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Generación de organoides cutáneos planos con cabello derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido

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DOI:

10.3791/69088

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17 de octubre de 2025

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para producir organoides cutáneos que contienen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido plano y fisiológicamente relevante para replicar la arquitectura y función de la piel.

Resumen

Los organoides cutáneos (SO) derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) que contienen folículos pilosos proporcionan un modelo in vitro sofisticado para investigar las interacciones intercelulares dentro del microambiente de la piel. Inicialmente desarrollado en una configuración quística invertida, donde la dermis está expuesta al medio ambiente y la epidermis mira hacia adentro hacia el centro del organoide, los SO se pueden transferir posteriormente a una configuración plana en un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI), que se asemeja más a la fisiología de la piel humana. Este manuscrito presenta un protocolo completo para generar y seleccionar SO quísticos que pueden ser diseccionados en SO planos y desarrollados en un sistema de cultivo ALI. El protocolo incluye puntos de control definidos para la evaluación cualitativa macroscópica en etapas críticas del desarrollo de organoides, detalla los pasos técnicos necesarios para aplanar las SO quísticas en piel plana, especifica las condiciones óptimas para el cultivo de ALI y demuestra los resultados a través del análisis molecular. En el día 27, la tinción de inmunofluorescencia con marcadores específicos de linaje reveló un epitelio pigmentado pluriestratificado con apéndices cutáneos, incluidos folículos pilosos y estructuras similares a glándulas sebáceas. Este protocolo proporciona un método robusto para generar SO planos con apéndices, ofreciendo un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este sistema admite diversas aplicaciones en la investigación de la piel y ya se ha utilizado con éxito para modelar la infección por patógenos, el daño tisular inducido por la radiación ultravioleta y las respuestas a los medicamentos.

Introducción

La piel forma una barrera protectora crucial entre los organismos y su entorno, al mismo tiempo que regula la temperatura corporal, el equilibrio hídrico y la información sensorial. Está compuesto por tres capas principales: la epidermis, un epitelio estratificado de queratinocitos con una superficie cornificada; la dermis, un tejido conectivo rico en matriz extracelular, fibroblastos, nervios, vasos sanguíneos y células inmunitarias; y la hipodermis, que consiste principalmente en adipocitos subcutáneos. La función de la piel humana también depende de apéndices especializados como los folículos pilosos (HF), las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas1.

Los trastornos de la piel se encuentran entre las afecciones médicas más comunes en todo el mundo 2,3. Históricamente, la mayoría de los estudios centrados en la piel se han realizado utilizando modelos animales4, que replican la complejidad fisiológica del órgano dentro de un contexto sistémico. Sin embargo, las diferencias significativas entre especies4, junto con las crecientes preocupaciones éticas, han impulsado el desarrollo de modelos de piel humana fisiológicamente relevantes.

Los modelos convencionales de piel humana se dividen en dos categorías: epidermis humana reconstruida, que consiste en queratinocitos estratificados, y piel humana reconstruida, que además incorpora un compartimento dérmico subyacente compuesto de fibroblastos incrustados en una matriz de colágeno5. Aunque ambos tipos de modelos han avanzado significativamente en nuestra comprensión de la fisiología de la piel, carecen de la fidelidad arquitectónica completa y la diversidad celular de la piel humana nativa. Una limitación importante de estos modelos es la ausencia de apéndices cutáneos como los HF, lo que los hace inadecuados para la investigación y las pruebas de fármacos relacionados con trastornos de la piel que involucran el crecimiento y la regeneración del cabello6. Si bien se han informado sistemas más avanzados que incorporan HF, no logran recapitular completamente la complejidad de la estructura y el microambiente de HF o se basan en tecnologías complejas como la bioimpresión o el micromoldeo 7,8,9,10.

Un nuevo modelo de piel que aborda varios de estos desafíos es el organoide cutáneo (SO), generado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC)11. Imitando el desarrollo embrionario, las hiPSC se pueden dirigir hacia los linajes del ectodermo de la superficie craneal y la cresta neural craneal, autoorganizándose en estructuras quísticas que se asemejan mucho a la piel humana. Estos SO contienen casi todos los tipos de células cutáneas no inmunes, organizadas en una epidermis estratificada y una dermis rica en matriz extracelular. Es importante destacar que los SO apoyan el desarrollo de los apéndices de la piel: HF y glándulas sebáceas. Dada la escalabilidad prácticamente ilimitada de las hiPSC, las SO permiten una ingeniería genética sofisticada y el desarrollo de nuevas herramientas funcionales. Como tales, los SO representan un gran avance en el campo y son prometedores para aplicaciones en biología del desarrollo, modelado de enfermedades, pruebas de medicamentos y medicina regenerativa.

