Este estudio presenta un método para evaluar la función de PAK5 en el ESCC, mostrando que su sobreexpresión predice un pronóstico negativo y promueve la progresión tumoral a través del eje de señalización PAK5-GAREM1.
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Artículo de investigación
Este estudio presenta un método para evaluar la función de PAK5 en el ESCC, mostrando que su sobreexpresión predice un pronóstico negativo y promueve la progresión tumoral a través del eje de señalización PAK5-GAREM1.
El carcinoma escamoso esofágico (ESCC) es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial, especialmente en Asia. Debido a la falta de síntomas tempranos, la mayoría de los pacientes son diagnosticados en fases avanzadas, lo que limita la eficacia del tratamiento y empeora el pronóstico. Comprender los mecanismos subyacentes a la ESCC e identificar biomarcadores o dianas terapéuticas son fundamentales para mejorar los resultados en los pacientes. La proteína quinasa 5 activada por P21 (PAK5), miembro de la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógenos, ha sido implicada en diversas malignidades al regular el ciclo celular, la migración y la invasión. Sin embargo, su papel en el ESCC sigue sin estar claro. Este estudio evaluó la expresión de PAK5 en tejidos ESCC y tejidos normales adyacentes utilizando inmunohistoquímica y realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar la asociación entre PAK5 y el pronóstico. Se establecieron modelos celulares ESCC con sobreexpresión y knockdown de PAK5, y se realizaron ensayos funcionales, incluyendo CCK-8, formación de colonias y ensayos Transwell. Además, se realizó la secuenciación de ARNm para identificar objetivos posteriores y vías de señalización reguladas por PAK5. Estos resultados mostraron que la expresión de PAK5 estaba significativamente elevada en los tejidos ESCC en comparación con los tejidos normales y se asociaba con un pronóstico pobre. Los ensayos funcionales revelaron que PAK5 promovía la proliferación celular de ESCC, la formación, migración e invasión, mientras que el análisis transcriptómico destacó GAREM1 como un efector clave aguas abajo. Estos hallazgos indican que PAK5 contribuye a la progresión de la CCE y puede servir como biomarcador pronóstico y objetivo terapéutico.
A nivel mundial, el cáncer de esófago está entre las malignidades más letales. En China, el carcinoma escamoso esofágico (ESCC) representa el subtipo histológico predominante. Aunque se han logrado avances terapéuticos, el pronóstico para los pacientes con ESCC sigue siendo desalentador, manifestándose comouna tasa de supervivencia a 5 años de apenas un 10% a 25%. Esto se debe en gran parte a los desafíos de la detección precoz y a la limitada disponibilidad de terapias moleculareseficaces 2. A diferencia de otros tumores sólidos donde las terapias dirigidas han mostrado un gran potencial, estos enfoques en la ESCC aún están en pañales, obstaculizados por la escasez de objetivos moleculares accionables.
PAK5, un PAK del grupo II, integra la dinámica del citoesqueleto y la señalización pro-supervivencia y se ha relacionado con la quimiorresistencia en varias malignidades 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Dado el papel destacado de la señalización MAPK en la biología ESCC y la respuestaterapéutica 1,2,12, se hipotetizó que PAK5 está regulado al alza en ESCC y promueve fenotipos malignos mediante la modulación de la señalización MAPK, potencialmente involucrando a GAREM1 como adaptador/regulador 13,14,15,16. Se emplearon IHC cuantitativo, perturbación genética funcional y perfilado transcriptómico para probar esta hipótesis.
El manejo de la CCES suele implicar una combinación de esofagectomía, quimioterapia y radioterapia. Aunque la esofagectomía puede ser curativa, conlleva un alto riesgo demorbilidad 4,8. Además, tanto la quimioterapia como la radioterapia a menudo no eliminan todas las células cancerosas, lo que provoca resistencia, recurrencia y metástasis 8,9. La inmunoterapia se ha convertido recientemente en un enfoque destacado en oncología, demostrando eficacia en el tratamiento de cánceres avanzados. Este creciente interés pone de manifiesto la urgente necesidad de nuevos biomarcadores que puedan ayudar en el diagnóstico temprano y la planificación del tratamiento para la ESCC. Estudios previos han demostrado que otros miembros de la familia PAK, como PAK1 y PAK4, promueven la proliferación, la invasión y la resistencia a la terapia en la ESCC, lo que subraya la importancia de esta familia quinasa en la biología de la ESCC. Sin embargo, el papel de PAK5, un PAK menos estudiado del grupo II, sigue estando poco definido, lo que motiva el estudioactual 17,18.
