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Artículo de método

Análisis automatizado de imágenes de fluorescencia de C. elegans usando SegElegans

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DOI:

10.3791/69094

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10 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

En este artículo

Resumen

Aquí proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar eficazmente SegElegans, un sistema de aprendizaje profundo que desarrollamos para la segmentación automatizada de gusanos individuales en imágenes de microscopía de campo amplio, para su uso posterior en software de análisis de imágenes como ImageJ. Proporcionamos formas de utilizar el sistema tanto en línea como fuera de línea.

Resumen

La microscopía, particularmente del tipo fluorescente, es una herramienta utilizada con frecuencia en la investigación de C. elegans . Sin embargo, el análisis de los datos de los experimentos de microscopía puede ser bastante tedioso y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, la automatización es deseable. Desarrollamos SegElegans, un sistema de red neuronal convolucional basado en U-net de dos cabezas que está diseñado específicamente para la segmentación automatizada de gusanos, incluso en imágenes con un gran número de individuos que se tocan o se superponen. La primera parte de SegElegans consta de un codificador y dos decodificadores. El codificador, basado en el modelo SmaAt AT, aplica capas de convolución doble seguidas de un módulo de atención de bloque convolucional (CBAM). Ambos decodificadores utilizan LSTM convolucionales: uno realiza la segmentación semántica de las imágenes de gusanos (cuerpo, borde, fondo o superposición), mientras que el otro extrae un esqueleto lineal a lo largo de cada gusano. La segunda parte es un algoritmo de posprocesamiento que combina las salidas de los dos decodificadores y las utiliza para generar segmentaciones de instancias precisas. Estas segmentaciones se pueden enviar a ImageJ u otras herramientas de análisis de imágenes adecuadas. Aquí presentamos instrucciones sobre cómo acceder y ejecutar este sistema. Proporcionamos una implementación en línea basada en computación en la nube, así como dos métodos para usar los modelos SegElegans fuera de línea, en una máquina local, en caso de que el hardware requerido esté disponible.

Introducción

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo eucariota con amplio uso en los campos de la biología celular y molecular 1,2,3. Es un pequeño gusano nematodo que vive en el suelo (~ 1 mm para adultos de tipo salvaje) con un ciclo de vida rápido (~ tres semanas) y una gran cantidad de progenie (típicamente genéticamente idéntica al padre hermafrodita autofertilizante). A pesar de su relativa simplicidad, el animal sigue siendo un organismo multicelular complejo con tejidos y órganos definidos y distintos, que, gracias a su pequeño tamaño y transparencia, puede estudiarse in vivo sin necesidad de fijación u otros tratamientos invasivos4. La capacidad del gusano para el estudio in vivo a través de microscopía se puede amplificar aún más mediante el uso de reporteros fluorescentes, que permiten la fácil distinción de células individuales o incluso la visualización directa de orgánulos / componentes subcelulares como mitocondrias, gotas de lípidos o agregados de proteínas, y de procesos como la transducción de señales, la expresión génica, la fusión de vesículas, autofagia, potenciales de acción neuronales y musculares, etc.5,6,7,8,9,10,11. Además, el nematodo también es muy susceptible a la manipulación genética a través de la mutagénesis12, la transgénesis a través de microinyección o bombardeo de micropartículas13, la edición CRISPR14 y, lo que es más importante, cuando se trata de un cribado genético fácil y rentable, el ARNi15. Esta manipulación permite el estudio extensivo de los genes y su papel en el propio nematodo, mientras que simultáneamente, gracias a la importante homología genética que C. elegans exhibe con otros organismos modelo, hace descubrimientos fundamentales con relevancia hasta los humanos16,17. Finalmente, esta homología/conservación también hace que el gusano sea un campo de pruebas inicial ideal para fármacos y agentes químicos, lo que permite dilucidar los mecanismos de la actividad del fármaco, la identificación de posibles variaciones genéticas modificadoras de la actividad y el descubrimiento de posibles interacciones no deseadas y efectos fuera del objetivo 18,19,20.