Sin embargo, sigue existiendo una limitación considerable: los SO forman estructuras quísticas invertidas en las que la epidermis se encuentra dentro del quiste dérmico, protegida de las fuerzas mecánicas y sumergida en medio acuoso. Esta configuración no solo es fisiológicamente inexacta, sino que también impide el establecimiento de la interfaz aire-líquido (ALI). Como resultado, las SO quísticas tienen una aplicación limitada para estudios que involucran la barrera epidérmica, fuerzas mecánicas o tratamientos apicales directos. Para abordar este problema, a continuación se presenta un método reproducible para aplanar mecánicamente las SO quísticas y posteriormente cultivarlas como piel plana bajo una condición ALI. Este enfoque, reportado originalmente por Jung et al., reorganiza la arquitectura tisular para que la epidermis apical quede expuesta al aire, promoviendo así una mayor estratificación y función de barrera12. Los organoides planos y pilosos resultantes conservan la compleja arquitectura de la piel humana al tiempo que reflejan la orientación fisiológicamente precisa del tejido, lo que permite el acceso experimental a la superficie apical. Aunque el procedimiento es largo (~ 100 días) e implica algunos pasos técnicamente desafiantes, particularmente cuando se diseccionan SO quísticos en SO planos, puede ser de particular interés para los investigadores que ya trabajan con SO u otros equivalentes de piel humana que desean aumentar la relevancia fisiológica de sus sistemas modelo.

Protocolo

La Figura 1 presenta el flujo de trabajo para generar SO planos utilizando un sistema de cultivo ALI. La primera sección describe la generación de SO quísticos a partir de hiPSC basadas en la metodología pionera de Karl R. Koehler11, con modificaciones menores (Figura 2). La segunda sección detalla el procedimiento para desarrollar aún más las SO quísticas en SO planas utilizando un sistema de cultivo ALI como se describió anteriormente12, con modificaciones (Figura 3). Todos los productos químicos y materiales se enumeran en la tabla de materiales. Se utilizaron tres líneas hiPSC descritas anteriormente (LUMCi001-A, LUMCi004-A y WT2) para generar SO (https://hpscreg.eu/)13.

1. Generación de SO quísticos

La Figura 2 presenta las morfologías esperadas y aberrantes en pasos clave.

