El ensayo de tejido animal utiliza la detección de centelleo nuclear para determinar la actividad enzimática de la glucógeno sintasa midiendo la incorporación de glucosa radiomarcada en el glucógeno.
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Artículo de método
Evaluación radioquímica de la actividad de la enzima glucógeno sintasa en tejido animal
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Resumen
Resumen
El glucógeno es un metabolito importante para muchas células eucariotas, integral para el almacenamiento de energía y la liberación rápida de energía. La construcción de la molécula depende de la glucógeno sintasa, una enzima altamente regulada con la función principal de facilitar la unión secuencial de unidades de glucosa en un polímero de glucógeno en crecimiento. Esta enzima es activada alostéricamente por la glucosa-6-fosfato e inhibida en múltiples sitios por fosforilación. El conocimiento de la actividad enzimática de la glucógeno sintasa es un componente clave para comprender el metabolismo del glucógeno, los niveles de energía muscular y los trastornos metabólicos como la diabetes y las enfermedades de almacenamiento de glucógeno. Aquí se describe un método altamente sensible y eficaz para determinar la actividad de la glucógeno sintasa en el tejido muscular animal midiendo la cantidad de glucosa integrada, a partir de glucosa [14C]-UDP-glucosa radiomarcada, en moléculas de glucógeno. Este procedimiento utiliza 14C radiactivo y requerirá la autorización adecuada y el espacio de laboratorio para su uso y eliminación. Este procedimiento también requerirá acceso a un contador de centelleo líquido.
Introducción
El glucógeno, un polisacárido altamente ramificado compuesto de unidades de glucosa, sirve como una importante reserva de energía en varios tejidos, incluidos los músculos, el hígado yel cerebro. Su síntesis y degradación están orquestadas por un complejo sistema de enzimas especializadas y proteínas reguladoras. Vital para su biosíntesis es la enzima glucógeno sintasa (GYS), de la cual hay dos isoformas (GYS1 y GYS2). GYS1 es una enzima reguladora directamente responsable de la creación de glucógeno a partir de glucosa en células no hepáticas, mientras que GYS2 funciona en el hígado. Este proceso, conocido como glucogénesis, es la adición secuencial de una unidad individual de glucosa a una cadena de glucógeno en crecimiento. GYS cataliza la transferencia de glucosa desde la glucosa difosfato de uridina intermedia (UDP-glucosa) hasta el final de una cadena de glucógeno, creando un enlace alfa-1,4-glucosídico2. En coordinación con la enzima de ramificación de glucógeno, esta reacción extiende las moléculas de glucógeno, proporcionando un almacenamiento y liberación de energía eficientes.
Existen técnicas de ensayo para medir la actividad de la enzima, con una de las agrupaciones más comunes de métodos que consiste en los de la variedad espectrofotométrica 3,4. Estos ensayos generalmente se basan en un sistema de reacciones acopladas indirectas y miden la absorbancia del producto aguas abajo, NADH, a 340 nm. Se consume una unidad de NADH por cada unidad de UDP liberada de UDP-glucosa por la glucógeno sintasa, produciendo una excitación medible que se correlaciona directamente con la actividad de la glucógeno sintasa 5,6. Si bien los ensayos de espectrofotometría son relativamente económicos y accesibles, tienen la pequeña desventaja de depender de una reacción indirecta y las principales desventajas de la interferencia por turbidez de la muestra y menor sensibilidad, especialmente un problema para muestras más pequeñas o muestras con glucógeno sintasa poco o altamente fosforilado. Se han desarrollado ensayos fluorométricos, utilizando las reacciones acopladas descritas anteriormente, para mejorar la sensibilidad en el tejido muscular del humano7 y el ratón8. Existen otras técnicas para cuantificar la glucógeno sintasa, como la inmunotransferencia9 y la inmunohistoquímica10; sin embargo, estas técnicas solo pueden cuantificar la cantidad física de la enzima y, en el mejor de los casos, pueden inferir la actividad de la fosforilación, pero no cuantificar directamente la actividad enzimática11.
Entre estas técnicas de ensayo enzimático, los métodos radioquímicos siguen siendo los más utilizados para determinar la actividad de la glucógeno sintasa en el tejido de mamíferos debido a su falta de interferencia por la turbidez de la muestra y su alta sensibilidad 8,9. Estos ensayos incorporan glucosa radiomarcada de UDP-glucosa marcada con 14C12 o 3H13 en glucógeno, lo que permite la medición directa de la actividad enzimática durante un período de tiempo determinado. En el siguiente procedimiento, una muestra de tejido que contiene glucógeno sintasa se expone a UDP-glucosa y cebador de glucógeno. La glucógeno sintasa cataliza la reacción que se muestra en la siguiente ecuación:
UDP-[14C]glucosa + (glucógeno)n → (glucógeno)n+1[14C] + UDP
Después de un período de tiempo determinado, la reacción termina y el glucógeno que contiene glucosa radiomarcada se precipita en papel de filtro12 (como se describe a continuación) o se somete a filtración en gel como lo describen Niederwanger et al.14 y se mide con un detector de centelleo. Este método también incluye una reacción idéntica separada que incluye glucosa-6-fosfato (G6P), un activador alostérico de la glucógeno sintasa. En condiciones con niveles suficientes de G6P, la actividad de la glucógeno sintasa se activa al máximo, lo que muestra el potencial absoluto de actividad de la glucógeno sintasa de una muestra determinada. El método descrito aquí fue modificado de Suzuki y sus colegas15 a un formato de 96 pocillos y está optimizado para su uso en tejido muscular de ratón; sin embargo, el protocolo puede ser alterado para otros tejidos y especies animales.
