitelio como en las células de fibra, Gja8 (codifica para Cx50) y Chd2 (codifica para N-cadherina), muestran una señal detectable en ambos compartimentos. Los gráficos muestran medias geométricas con desviaciones estándar utilizando el método 2-ΔΔCq . La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Šidák. * p ≤ 0,05; ** p≤ 0,01; p≤ 0,001; p≤ 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.