  1. Agregación celular (día -2)
    1. Cultive hiPSC en una placa estándar de 6 pocillos hasta que alcancen una confluencia del 70-80%.
    2. Lave las células con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Agregue 1 ml de reactivo de disociación celular (CDR) e incube a 37 °C con 5% de CO2 durante ~6 min para aflojar las hiPSC sin separarlas de la matriz (evite la sobredigestión).
    3. Aspire la CDR y agregue 1 ml de medio de mantenimiento hiPSC (hiMM) que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK. Separe suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 y prepare una suspensión celular a 3,5 × 103 células/ml.
    4. Dispense 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja con fondo en U de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Centrifugar la placa a 110 × g durante 6 min a temperatura ambiente e incubar a 37 °C con un 5% de CO2.
  2. Dilución del inhibidor de ROCK (Día -1)
    1. Preparar hiMM que contenga 100 μg/ml de suplemento antibiótico-antimicótico (AAS).
    2. Dispense 100 μL por pocillo e incube a 37 °C con un 5% de CO2.
  3. Inducción del ectodermo superficial (Día 0)
    1. Descongele el volumen apropiado de la matriz de la membrana basal en hielo antes de continuar con el siguiente paso. Prepare medio mínimo hiPSC (hiMinM) suplementado con matriz de membrana basal (2%), BMP4 (2,5 ng/mL), SB431542 (10 μM) y bFGF (4 ng/mL) (denominado hiMinM+SFB) en hielo.
      NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración de BMP4 según la línea celular utilizada (consulte la discusión).
    2. Recoja los agregados celulares en un tubo de fondo redondo de 2 ml utilizando una punta de pipeta P200 de orificio ancho.
      NOTA: Utilice puntas de orificio ancho disponibles en el mercado. Seleccione un orificio con un diámetro interior de al menos 2 mm para minimizar el daño a los agregados. Alternativamente, caliente un bisturí con un esterilizador de bucle infrarrojo y utilícelo para crear un orificio ancho a partir de una punta de pipeta convencional.
    3. Deje que los agregados se asienten en el fondo del tubo. Aspirar con cuidado el medio y añadir 2 mL de hiMinM para lavar los áridos. Repita el lavado para un total de 3x.
    4. Transfiera los agregados celulares en frío hiMinM+SFB a un pocillo de una placa de 6 pocillos preenfriada utilizando una punta de pipeta P1000 de orificio ancho. A continuación, transfiera cada agregado en 100 μl de hiMinM+SFB a una placa de fijación ultrabaja con fondo en U de 96 pocillos utilizando una punta de pipeta P200 de orificio ancho. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
      NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico colocado debajo de una cubierta de flujo de aire laminar (LAF) para este paso.
  4. Inducción de poblaciones de células no epiteliales (Día 3)
    1. Prepare hiMinM que contenga LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/mL) y AAS (100 μg/mL). Dispense 25 μL en cada pocillo con una pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme del medio. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
  5. Suministro de nutrientes (Día 6)
    1. Preparar hiMinM que contenga AAS (100 μg/ml). Dispense 75 μL en cada pocillo con una pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme del medio. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
  6. Refresco medio (Día 8 y Día 10)
    1. Preparar hiMinM que contenga AAS (100 μg/ml). Retire con cuidado 100 μl de medio de cada pocillo con una pipeta multicanal. Dispense 100 μL de medio fresco en cada pocillo con una pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme del medio. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
  7. Transición a placas de 24 pocillos de baja adherencia (día 12)
    1. Descongele el volumen apropiado de la matriz de la membrana basal en hielo antes de continuar con el siguiente paso. Prepare el medio de maduración de organoides (OMM) utilizando medio avanzado (49% v/v), medio basal neural (49% v/v), suplemento de glutamina (1x), suplemento de B-27 menos vitamina A (0,5x), suplemento de N2 (0,5x), 2-mercaptoetanol (0,1 mM) y AAS (100 μg/mL). Prepare el volumen adecuado de OMM frío que contenga un 1% de matriz de membrana basal (OMM1%M) y manténgalo en hielo.
      NOTA: Utilice equipo de protección personal y trabaje en un área bien ventilada cuando manipule 2-mercaptoetanol.
    2. Recoja los agregados celulares en un tubo de fondo redondo de 2 ml utilizando una punta de pipeta P1000 de orificio ancho.
    3. Deje que los agregados se asienten en el fondo del tubo. Aspira con cuidado el medio. Agregue 1,5 ml de medio avanzado para lavar los agregados. Repita el lavado para un total de 3x.
    4. Transfiera los agregados celulares en OMM1%M frío a un pocillo de una placa de 6 pocillos preenfriada utilizando una punta de pipeta P1000 de orificio ancho. A continuación, transfiera cada agregado en 500 μl de OMM1%M a una placa de 24 pocillos de baja fijación utilizando una punta de pipeta P1000 de orificio ancho. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
      NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico colocado debajo de una capucha LAF para este paso.
  8. Refresco medio (Día 15)
    1. Descongele el volumen apropiado de la matriz de la membrana basal en hielo antes de continuar con el siguiente paso. Prepare el volumen adecuado de OMM1%M frío. Mantener en hielo.
    2. Con las puntas P1000, retire con cuidado 250 μL de medio de cada pocillo. Luego, agregue 250 μL de OMM1%M a cada pocillo. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 en un agitador orbital a 65 rpm.
  9. Entre el día 18 y el día 45, realice un cambio medio medio (250 μL) con OMM los lunes, miércoles y viernes.
  10. Entre el día 45 y el día 90, realice un cambio medio medio (250 μL) con OMM los lunes y miércoles y un cambio medio completo los viernes.

2. Transición de SO quísticos a SO planos

NOTA: Los SO quísticos exhiben una morfología invertida, con la epidermis mirando hacia adentro hacia el centro del organoide y la dermis en contacto con el ambiente externo. Entre el día 70 y el día 90, dependiendo de la línea celular y la eficiencia de diferenciación, la diferenciación suprabasal temprana de la epidermis está muy avanzada y se desarrollan clavijas para el cabello. Esta es la etapa en la que los SO quísticos se transfieren a un sistema de cultivo ALI para obtener tejido que se asemeja más a la piel humana nativa.