Todas las ventajas mencionadas anteriormente han convertido a C. elegans en un modelo atractivo para los estudios de biología celular y molecular, particularmente para los científicos interesados en el monitoreo in vivo y, a menudo, en tiempo real de los procesos a través de microscopía. Dichos estudios generalmente implican una cantidad significativa de análisis de imágenes a través de software especial, siendo la opción más utilizada ImageJ 21,22,23. Una característica común del análisis a través de dicho software es la necesidad de que el usuario/investigador especifique regiones de interés (ROI) para el análisis mediante el uso de herramientas de selección. Con bastante frecuencia, cada gusano individual en una imagen se seleccionará como su propio ROI, con el objetivo de adquirir información por gusano sobre características morfológicas simples (como las dimensiones corporales) o lecturas experimentales más "avanzadas", como los niveles de expresión de un gen (medidos con un reportero fluorescente), la lectura de un reportero radiométrico, el número y tamaño de las gotas de lípidos, la formación de agregados proteicos, la morfología de los orgánulos individuales y sus redes, etc.5,8,10,24,25,26,27. Estas selecciones por gusano generalmente se realizan manualmente, ya que los métodos de selección automática que se basan en algoritmos estándar de procesamiento de imágenes generalmente no son lo suficientemente capaces de distinguir las formas y características del gusano, especialmente en imágenes de campo oscuro donde los contornos de los gusanos no son claramente visibles o en imágenes de campo claro con un número significativo de animales que se tocan y se superponen. Sin embargo, el proceso manual es lento (de 20 s a 1 min por gusano dependiendo de la precisión necesaria y la experiencia del usuario), laborioso y sujeto a sesgos y errores del usuario.

Un enfoque alternativo y mucho más poderoso para la generación de ROI individuales de C. elegans (una tarea típicamente conocida como segmentación en el campo de la visión por computadora) es automatizarlo con la ayuda de técnicas de aprendizaje profundo / redes neuronales. Las redes neuronales convolucionales basadas principalmente en las arquitecturas Mask R-CNN28 y U-net29 han producido resultados decentes en tareas de segmentación en varios sistemas de modelos biológicos 30,31,32, incluso en C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , pero ninguno ha proporcionado una solución satisfactoria al problema de generar segmentaciones de cuerpo completo que distingan correctamente a los animales individuales (segmentación de instancias) en imágenes de alta resolución con un gran número de gusanos que se tocan o se superponen. Para satisfacer esta necesidad, desarrollamos SegElegans, un modelo de aprendizaje profundo diseñado y optimizado específicamente para esta tarea40.

SegElegans se compone de dos partes principales (Figura 1). La primera parte es una red neuronal convolucional variante U-net de dos cabezas. Se compone de un bloque codificador y dos bloques decodificadores. El bloque codificador se basa en el modelo SmaAt AT41 y utiliza bloques de convolución doble para cada capa que alimenta un módulo de atención de bloques convolucionales (CBAM)42. Los dos bloques decodificadores se basan en la red convolucional de memoria a corto plazo (LSTM)43. Un decodificador es responsable de categorizar cada píxel de las imágenes como parte del cuerpo principal de un gusano, una parte del borde de un gusano, una parte del fondo o una parte de un área donde los gusanos se superponen (esto generalmente se conoce como segmentación semántica). El otro decodificador es responsable de dibujar un "esqueleto" lineal a lo largo de cada gusano. La segunda parte es un algoritmo de posprocesamiento que combina las salidas de los dos decodificadores y las utiliza para generar segmentaciones de instancias precisas. Inicialmente identifica los segmentos de superposiciones verdaderas comparando la salida de segmentación semántica con la del esqueleto. A continuación, genera la segmentación de instancias directamente para gusanos sin superposiciones o ensamblándola a partir de segmentos para superpuestos40. Estas segmentaciones se guardan como máscaras binarias, así como ROI compatibles con ImageJ.