La quinasa 5 activada por P21 (PAK5), miembro de la subfamilia PAK II, fue identificada por primera vez como una quinasa específica del cerebro en 2002. Ubicado en el cromosoma 20p12, PAK5 codifica una proteína de aproximadamente 80 kDa y se encuentra principalmente en las mitocondrias y el núcleo, donde desempeña diversos roles en la regulación celular 10,11,13. Sus funciones en las mitocondrias incluyen el metabolismo energético y la regulación, mientras que su presencia nuclear está vinculada a la transcripción génica y al control del ciclo celular. Aunque PAK5 está menos estudiada que sus homólogas, se considera crucial para el neurodesarrollo, la supervivencia celular y la progresión delcáncer 10. Cabe destacar que PAK5 ha estado implicado en la regulación del citoesqueleto, mecanismos antiapoptóticos y proliferacióncelular 12. Su regulación al alza en células neoplásicas se ha relacionado con la resistencia emergente de fármacos, lo que coincide con hallazgos que asocian la sobreexpresión de PAK5 con una mayor resistencia de células tumorales ala quimioterapia 10,11,13,14. Sin embargo, la función precisa del PAK5 en la progresión de los ESCC sigue siendo esquiva. Este estudio analiza la influencia de PAK5 en el entorno transcriptómico del ESCC y sus ramificaciones funcionales. Se realizó un perfilado transcriptómico para identificar alteraciones en la expresión génica asociadas con la actividad de PAK5 en células ESCC. Además, se generó un modelo de células ESCC con modulación controlada de PAK5 para dilucidar su papel en el crecimiento tumoral y el potencial metastásico. A diferencia de las estrategias convencionales de descubrimiento de biomarcadores en la ESCC, que se basan principalmente en Western blot o mediciones de transcritos monomodales, el flujo de trabajo actual integra inmunohistoquímica cuantitativa, perfilado transcriptómico y ensayos funcionales. Este enfoque combinado permite una validación molecular y fenotípica simultánea, proporcionando una visión mecanicista y mejorando la relevancia biológica. Además, el protocolo enfatiza la reproducibilidad experimental, utilizando muestras de tumores emparejados y tejidos adyacentes, procedimientos estandarizados de inmunotinción y entradas de ARN de alta calidad (número de integridad del ARN ≥ 7) para la secuenciación. Estas características mejoran la robustez y aplicabilidad de los ensayos en laboratorios, especialmente para estudios que buscan definir redes regulatorias impulsadas por quinasas clínicamente significativas en el ESCC.
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Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Hainan (Aprobación nº LW2022602), y se obtuvo el consentimiento informado de cada participante conforme a la Declaración de Helsinki. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Recogida de muestras de pacientes y tejidos
Se incluyeron un total de 40 pacientes con CCE patológicamente confirmada, todos con función hepática y renal normal antes de la cirugía. Se recogieron muestras tumorales (Grupo T) y tejidos normales adyacentes (Grupo N; ≥2 cm del margen tumoral) inmediatamente después de la resección quirúrgica. Los tejidos se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 7 días antes de la incrustación de parafina.