  1. Selección de SO quísticos entre el día 70 y el día 90 para la transición a SO planos
    1. Seleccione SO quísticos con un diámetro de al menos 5 mm y un contenido mínimo de subproductos (células mesenquimales que se acumulan en un polo del quiste y también pueden contener cartílago). Utilice la presencia de placodas/clavijas de cabello como indicador de calidad del desarrollo de organoides cutáneos (Figura 1A y Figura 2B).
      NOTA: Aplanar 2-4 SO planos de cada SO quístico, dependiendo de su tamaño.
  2. Preparación del inserto recubierto de colágeno (formato de 12 pocillos)
    1. Prepare una solución de NaOH (1 M) disolviendo la cantidad adecuada de gránulos de NaOH en agua destilada. Esterilizar con filtro la solución de NaOH utilizando un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,2 μm.
      NOTA: Use equipo de protección personal y trabaje en un área bien ventilada cuando manipule la solución de NaOH (1 M).
    2. En hielo, diluya la solución de colágeno tipo I a una concentración final de 2 mg / ml usando 10x PBS (hasta una concentración final de 1x), NaOH (5 mM) y agua destilada para ajustar el volumen final. Distribuya 150 μL de la solución de colágeno en cada inserto colocado en una placa estándar de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 30 min para permitir que el gel de colágeno polimerice.
  3. Aplanamiento del SO quístico (Figura 3)
    NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico colocado debajo de una campana LAF para este paso.
    1. Coloque el SO quístico seleccionado con una pequeña cantidad de medio en la tapa de una placa de Petri de 10 cm con una pipeta P1000 de orificio ancho. Extirpe cuidadosamente los subproductos del SO con un bisturí estéril. Use pinzas estériles en el lado opuesto para estabilizar el organoide durante la escisión (Figura 3A).
      NOTA: En esta etapa, el SO quístico se asemeja a un globo desinflado con dos capas de piel colocadas una encima de la otra.
    2. Extirpe aproximadamente 1 mm de los extremos del organoide adyacente a la primera incisión con un bisturí (Figura 3B, F). Despliega suavemente la capa superior de la piel con pinzas estériles (Figura 3C, G).
    3. Corta el trozo de tejido en 2-4 pedazos dependiendo del tamaño. Transfiera delicadamente cada pieza de tejido y colóquela en un inserto recubierto de colágeno con la epidermis hacia arriba, utilizando pinzas estériles (Figura 3D, H).
      NOTA: Evalúe las clavijas bajo un microscopio estereoscópico para asegurar la orientación correcta de la epidermis.
    4. Transfiera el inserto de nuevo a una placa estándar de 12 pocillos que contenga 600 μl de OMM. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 (Figura 3E).
  4. Mantenimiento de cultivos de interfaz aire-líquido a largo plazo
    1. Entre el día 1 y el día 21 después del aplanamiento, realice un cambio medio completo (600 μL) con OMM los lunes, miércoles y viernes. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 y un 95% de humedad relativa.
    2. Entre el día 21 y el día 27 después del aplanamiento, coloque la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 sin humedad para fortalecer la barrera cutánea. Realice un cambio de medio completo (800 μL) con OMM diariamente.

Resultados

La optimización y los puntos de control para la generación de SO quísticos han sido ampliamente descritos14. El método presentado aquí, por lo tanto, se centra en los puntos de control clave a evaluar durante el desarrollo de organoides quísticos (Figura 2A), la selección de aquellos adecuados para la transición a SO planos (Figura 2B) y los criterios utilizados para evaluar la calidad de los SO planos resultantes (Figura 1B-D y Figura 4).

El primer paso clave en el desarrollo de SO quísticos es la formación de un agregado celular único y denso que incorpora la mayoría de las células presentes en el pocillo en el día 0 (Figura 2A). Esto se logra mediante un manejo cuidadoso y rápido de las hiPSC, combinado con una centrifugación eficiente, lo que da como resultado una distribución homogénea de las células en el centro del pocillo (Figura 2A, Día -2). La inducción adecuada del ectodermo superficial conduce a la formación de un epitelio delgado y claro en la capa más externa del agregado en el día 3 (Figura 2A), que posteriormente se desarrolla, después de la inducción de células mesenquimales, en agregados quísticos transparentes que contienen un núcleo oscuro de células mesenquimales en el día 8. Entre el día 12 y el 20, el quiste epitelial queda cubierto por una fina capa de células mesenquimales que se acumulan en un polo del quiste (Figura 2A, día 12). La coinducción exitosa de células epiteliales y mesenquimales finalmente da como resultado un epitelio estratificado, lo que permite la formación de placodas y clavijas pilosas, que se hacen visibles entre los días 50 y 80 (Figura 2A, B). Al seleccionar SO apropiados en función de estos puntos de control de desarrollo, la variabilidad morfológica y de tamaño se puede minimizar en el momento de la transición a SO planares.