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Protocolo

Las siguientes secciones incluyen instrucciones detalladas sobre cómo hacer un uso efectivo de SegElegans (Figura 2). Incluyen instrucciones sobre la adquisición preparatoria de imágenes (Sección 1), cómo ejecutar el modelo en línea (Sección 2) o fuera de línea (Secciones 3-5) y la importación de ROI a ImageJ u otras herramientas (Sección 6). Dado que la evaluación de imágenes a través del modelo requiere una PC con una unidad de procesamiento de gráficos (GPU) compatible con CUDA que tenga al menos 6 GB (idealmente más) de memoria de acceso aleatorio de video (VRAM), se recomienda a la mayoría de los usuarios (siempre que tengan acceso a los servicios de Google) que utilicen la versión en línea del modelo que satisface y supera estos requisitos de hardware a través de la computación en la nube (Sección 1 > Sección 2 > Sección 6). Alternativamente, los usuarios que tienen acceso a hardware adecuadamente potente y una comprensión básica del uso de la línea de comandos/terminal (o los usuarios que carecen de acceso a las opciones de computación en la nube antes mencionadas) pueden encontrar más conveniente ejecutar el modelo localmente (Sección 1 > Sección 3 > Sección 4 o 5 > Sección 6).

1. Adquisición de imágenes de muestra y guía

  1. Utilice SegElegans para adquirir segmentaciones de gusanos adultos de cualquier cepa de gusanos, independientemente de los reporteros fluorescentes que puedan o no expresar. Si los fenotipos/datos de interés se miden en imágenes de campo claro, adquiéralos normalmente utilizando un microscopio de campo amplio y un software compatible, utilizando una lente de objetivo 4x o similar.
    NOTA: SegElegans puede analizar imágenes con un amplio rango de brillo y contraste, aunque es preferible que no haya píxeles brillantes u oscuros saturados. Con respecto a las dimensiones, el sistema se ha entrenado con imágenes de 1328 x 1048, pero debe funcionar con cualquier imagen que tenga al menos un tamaño de 512x512.
  2. Si los fenotipos/datos de interés se miden en imágenes de campo oscuro (típico cuando se utilizan uno o más reporteros o colorantes fluorescentes transgénicos), adquiera imágenes de campo claro junto con los datos que se utilizarán como imágenes guía (como se explica en el paso 1.1). Asegúrese de que las imágenes guía coincidan perfectamente con las imágenes de campo oscuro de los canales de fluorescencia espacialmente y lo más cerca posible en el tiempo, idealmente utilizando las opciones de adquisición multicanal proporcionadas por el software operativo del microscopio. Guarde las imágenes de guía en una carpeta separada de las imágenes de datos de campo oscuro correspondientes, utilizando el mismo nombre para ambas.