2. Tinción inmunohistoquímica
Los bloques incrustados en parafina se seccionaron a 5 μm y se hornearon a 60 °C durante 1 hora. Las secciones se desparafinizaron con sustituto de xileno, se rehidrataron mediante etanol graduado y se sometieron a la extracción de antígenos en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) a 95-98 °C durante 20 minutos. La actividad endógena de la peroxidasa se calmó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, seguida de un bloqueo con suero normal al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche (12-16 h) a 4 °C con anticuerpo primario anti-PAK5 (dilución 1:100, véase la Tabla de Materiales). Tras los lavados con PBS, las láminas se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a temperatura ambiente, se desarrollaron con DAB hasta que apareció el color (1-5 minutos, monitorizado al microscopio para evitar sobretinciones) y contra-teñidas con hematoxilina durante 30-60 s. Las secciones fueron deshidratadas, montadas e imágenes bajo un microscopio de campo brillante. La intensidad de la tinción y la proporción de células positivas se cuantificaron utilizando software de análisis de imágenes con al menos cinco campos aleatorios por sección (aumento de 200×). El método de cuantificación adoptó el cálculo de H-score, con la fórmula: H-score = ∑ (grado de intensidad de tinción × porcentaje de células positivas) (intensidad graduada como 0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderado, 3 = fuerte; porcentaje categorizado como 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Para garantizar la fiabilidad, dos patólogos independientes realizaron una puntuación a ciegas, con un acuerdo entre observadores de valor κ ≥ 0,75. Se implementaron estrictamente los criterios de control de calidad: los controles positivos (tejido ESCC conocido como PAK5 positivo) y los controles negativos (anticuerpo primario reemplazados por PBS) deben pasar la validación; la intensidad de la tinción de fondo debe estar por debajo de un umbral preestablecido (por ejemplo, H-score < 50); el coeficiente de variación (CV) de los resultados de tinción entre lotes duplicados debe ser <20% para excluir la variabilidad experimental.
3. Líneas celulares y cultivo
Las células KYSE-150 (ESCC humana) y HEK-293 (empaquetado viral) fueron autenticadas mediante perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) y se confirmó que estaban libres de micoplasma. Las células KYSE-150 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). Las células HEK-293 se mantuvieron en DMEM suplementadas con los mismos aditivos. Las células se subcultivaron usando tripsina-EDTA al 0,25% cuando alcanzaron una confluencia del 70%-80%, y se sembraron a densidades adecuadas 24 horas antes de cada experimento.
4. Construcción e infección de vectores lentivirales
Los vectores lentivirales fueron diseñados para sobreexpresar PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) o silenciar PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). Las células de HEK-293 se sembraron en platos de 10 cm y se transfectaron al 70%-80% de confluencia con el plásmido de transferencia, los plásmidos de empaquetado (gag/pol y rev) y el plásmido envolvente (VSV-G) en una proporción 4:3:1 utilizando un reactivo transfectido a base de lípidos, con una cantidad total de ADN de ~20 μg por plato de 10 cm. El medio se reemplazaba entre 6 y 8 horas después de la transfección. Los sobrenacionantes virales se recogían a las 48 y 72 horas, se centrifugaban a 500 × g durante 10 minutos para eliminar los residuos, se filtraban a través de un filtro de 0,45 μm y se concentraban o almacenaban a −80 °C. Para la transducción, las células KYSE-150 se sembraron un día antes de la infección y se expusieron a un sobrenadante viral con una multiplicidad de infección (MOI) de 5-10 en presencia de 8 μg/mL de polibreno. El MOI se definió como la proporción de unidades infecciosas respecto al número de células objetivo. Se realizó un preexperimento para estimar el MOI usando conteo de GFP o qPCR, y se seleccionó un MOI de 5-10. El medio fue reemplazado tras 12-16 horas, y se estableció una curva de muerte de puromicina tratando células no transducidas con concentraciones de puromicina que iban de 0 a 4 μg/mL durante 72-96 horas para determinar la concentración letal mínima. La concentración seleccionada para la selección fue de 1-2 μg/mL, y la concentración de mantenimiento fue de 0,5-1 μg/mL. Las células se seleccionaron con puromicina (1-2 μg/mL) a partir de 48 horas después. La sobreexpresión o silenciamiento de PAK5 fue verificada por RT-qPCR usando cebadores específicos para PAK5 (5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) y GAPDH (5′-GTGGACATCCCCGCAAAGAC-3′, 5′-AAAGGGTGTTAACGCAACTA-3′). La expresión relativa de PAK5 se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt . Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas.