La presencia de placodas o clavijas pilosas es el criterio de inclusión principal para seleccionar SO quísticos para su posterior desarrollo en SO planares. La ausencia de placodas visibles generalmente es el resultado de un defecto en la estratificación epidérmica, que luego aparece extremadamente delgada (Figura 2B, Día 50, panel central). Para el aplanamiento, solo se utilizan quistes grandes (al menos 5 mm de diámetro) con subproductos concentrados en un polo y subproductos mínimos en general, mientras que se excluyen aquellos con subproductos no polarizados (Figura 2B).

Una vez en su configuración plana, el control de calidad primario de los SO se basa en el monitoreo macroscópico del crecimiento de HF bajo un microscopio estereoscópico. Las HF se alargan progresivamente a lo largo de los 27 días del cultivo de ALI, con glándulas sebáceas que se hacen visibles alrededor del día 14 y la pigmentación aumenta gradualmente con el tiempo (Figura 1B, C). Debido a las limitaciones espaciales impuestas por la membrana del inserto que se encuentra justo debajo del delgado gel de colágeno, solo los HF ubicados en la periferia del SO plano pueden crecer completamente, y lo hacen en una orientación paralela al inserto (Figura 1C). En particular, el tallo del cabello rara vez sobresale más allá de la superficie de la piel. Para evaluar aún más la calidad de los SO planos desarrollados, se pueden incrustar en parafina u OCT, seccionar y teñir para examinar su composición y morfología. La tinción de H&E revela que su estructura se parece mucho a la de la piel humana (Figura 4A), con un epitelio completamente estratificado y una dermis separada por una membrana basal. La tinción de inmunofluorescencia utilizando marcadores específicos para las diferentes capas epidérmicas, glándulas sebáceas y melanocitos confirma aún más la arquitectura tisular similar a la piel humana de los SO planos (Figura 1D y Figura 4B).