2. Ejecutar la versión en línea de SegElegans

  1. Inicie sesión en una cuenta de Google en un navegador web. Se recomienda crear una nueva cuenta de laboratorio dedicada para este propósito.
  2. Ingrese a Google Drive (https://drive.google.com) y cargue la carpeta con las imágenes de campo claro (datos o guía). Como se mencionó anteriormente, si se utilizan imágenes guía para generar ROI para imágenes de campo oscuro, no incluya dichas imágenes de datos de campo oscuro en esta carpeta.
  3. Vaya a https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 y haga clic en el archivo SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Haga clic en el botón Abrir en Colab en la parte superior del archivo que se abre. El cuaderno / interfaz de Jupyter para SegElegans se abrirá en Google Colab.
  4. Ejecute el bloque de código 1 presionando el botón de reproducción (figure-protocol-1) debajo del título. Conceda permiso al tiempo de ejecución para ejecutar el código y observe el resultado una vez finalizada la ejecución (aparece una marca de verificación verde junto al botón de reproducción). Colab debe ejecutar automáticamente el tiempo de ejecución correcto compatible con CUDA y mostrar una tabla de salida NVIDIA-SMI. De lo contrario, fuerce el uso de un tiempo de ejecución de GPU T4 a través del menú Tiempo de ejecución > Cambiar tipo de tiempo de ejecución .
  5. Ejecute el bloque de código 2 para cargar el contenido de Google Drive en el entorno de ejecución. Acepte todos los diálogos de confirmación y otorgue todos los permisos solicitados.
  6. Ejecute los bloques de código 3 y luego 4. El bloque 3 tardará un par de minutos en finalizar, así que asegúrese de que haya aparecido la marca de verificación verde antes de continuar con el 4.
  7. Abra el icono con la pestaña de carpeta a la izquierda de la interfaz de Colab. Esto mostrará los archivos que se cargan en el motor de ejecución, incluido el contenido importado de Drive como /content/drive/MyDrive. Haga clic con el botón derecho en la carpeta con las imágenes, copie la ruta y péguela en el formulario de entrada test_images del bloque de código 5. Asegúrese de que se vea así: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Del mismo modo, especifique una ruta para la salida del análisis (por ejemplo, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Tenga en cuenta que las rutas de acceso en este entorno utilizan una barra diagonal para separar las carpetas (/).
  8. Ejecute el bloque de código 5.
  9. Especifique la extensión exacta de las imágenes que analizará el modelo en la forma proporcionada del bloque de código 6. A los efectos de esta entrada ".tif", ". TIF" y ".tiff" se tratan como extensiones diferentes.
  10. No ajuste la entrada de batch_crop_img en el bloque de código 6 si el sistema se ejecuta en el tiempo de ejecución predeterminado de la GPU T4 (que se proporciona de forma gratuita a todos los usuarios durante un número limitado de horas al día, según los niveles de uso). Redúzcalo si el tiempo de ejecución genera problemas de disponibilidad de memoria.
  11. Ejecute el bloque de código 6. Esto llevará algún tiempo, así que asegúrese de que haya aparecido la marca de verificación verde antes de continuar.
  12. Ejecute el bloque de código 7. No ajuste sus entradas para el tiempo de ejecución T4 predeterminado, pero reduzca el número de subprocesos o deshabilite directamente el procesamiento paralelo si surgen problemas de disponibilidad de memoria. Esto también llevará mucho tiempo.
  13. Acceda a Google Drive en una ventana o pestaña diferente del navegador y navegue hasta la carpeta de salida designada en 2.7.
    NOTA: En este punto, SegElegans ha concluido la evaluación inicial y el procesamiento posterior de las segmentaciones y ha creado varias subcarpetas con salidas. 0_summary resultados contienen gráficos que resumen la salida de cada imagen, con un número de índice asignado a cada gusano. 1_complete_mask contiene las máscaras binarias seleccionadas para todas las segmentaciones que el algoritmo ha decidido que son buenas para el análisis. 1_edge_small_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones que el algoritmo ha decidido rechazar porque los animales son demasiado pequeños o están parcialmente oscurecidos en el borde de la imagen. 1_overlap_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones de gusanos que exhibieron superposiciones reales y, de forma predeterminada, no se agregan a la salida seleccionada. 1_all_rois_results contiene las segmentaciones de TODOS los 3 tipos, independientemente de la curación, en el formato ImageJ (archivos zip con ROI).
  14. En este punto, elija una de las tres opciones:
    1. Utilice los ROI proporcionados en 1_all_rois_results en ImageJ y rechace los ROI no deseados después de la importación allí (consulte la sección 6 del protocolo).
    2. Acepte las buenas máscaras seleccionadas sin ninguna corrección manual (y sin la inclusión de gusanos superpuestos) (vaya a la versión 2.16).
    3. Ajuste manualmente la curación seleccionando los gusanos (incluidos los superpuestos) que se incluirán en la salida (continúe con 2.15).
  15. Para ajustar manualmente la curación, use el bloque de código 8. Examine los resultados de la conservación inicial de los gráficos de resumen de la carpeta de resultados 0_summary . Para cada imagen que necesite corrección, ingrese el nombre completo (con extensión) de la imagen de entrada original en el formulario "name_image_change" y los números de las máscaras que se mantendrán (del gráfico de resumen), separados por comas en el formulario "index_images". Ejecute el bloque de código 8. Repita este paso para cualquier otra imagen que necesite corrección.
  16. Después de la corrección o si los usuarios eligen aceptar la curación inicial sin correcciones (y sin los gusanos superpuestos), ejecute el bloque de código 9. Se creará una nueva subcarpeta en la carpeta de salidas de Google Drive llamada 2_curated_rois_results. Incluye todas las segmentaciones finales seleccionadas en formato ImageJ (archivos zip con ROI).
  17. Para volver a ejecutar el proceso para una carpeta diferente de imágenes, restablezca el tiempo de ejecución a través del menú Tiempo de ejecución > Reiniciar sesión y comience desde el principio.