5. Ensayo de viabilidad de células CCK-8
La viabilidad celular se evaluó utilizando el Kit de Conteo Celular-8 (CCK-8), que se basa en la reducción del reactivo WST-8 por deshidrogenasas celulares. Las células KYSE-150 de crecimiento logarítmico se sembraron a 2.000 células por pozo en placas de 96 pozos en un medio completo de 100 μL. A las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h, se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 (que contenía WST-8) a cada pozo. Tras la incubación a 37 °C durante 2 horas, se midió la absorbancia a 450 nm (A450) con un microlector de placas. Se incluyeron pozos en blanco que contenían solo medio. Cada grupo experimental contenía al menos tres réplicas biológicas, y cada medición se realizó con cinco réplicas técnicas.
6. Ensayo de formación de colonias
Las suspensiones de célula única de KYSE-150 se sembraron a 1.000 celdas por pozo en placas de 6 pozos y se cultivaron durante 14 días, reemplazando el medio cada 2-3 días. Las colonias se fijaron con PFA al 4% durante 15 minutos, se teñieron con violeta cristalina al 0,1% en metanol al 20% durante 15 minutos, se enjuagaron con agua y se secaron al aire. Las colonias que contenían más de 50 células se contaron utilizando software de análisis de imágenes y se calculó la tasa de formación de la colonia.
7. Ensayo de invasión de Transwell
Los insertos con poros de 8 μm se prerecubrieron con matriz de membrana basal (50 μL por inserto, dilución 1:8) y se incubaron a 37 °C durante 1 hora; Se realizó control de calidad antes de la siembra de las celdas: se instalaron insertos en blanco (sin celdas) y insertos de control negativo (sin quimioatrayente) para verificar la validez del ensayo, y la uniformidad de la capa de la matriz de membrana basal se confirmó mediante inspección visual (o medición de peso para un control más estricto). Las células fueron privadas de suero en un medio FBS al 1% durante 6-12 horas, y 2 × células 10⁵ por mL (200 μL por inserto) se sembraron en la cámara superior. La cámara inferior contenía 600 μL de medio con un 20% de FBS como quimioatractivo. Tras 24 horas de incubación, se retiraron las células no invadidas en la superficie superior, y las células invadidas en la inferior se fijaron con metanol durante 10 minutos y se teñieron con violeta cristalino al 0,1% durante 15 minutos. Las células teñidas se tomaron imágenes bajo un microscopio de campo claro y se contaron en al menos cinco campos microscópicos aleatorios por inserto (aumento de 200×); El recuento se realizó mediante un método ciego (el personal de conteo no era consciente de las asignaciones grupales) para evitar sesgos subjetivos.
8. Detección citométrica de flujo de la apoptosis
Se extrajeron células (incluidas las células flotantes), se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en un tampón de unión a 1 × 106 células/mL. Se añadieron anexina V-FITC (5 μL) y yoduro de propidio (5 μL) a 100 μL de la suspensión, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad; tras la incubación, se añadió un tampón de unión de 400 μL a cada muestra. Antes del análisis citométrico de flujo, el ajuste de compensación se realizó utilizando controles con una sola tinción (células Annexin V-FITC con una sola tinción y células PI con una sola tinción) para eliminar el desbordamiento de fluorescencia, y la compuerta FSC/SSC se configuró para seleccionar células individuales (excluyendo los restos celulares y agregados). Las muestras se analizaron en 1 hora en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm, adquiriendo al menos 10.000 eventos por muestra. Los índices apoptóticos se cuantificaron mediante software de análisis de citometría de flujo: se aplicó un umbral uniforme de gating en todas las muestras para garantizar la consistencia, y se informaron por separado las proporciones de células apoptóticas tempranas (Annexin V⁺/PI⁻) y células apoptóticas tardías (Annexin V⁺/PI⁺) para caracterizar el perfil apoptótico de cada grupo.