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Figura 1: Flujo de trabajo para generar SO planos que contienen HF a partir de hiPSC utilizando un sistema de cultivo ALI. Se muestran representaciones esquemáticas e imágenes representativas de los pasos clave. (A) Generación de SO quísticos, esencialmente como se describió anteriormente10, hasta que se formen placodas/clavijas de cabello visibles alrededor del día 80. (B) Los SO quísticos se inciden y aplanan, con el lado de la epidermis hacia arriba, en un inserto de cultivo celular recubierto de colágeno tipo I. Los cultivos de ALI se mantienen durante 21 días en condiciones húmedas, seguidos de 6 días en condiciones secas. (C) Vista de gran aumento de una región que se muestra en (B), que ilustra el crecimiento del folículo piloso, el desarrollo de la estructura similar a una glándula sebácea (puntas de flecha) y la pigmentación progresiva a lo largo del tiempo. (D) Imágenes confocales de secciones planas de SO en el día 27 después del aplanamiento, marcadas con anticuerpo de colágeno anti-tipo IV junto con rojo Nilo, que marca estructuras similares a glándulas sebáceas, o anticuerpo anti-PMEL, que tiñe los melanocitos. Los núcleos se contratiñen con DAPI. Barras de escala: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abreviaturas: SO = organoides cutáneos; HF = folículos pilosos; hiPSCs = células madre pluripotentes inducidas por humanos; ALI = interfaz aire-líquido; Col IV = colágeno tipo IV; PMEL = proteína premelanosoma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes representativas de la morfología del agregado celular en pasos clave durante la producción de SO. (A) Imágenes representativas de SO quísticos con morfologías apropiadas (paneles izquierdos) e inadecuadas (paneles medio y derecho) en diferentes etapas. En el día -2, los agregados celulares deben mostrar una distribución uniforme (panel izquierdo), mientras que el manejo inadecuado de la placa después de la centrifugación puede interrumpir la distribución celular (panel derecho). En el día 0, los agregados bien formados aparecen como grupos celulares compactos y densos (panel izquierdo), mientras que la baja viabilidad celular da como resultado la muerte celular generalizada y la pérdida de las estructuras 3D compactas (panel derecho). En el día 3, se hace visible una capa epitelial externa distinta (panel izquierdo), su ausencia puede indicar que la concentración de BMP4 necesita optimización (panel derecho). En el día 12, las células mesenquimales se acumulan en un polo y migran para envolver el quiste epitelial (panel izquierdo), mientras que la diferenciación epitelial excesiva (panel medio) o mesenquimal (panel derecho) impide la estratificación epitelial adecuada. En el día 50, las SO exhiben morfología bipolar, con piel quística en un lado y subproductos, predominantemente cartílago, en el otro (panel izquierdo). La diferenciación epitelial excesiva (panel medio) o mesenquimal (panel derecho) dificulta el desarrollo adecuado de la piel. (B) Imágenes representativas de SO quísticos con clavijas de cabello visibles alrededor del día 80. Tenga en cuenta la proporción variable de subproductos (a la izquierda de la curva discontinua) en relación con la piel. Los tres paneles más a la izquierda permiten la generación de 2-4 SO planos, mientras que el panel más a la derecha muestra un SO de calidad insuficiente para el aplanamiento. Barras de escala: 500 μm para el día -2, el día 50 y el día 80; 200 μm para el día 0, el día 3 y el día 12. Abreviatura: SO = organoide de piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Representación esquemática de los pasos técnicos para producir SO planares. Realice el aplanamiento de SO quísticos bajo un microscopio estereoscópico dentro de una campana LAF. (A) Extirpe el polo que acumula los subproductos del SO quístico con un bisturí estéril. (B) Recorte las extremidades superiores e inferiores del SO para facilitar el despliegue del tejido. (C) Corta el tejido plano en 2-4 trozos. Transfiera y aplane cada pieza, con la epidérmica hacia arriba, sobre un inserto recubierto de colágeno con pinzas estériles. (D) Coloque el inserto de cultivo que contiene el tejido aplanado en una placa estándar de 12 pocillos que contenga 600 μL de medio. (E) Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2. (F) Vista transversal esquemática del organoide de la piel representado en (B). (G) Vista transversal esquemática del organoide de la piel representado en (C). (H) Imagen de un SO plano colocado sobre un gel de colágeno tipo I vertido sobre un inserto de cultivo celular colocado en una placa de 12 pocillos que contiene 600 μL de medio. Abreviaturas: SO = organoide de la piel; LAF = flujo de aire laminar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Caracterización de SO planas derivadas de hiPSC. (A) Imágenes representativas de campo claro de SO planar teñido con H&E en los días 1 y 27 después del aplanamiento. Para el día 27, los SO planos muestran maduración de la piel con una epidermis pluriestratificada y HF que contienen estructuras similares a glándulas sebáceas (puntas de flecha). (B) Las imágenes confocales de secciones planas de SO teñidas con integrina anti-β4 y anticuerpos anti-queratina 10 o anti-loricrina muestran diferenciación suprabasal temprana (células KRT10+ ) en el día 1 y diferenciación tardía (capa LOR+ ) en el día 27. Los núcleos se contratiñen con DAPI. Barras de escala: 50 μm (A); 100 μm (B). Abreviaturas: SO = organoide de la piel; hiPSC = célula madre pluripotente inducida por humanos; H&E = hematoxilina y eosina; β4 = integrina b4; KRT10 = queratina 10; LOR = loricrin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo descrito aquí supera una limitación clave del sistema SO quístico al restaurar la orientación y el entorno del tejido nativo a través del aplanamiento del tejido y la exposición de la epidermis apical al aire. Este método preserva la complejidad celular y estructural intrínseca del organoide, promueve una organización fisiológicamente relevante y proporciona acceso directo a la superficie epidérmica pluriestratificada para su manipulación experimental.

Varios pasos en el protocolo son críticos para lograr SO planos de alta calidad, comenzando con la generación de SO quísticos de alta calidad. Los controles de calidad clave y los posibles puntos de modificación del protocolo se han descrito ampliamente antes12. Brevemente, el punto de partida debe ser cultivos de hiPSC indiferenciados bien mantenidos al 70-80% de confluencia, que muestren células compactas con una alta relación nuclear-citoplasmática. La generación de SO quísticos requiere una modulación precisa de la señalización de BMP4 durante la inducción del ectodermo superficial12. Como la sensibilidad de BMP4 puede variar entre las líneas de hiPSC, puede ser necesaria la titulación para obtener resultados óptimos. Se recomienda probar concentraciones de BMP4 entre 2,5 y 15 ng/ml, ya que no se han notificado casos exitosos fuera de este rango. La consistencia en la fuente de reactivos también es importante; Por lo tanto, las existencias a granel de un solo proveedor deben prepararse y almacenarse en las condiciones recomendadas y utilizarse antes de su fecha de vencimiento para garantizar la actividad biológica completa y minimizar la variabilidad.