3. Preparación de la versión offline de SegElegans antes del primer uso

  1. Como alternativa a la ejecución de SegElegans en línea en Colab, hay disponible una versión fuera de línea de SegElegans para los usuarios que no pueden o prefieren no utilizar los servicios de computación en la nube de Google. Esto requiere una PC (Windows o Linux) con una GPU compatible con CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) que tenga al menos 6 GB de VRAM (aunque se recomiendan 16 si está disponible y es asequible).
    NOTA: Las siguientes instrucciones en las secciones 3-5 se centran en Windows, pero el software también puede ejecutarse en sistemas basados en Linux con algunos pequeños cambios en los comandos utilizados.
  2. Descargue el instalador del kit de herramientas CUDA desde https://developer.nvidia.com/cuda-downloads siguiendo las instrucciones para obtener la versión adecuada para el dispositivo utilizado.
    NOTA: SegElegans se ha probado con las versiones 12.9 y 13.0 del kit de herramientas y CUDA Versión 11 en Windows, sin embargo, se espera que las versiones futuras conserven la compatibilidad con versiones anteriores.
    1. Instale el kit de herramientas, siguiendo las instrucciones del propio instalador. Visual Studio no es necesario.
  3. Descargue la versión adecuada del instalador de Python para el dispositivo desde https://www.python.org/downloads/. Instale Python, siguiendo las instrucciones del propio instalador y asegurándose de que python.exe se agregue a PATH.
    NOTA: SegElegans se creó y probó en Python 3.13, pero se espera que las versiones futuras conserven la compatibilidad con versiones anteriores.
  4. Vaya a https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Haga clic en el enlace Código fuente (zip) para descargar el paquete con los archivos necesarios para configurar y ejecutar SegElegans localmente.
  5. Extraiga el archivo zip. Colóquelo en una carpeta de nivel alto o incluso superior, como C:\SegElegans. El contenido del archivo zip ya viene dentro de una subcarpeta SegElegansOffline-1.
  6. Abra el símbolo del sistema de Windows (cmd.exe). Escriba el comando python -m venv "fullsegeleganspath" donde "fullsegeleganspath" es la ruta completa, entre comillas, en la subcarpeta SegElegansOffline-1 .
    NOTA: Por ejemplo, si el archivo zip se extrajo en C:\SegElegans, la ruta completa es C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 y el comando será python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . Tenga en cuenta que las rutas de este entorno utilizan una barra diagonal inversa para separar las carpetas ("\").
  7. En el símbolo del sistema, use controles estándar para navegar dentro de la carpeta SegElegansOffline-1 y ejecute el comando Scripts\activate. Debería aparecer una etiqueta (SegElegansOffline-1) antes del siguiente cursor de solicitud, lo que indica que el entorno de Python ahora está activo.
  8. Mientras se encuentra dentro del entorno activo (SegElegansOffline-1), ejecute el comando pip install -r requirements.txt . El proceso llevará algún tiempo.
  9. Ingrese y ejecute el comando python assemblenetworks.py .
    NOTA: SegElegans ya está listo para ejecutarse. Se proporcionan dos formas de lograr esto: un script rápido que proporcionará automáticamente todas las segmentaciones como ROI de ImageJ sin la opción de corregir manualmente la curación (sección 4) y un cuaderno de Jupyter Notebook local que proporcionará la opción de obtener información general y corregir la curación (sección 5). Este último enfoque se recomienda para la mayoría de los usuarios.