9. Secuenciación de ARN y análisis bioinformático
Se extrajo ARN total y se evaluó en cuanto a pureza (A260/280 entre 1,8 y 2,1) e integridad (RIN ≥7 como umbral de control de calidad). El ARNm se purificaba usando perlas oligo(dT), se fragmentaba a 94 °C durante 5-7 minutos y se transcribía inversamente en ADNc. Las bibliotecas se preparaban mediante reparación de extremos, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR (8-12 ciclos), y se secuenciaban en una plataforma Illumina para generar lecturas de extremos emparejados de 150 pb a una profundidad de 30-50 millones de pares de lectura por muestra. Las lecturas se recortaron y alinearon al genoma de referencia humano usando STAR o HISAT2. Se obtuvieron recuentos génicos con featureCounts, y se realizó análisis diferencial de expresión con DESeq2, aplicando umbrales de FDR < 0,05 y |log2 fold change| ≥ 1. El análisis de enriquecimiento funcional de genes expresados diferencialmente se realizó utilizando clusterProfiler para la Ontología Génica y las vías KEGG (con Benjamini-Hochberg (BH) corregido FDR < 0,05), y se construyeron redes de interacción proteína-proteína utilizando la base de datos STRING.
10. Análisis estadístico
Los datos continuos se expresaron como media ± de la DE de al menos tres experimentos independientes. Se realizaron comparaciones entre dos grupos con pruebas t no emparejadas de dos colas, y se realizaron comparaciones entre tres o más grupos con ANOVA unidireccional seguidas de la prueba post hoc de Tukey. Se aplicaron pruebas no paramétricas cuando era apropiado. Las distribuciones de supervivencia se estimaron mediante análisis de Kaplan-Meier con pruebas log-rank. Para los datos de RNA-seq, se realizó corrección de pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Los valores p exactos se indican en leyendas de figuras; Se consideró significación estadística en p < 0,05, con * indicando p < 0,05 y **indicando p < 0,01.
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PAK5 se expresa fuertemente en la ESCC y se asocia con un pronóstico negativo
La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo global, desde la validación clínica de PAK5 hasta el análisis funcional y transcriptómico, que identifica GAREM1 como objetivo aguas abajo. Para probar la hipótesis de que PAK5 promueve la progresión de las ESCC modulando la vía MAPK a través de GAREM1, se examinaron los patrones de expresión de PAK5 en los tejid...
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Este estudio ofrece un examen en profundidad del papel de PAK5 en la progresión del carcinoma escamoso esofágico (ESCC) mediante la combinación de muestras clínicas, ensayos funcionales y análisis transcriptómico. Estos hallazgos amplían la comprensión de la implicación de PAK5 en el ESCC, destacando su potencial tanto como marcador pronóstico como objetivo terapéutico.
La marcada sobreexpresión de PAK5 en tejidos ESCC y su asociación con una menor supervivenc...
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hainan de China (Subvención nº 822QN474).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC | Beyotime Biotecnología | C1062S | Kit de tinción para detección de apoptosis |
| Anticuerpo anti-PAK5 | Abcam | AB110069 | Anticuerpo primario para IHC, dilución 1:100 |
| Sistema automatizado de electroforesis | Agilent | Bioanalizador 2100 | Evaluación de la integridad del ARN |
| Kit de síntesis de ADNcDNA | Invitrogen | 1896649 | Kit de transcripción inversa |
| Solución violeta cristalina | Sigma-Aldrich | C3886 | Tinte para colonias e invasiones |
| Medio DMEM | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Medio de cultivo celular |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Suplemento de cultivo celular |
| Citómetro de flujo | BD Biociencias | FACSCanto II | Instrumento para el análisis celular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versión 8 | Software de análisis estadístico y gráficos |
| H& Kit de tinción E | Solarbio | G1120 | Solución de tinción de hematoxilina y eosina |
| IgG Anti-Rat conjugado con HRP | Abcam | ab150165 | Anticuerpo secundario para la IHC |
| Secuenciador Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Plataforma de secuenciación de alto rendimiento |
| Línea celular KYSE-150 | Banco de Células RIKEN | RCB2057 | Línea celular de carcinoma escamoso esofágico humano |
| Lipofectamina 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Reactivo de transfección |
| Lector de microplacas | Instrumentos Bio-Tek | ELx808 | Instrumento de medición de absorbancia |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Para la purificación de ARNm |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antibióticos para el cultivo celular |
| Yoduro de propidio (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | Tinte de ADN |
| RPMI-1640 Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Medio de cultivo celular |
| Espectrofotómetro | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | Medición de concentración y pureza de ARN |
| Software SPSS | IBM | Versión 23 | Software de análisis estadístico |
| Insertos Transwell | Corning | 3422 | Insertos de ensayo de invasión celular |
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