La selección de SO quísticos con morfología y tamaño apropiados es crucial para un aplanamiento exitoso de SO. La maduración de las SO quísticas y, en consecuencia, la formación de clavijas y placodas capilares puede variar entre las líneas de hiPSC, por lo tanto, el momento del aplanamiento puede variar desde el día 70 hasta el día 90. Se puede considerar la adición de CHIR99021, un inhibidor de GSK3 y un agonista de señalización de WNT, en el día 3 de la formación de SO quístico, ya que se ha demostrado que aumenta el tamaño de los organoides y reduce la formación de cartílago al promover la proliferación e inhibir la migración de la cresta neural12. Aunque prometedor, no hemos observado resultados consistentes con esta modificación en nuestras culturas.

El proceso de aplanamiento requiere destreza manual y familiaridad con el tejido. En particular, durante la transferencia del fragmento de piel al inserto recubierto, se debe tener cuidado para garantizar la orientación correcta del tejido. Se recomienda verificar la orientación con pinzas finas bajo un microscopio estereoscópico y ajustar suavemente el tejido hasta que el lado apical mire hacia arriba. Cuando se colocan correctamente, las clavijas / placos para el cabello deben mirar hacia abajo. Después de la transferencia de SO planos al cultivo ALI, los HF generalmente comienzan a mostrar un crecimiento notable y pigmentación del tallo del cabello en unos pocos días.

Las principales limitaciones del modelo descrito son el tiempo y el alto nivel de mantenimiento requerido, y la inmadurez del modelo. El desarrollo de SO quísticos dotados de horquillas para el cabello toma entre 70 y 90 días y es seguido por 4 semanas de cultivo de ALI. Este cronograma extendido, combinado con un laborioso procedimiento de aplanamiento, hace que el sistema sea menos adecuado para aplicaciones de alto rendimiento, especialmente en comparación con los equivalentes de piel humana disponibles comercialmente. Si bien las optimizaciones menores pueden reducir ligeramente el tiempo de cultivo, es poco probable que se produzca una reducción sustancial. La alta diversidad celular y estructural de la piel depende de una secuencia compleja de interacciones epitelio-mesenquimales y señales mecánicas, que probablemente no puedan acelerarse mediante la adición de factores exógenos in vitro 15,16,17,18. La formación de SO quísticos y su progresión a la forma plana requieren un alto nivel de mantenimiento. Uno de los períodos más intensivos en manejo, aparte de los primeros 18 días de cultivo quístico, ocurre cuando los SO planos se mantienen en una atmósfera de baja humedad y requieren una reposición diaria del medio. Al igual que otros modelos derivados de hiPSC, los SO conservan un fenotipo similar al fetal in vitro. Además, las glándulas sudoríparas y los músculos arrector pili están en gran medida ausentes en los SOs14, probablemente debido a la falta de vascularización, células inmunes y fuerzas mecánicas como el esfuerzo cortante, el estiramiento y la fricción, todos los cuales son esenciales para una maduración adecuada 15,16,17,18,19. Algunas de estas limitaciones pueden abordarse aumentando la complejidad del modelo. El cocultivo con macrófagos autólogos derivados de hiPSC17, la integración de un sistema de perfusión9 o la aplicación de estiramiento mecánico17 pueden ayudar a promover la madurez del modelo20,21.

Cabe señalar que el formato de inserción transwell restringe en cierta medida el crecimiento descendente de las ondas decamétricas en las SO planas. Como resultado, los HF tienden a extenderse lateralmente y pueden quedar expuestos al aire. Dado que los HF normalmente están protegidos dentro de la piel in vivo, esto debe tenerse en cuenta al diseñar experimentos. Modificar el recubrimiento del inserto aplicando una capa de hidrogel más gruesa puede ayudar a mitigar este problema. Además, los tallos del cabello rara vez sobresalen más allá de la superficie de la piel en este modelo. Nuestras observaciones indican que los HF en los SO planos permanecen en la fase de crecimiento activo hasta el día 27 del cultivo de ALI. Dada la prolongada duración del anágeno en los HF humanos, esto no es del todo inesperado. Aunque la cultura a largo plazo puede eventualmente apoyar la transición de fase, esto es poco probable en ausencia de señales sistémicas. La identificación y suplementación de las señales moleculares necesarias para el ciclo folicular puede permitir la inducción artificial de las fases catágena y telógena.