4. Ejecutar la versión sin conexión de SegElegans con un script rápido

  1. Abra el símbolo del sistema de Windows (cmd.exe). Como se describe en el paso 3.7, navegue hasta la carpeta de entorno SegElegans y actívela.
  2. Para usar el script rápido, mientras está en el símbolo del sistema con el entorno activo (SegElegansOffline-1) ingrese y ejecute el comando python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x donde "pathtoinputfolder" es la ruta completa, entre comillas, a la carpeta con las imágenes de campo claro (por ejemplo, "D: \ Data \ Experiment12365 \ Condition 1") y es la extensión de archivo precisa de las imágenes que los usuarios desean analizar (Ejemplo ". TIF"). Escriba el comando python SegElegansBodyQuickEval.py -h para obtener instrucciones sobre parámetros adicionales que se pueden cambiar para acelerar el procesamiento por parte del script si el dispositivo puede manejarlo.
    NOTA: La carpeta de salida en este caso se creará dentro de la carpeta de entrada (por ejemplo, para el ejemplo anterior: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). En el interior, hay una serie de subcarpetas. 0_summary resultados contienen gráficos que resumen la salida de cada imagen, con un número de índice asignado a cada gusano. 1_complete_mask contiene las máscaras binarias seleccionadas para todas las segmentaciones no superpuestas que el algoritmo ha decidido que son buenas para el análisis. 1_edge_small_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones que el algoritmo ha decidido rechazar porque los animales son demasiado pequeños o están parcialmente oscurecidos en el borde de la imagen. 1_overlap_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones de gusanos que exhibieron superposiciones reales. 1_all_rois_results contiene las segmentaciones de TODOS los 3 tipos, independientemente de la curación, en formato ImageJ (archivos zip con ROI). Dado que no hay forma de corregir manualmente la curación aquí, 2_curated_rois_results incluye de forma predeterminada todas las segmentaciones consideradas buenas por el algoritmo Y todas las segmentaciones superpuestas en el formato ImageJ (archivos zip con ROI).