En resumen, el protocolo para generar SO planas permite una amplia gama de enfoques experimentales que no son factibles o relevantes en SO quísticos. Los SO planos ya se han utilizado con éxito para modelar infecciones bacterianas11 y virales22, daño tisular inducido por radiación ultravioleta22 y respuestas farmacológicas asociadas 12,22,23. La capacidad de acceder a la superficie apical de un equivalente cutáneo complejo fisiológicamente relevante representa un avance sustancial para el campo y abre la puerta a una variedad de aplicaciones novedosas en la investigación de la piel.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a nuestros colegas del Hotel hiPSC, Centro Médico de la Universidad de Leiden, por proporcionar líneas hiPSC. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Medicina de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk apoyado por la Fundación Novo Nordisk, Dinamarca (subvención número NNF21CC0073729) a K.R. K.R. es Encargado de Investigación en el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F12 avanzadoThermo Fisher Scientific#12634010referido como medio avanzado en el texto.
ALK5, inhibidor. TGFb tipo 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, guarda a -20 y grados; C y   mantener a 4 grados; C durante un máximo de 7 días y sin expectativas;
Anticuerpo anticlonal monoclonal de rata 439-9B anti-CD104BD Biociencias#555719NA
Anticuerpo policlonal anticolágeno tipo IVMerckMillipore#Ab769NA
Anticuerpo policlonal anti-citoqueratina 10 en conejoBioleyenda#905401NA
Anticuerpo policlonal anti-loricrin rabbitBioleyenda#905101NA
Anticuerpo monoclonal de ratón anti-PMELNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
Suplemento de B-27, sin vitamina AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, guarda a -20 y grados; C 
Insertos de cultivo celularGreiner Bio-one#66564112-pozo, tamaño de poro 0,4 y micro; m; transparente (48 insertos/caja); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Colágeno Tipo ICorning#354249Mantén la solución de serie a 4 grados; C
Bisturí desechable estéril 0507 Nº 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Esencial 6 (E6) mediaThermo Fisher Scientific#A1516401denominado medio mínimo hiPSC (hiMinM)y nbsp; en el texto.
FasudilLC Labs#F-4660Una solución 1000x de stock y la guarda a -20 ºC. Una vez descongelado, mantenlo a 4 grados; C durante un máximo de 14 días y nbsp;
Disociación de células suaves  ReactivoTecnologías de células madre#100-0485NA
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific#35050038NA
Grado básico de prenio FGF-2 humanoMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, almacena a -80 °C; C y   mantener a 4 grados; C durante un máximo de 7 días y sin expectativas;
LDN 193189 dihidrocloruroTocris#6053Alicuota, fotosensible, guarda a -20 y grados; C 
Matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento matrigelCorning#354230Aliquot, guarda a -20 y grados; C y   mantener a 4 grados; C durante un máximo de 7 días y sin expectativas;
2-MercaptoetanolThermo Fisher Scientific#21985023Sustancia peligrosa, tóxica, corrosiva, irritante, peligro para la salud y medioambiental.
NaOHMerck#567530-250MGSustancia peligrosa, corrosiva e irritante. Prepara una solución de forma inmediata.
Medio neurobasalThermo Fisher Scientific#21103049denominado medio basal neural y nbsp; en el texto.
Normocin 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1En la prueba, se denomina suplemento antibiótico-antimico. Aliquot, guarda a -20 y grados; C y   mantener a 4 grados; C durante un máximo de 14 días y nbsp;
Microplaca Nunclon Sphera de 96 pozos de fondoThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 multidish de 24 pozosThermo Fisher Scientific#174930NA
Suplemento N2Thermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, almacena en -20 °C; C 
Agitador orbitalThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific#15070063NA
Proteína recombinante humana BMP4R& Sistemas D#314-BP-010Aliquot, almacena a -80 °C; C y   mantener a 4 grados; C durante un máximo de 7 días y sin expectativas;
StemFlex (SF) mediaThermo Fisher Scientific#A3349401denominado medio de mantenimiento hiPSC (hiMM) y nbsp; en el texto.
SteriMax smart - Esterilizador de bucle infrarrojoWLD-TEC#4.002.000 Opcional
PinzasMerck#T4537-1EAEstilo 5; Acero inoxidable fino, afilado como aguja, antimagnético
VitronectinaTecnologías de células madre#07180NA

Referencias

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