5. Ejecución de la versión sin conexión de SegElegans con un cuaderno de Jupyter

  1. Abra el símbolo del sistema de Windows (cmd.exe). Como se describe en el paso 3.7, navegue hasta la carpeta de entorno SegElegans y actívela.
  2. Para usar la interfaz de Jupyter, mientras está en el símbolo del sistema con el entorno activo (SegElegansOffline-1), ingrese y ejecute el comando jupyter notebook. Esto abrirá una ventana/pestaña del navegador web con un sitio alojado localmente. En la pantalla inicial, seleccione el archivo SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Ejecute el código en el bloque de código 1 seleccionándolo (haga clic a la izquierda fuera del código real) y presionando el botón de reproducción (figure-protocol-2) en la barra de herramientas de arriba. Aparecerá un mensaje de confirmación debajo del bloque de código cuando se complete la ejecución.
  4. Ejecute el bloque de código 2. Esto generará algunos formularios de entrada en la lectura debajo del bloque de código. Rellene los formularios generados con la ruta a la carpeta de entrada con las imágenes de campo claro (Ejemplo: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), la ruta deseada para la salida del análisis (Ejemplo: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") y la extensión de archivo precisa de las imágenes que se analizarán (Ejemplo ". TIF"). Ajuste la configuración adicional proporcionada (aumente el número de subcultivos por lote a 9 o 16 y ejecute múltiples procesos paralelos de posprocesamiento) si el dispositivo es lo suficientemente capaz.
  5. Ejecute el bloque de código 3.
  6. Ejecute el bloque de código 4. Esto llevará algún tiempo, así que asegúrese de que esté completo antes de continuar.
  7. Ejecute el bloque de código 5. Nuevamente, esto llevará algún tiempo. Después de esto, navegue a la carpeta de salida designada anteriormente.
    NOTA: En este punto, SegElegans ha concluido la evaluación inicial y el procesamiento posterior de las segmentaciones y ha creado varias subcarpetas con salidas. 0_summary resultados contienen gráficos que resumen la salida de cada imagen, con un número de índice asignado a cada gusano. 1_complete_mask contiene las máscaras binarias seleccionadas para todas las segmentaciones que el algoritmo ha decidido que son buenas para el análisis. 1_edge_small_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones que el algoritmo ha decidido rechazar porque los animales son demasiado pequeños o están parcialmente oscurecidos en el borde de la imagen. 1_overlap_mask contiene máscaras binarias para todas las segmentaciones de gusanos que exhibieron superposiciones reales y, de forma predeterminada, no se agregan a la salida seleccionada. 1_all_rois_results contiene las segmentaciones de TODOS los 3 tipos, independientemente de la curación, en el formato ImageJ (archivos zip con ROI).
  8. Similar a la versión en línea de SegElegans, use cualquiera de las tres opciones que se enumeran a continuación:
    1. Utilice los ROI proporcionados en 1_all_rois_results en ImageJ y rechace los ROI no deseados después de la importación allí (consulte la sección 6 del protocolo).
    2. Acepte las buenas máscaras seleccionadas automáticamente sin ninguna corrección manual (y sin la inclusión de gusanos superpuestos) (vaya al paso 5.11).
    3. Ajuste manualmente la curación seleccionando los gusanos (incluidos los superpuestos) que se incluirán en la salida (continúe con el paso 5.9).
  9. Para ajustar manualmente la curación, use los bloques de código 6 y 7. Primero ejecute 6. Esto creará formularios de entrada en la lectura debajo del código.
  10. Examine los resultados de la selección inicial de los gráficos de resumen de la subcarpeta de resultados de 0_summary . Para cada imagen que necesite corrección, ingrese el nombre completo de la imagen de ENTRADA (con extensión) en el formulario Imagen a corregir: y los números de las máscaras que se mantendrán (del gráfico de resumen) separadas por comas en el formulario Máscaras a mantener:. Ejecute el bloque de código 7 y asegúrese de que la ejecución se haya completado. Repita este paso para cualquier otra imagen que necesite corrección.
  11. Una vez realizada la corrección de curación o si los usuarios eligen aceptar la curación inicial sin correcciones (y sin los gusanos superpuestos), ejecute el bloque de código 8. Se creará una nueva subcarpeta en la carpeta de salidas designada llamada 2_curated_rois_results. Incluye todas las segmentaciones finales seleccionadas en formato ImageJ (archivos zip con ROI).
  12. Para volver a ejecutar el proceso para una carpeta diferente de imágenes, restablezca el tiempo de ejecución a través del menú Kernel > Reiniciar kernel y Borrar salidas de todas las celdas y comience desde el principio.

6. Importar las segmentaciones a ImageJ (o alternativas)

  1. Abra una de las imágenes de datos reales en ImageJ.
  2. Abra el archivo zip correspondiente con los ROI de esa imagen. Esto cargará las selecciones en el administrador de ROI de ImageJ. Si son ROI de la salida 2_curated_rois_results , están listos para el análisis con los métodos deseados que se utilizan normalmente (preferiblemente con el uso de macros para automatizar y acelerar aún más el proceso).
  3. Si son ROI de la salida 1_all_rois_results , elimine las segmentaciones no deseadas del administrador de ROI. Selecciónelos y presione el botón Eliminar en la ventana del administrador. No presione la tecla Supr en el teclado, ya que eso elimina el contenido de la selección en la imagen.
  4. Si se necesita un software que no sea ImageJ para el análisis, lo más probable es que el formato ROI no sea compatible. En ese caso, importe segmentaciones en la forma universalmente utilizada de máscaras binarias, que se proporcionan en las carpetas 1_complete_mask y 1_overlap_mask . Consulte las instrucciones del software receptor sobre cómo realizar esa importación.

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Resultados

Siguiendo este protocolo, los investigadores deberían poder extraer segmentaciones de gusanos de alta calidad, incluso para el análisis de imágenes de fluorescencia sin bordes visibles de gusanos. Como se discutió en la sección 6 del protocolo, estas segmentaciones se pueden importar directamente a ImageJ y usarse para la medición rápida de propiedades relevantes como la intensidad de los reporteros fluorescentes (comúnmente utilizados para la cuantificación de la expresión) o el número,...

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Discusión

La metodología presentada aquí debería permitir a los usuarios analizar experimentos de microscopía de C. elegans en un período de tiempo significativamente más rápido sin pérdida de precisión. Dado que extrae segmentaciones de imágenes guía de campo claro independientemente de la fluorescencia real (como se discutió en la sección 1 del protocolo), se puede usar con cualquier cepa y para cualquier aplicación que requiera medir fenotipos por gusano. Estos pueden incluir aplicacio...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

El trabajo en el laboratorio de los autores está financiado por la Secretaría General de
Investigación e Innovación del Ministerio de Desarrollo griego, el
Unión Europea - NextGenerationEU (código del proyecto: TAEDR-0535850, Acrónimo:
BrainPrecision) en el marco de la acción "Acciones emblemáticas en
Áreas científicas interdisciplinarias con especial interés en la conexión
al Tejido Productivo", en el marco de la Estrategia Nacional de Recuperación y Resiliencia
Plan "Grecia 2.0", la Agencia Ejecutiva de Investigación de la Comisión Europea
Centro de Excelencia "CHAngeing" (GA-101087071) y la Fundación Helénica
de Investigación e Innovación (H.F.R.I.) en el marco de la "1ª Convocatoria de H.F.R.I.
Proyectos de investigación para apoyar a los miembros de la facultad y a los investigadores y al
adquisición de equipos de investigación de alto costo" (Número del proyecto:
HFRI-FM17C3- 0869, NeuroMitofagia).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ordenador con acceso a internet (ejemplo: Dell Vostro Desktop)Varios (Dell, por ejemplo) -Esto permitirá ejecutar SegElegans en línea mediante computación en la nube según se recomienda y utilizando software de análisis de imágenes como ImageJ.
Unidad de procesamiento gráfico compatible con CUDA con al menos 6 GB de VRAM (ejemplo: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Opcional)NVIDIA + varios fabricantes (por ejemplo, Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusEsto permitirá ejecutar SegElegans sin conexión en una máquina local.
se pueden encontrar aquí:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
La VRAM depende de la implementación real del chipset en una GPU por parte del fabricante.
ADVERTENCIA: Necesitarás una tarjeta CUDA costosa y potente mucho más allá de los requisitos mínimos (16+ GB de VRAM) para igualar el rendimiento logrado por la versión de computación en la nube.
Microscopio de epifluorescencia (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific y nbsp;AMAFD2000 por ejemploRecomendamos utilizar un sistema que pueda adquirir automáticamente imágenes tanto de campo claro como de uno o más canales de fluorescencia casi simultáneamente.
ImageJ (Opcional)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsRecomendamos la distribución Fiyi, disponible aquí:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC con compatibilidad con GPU NVIDIA (ejemplo: Dell Vostro Desktop) (opcional) y nbsp;Varios (Dell, por ejemplo) -Esto es necesario junto con la GPU para ejecutar SegElegans sin conexión en una máquina local.
Una GPU requerirá hardware compatible con Windows con las ranuras PCI adecuadas en la placa base, espacio para la tarjeta y una fuente de alimentación suficientemente potente.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Consulta el manuscrito para las instrucciones completas.

Referencias

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
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