A pesar de las consideraciones inherentes de costo y seguridad asociadas con los materiales radiactivos, los ensayos radioquímicos ofrecen ventajas significativas sobre las alternativas no radiactivas, siempre que se disponga de instrumentos. El siguiente procedimiento detalla un medio altamente sensible y robusto para determinar la actividad de la glucógeno sintasa, una enzima clave en el metabolismo del glucógeno, en el tejido muscular animal.
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ball. Cohortes masculinas y femeninas de B6; Los ratones de tipo salvaje 129-Gaatm1Rabn/J, de 3 meses de edad, se utilizan como ejemplo representativo en este manuscrito. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación previa al ensayo
- Recolectar tejido por luxación cervical16 y congelar inmediatamente en N2 líquido para preservar las reservas de glucógeno y almacenar en N2 líquido o congelador ultra bajo hasta el inicio del ensayo.
- Preparar las soluciones madre antes del inicio del ensayo de glucógeno sintasa (Tabla 1).
- Determine el número de muestras de ratón replicadas y los controles deseados para el ensayo. Cada muestra de ratón requiere cuatro réplicas totales, dos para cada reacción (presencia o ausencia de G6P) (ver Figura 1 y Tabla 2).
- Cortar el papel de cromatografía en tiras de 4 cm. El glucógeno se adhiere a este papel y permanece unido durante el proceso de lavado. Utilizando el ancho (6 mm) de una trituradora de papel, triture el papel de cromatografía en segmentos individuales delgados.
- Con un lápiz, etiquete las tiras de papel designadas con la identificación del mouse, los espacios en blanco y los totales. Evite usar tinta.
- Cargue los papeles de cromatografía en la plantilla de bloques de madera. Cada plantilla contiene hasta 12 papeles, correspondientes a una fila de una placa de 96 pocillos.
- Obtenga pinzas de papel de cromatografía (tapas de portapapeles).
- Prepare una abrazadera para cada fila de reacción sujetando los bordes de los papeles de cromatografía, dejando expuesta la mayor parte de la superficie de los papeles. Asegúrese de que los bordes etiquetados sean visibles.
- Etiquete tubos de microfuga de 1,7 ml con identificación de muestras. Dos tubos por muestra; uno para homogeneizar y otro para sobrenadante.
- Antes del inicio del ensayo, prepare las mezclas de reacción + y - G6P, consulte la Tabla 3 para obtener más información. Preparar 2.400 μl de alícuotas de cada mezcla de reacción.
2. Reacción radioquímica de actividad de la glucógeno sintasa
PRECAUCIÓN: Este paso contiene el uso de [14C]-UDP-glucosa, que es un material radiactivo. Manipular, almacenar y desechar de una manera aprobada por la Comisión Reguladora Nuclear (NRC).
- Agregue 30 μL de glucosa [14C]-UDP (0,1 μCi/μL) a 2.400 μL de alícuotas de ambas mezclas de reacción (+/- G6P) para una concentración final de 0,0012 μCi/μL. Esta receta es apta para 18 muestras.
NOTA: El volumen de glucosa [14C]-UDP se puede cambiar para conservar el uso y garantizar una sensibilidad adecuada. Por ejemplo, use 50 μL para tejido cerebral de ratón y 25 μL para corazón de ratón. - Mezclas de reacción de vórtice y alícuota de 50 μL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contendrá muestras, blancos y totales (Tabla 2). Luego, cubra con una película de plato y coloque a 4 C.
- Coloque los inhibidores de la proteasa para descongelar a temperatura ambiente. Estos inhibidores se detallan en la Tabla 4 con información adicional.
- Absorbe 30-50 mg de tejido congelado. ~ 30 mg es óptimo para muestras de músculo esquelético y corazón; ~ 50 mg para el cerebro. Mantenga el tejido y los tubos de microfuga en N2 líquido y pese rápidamente el tejido para asegurarse de que el tejido permanezca congelado. Use un mortero enfriado para moler más el tejido.
- Prepare el tampón de homogeneización con inhibidores de proteasa en hielo.
- Una muestra a la vez, mueva el tubo con tejido de N2 líquido a hielo con una tapa fría durante 1 min. Agregue una tapa fría (tapa de tubo con tres orificios pequeños enfriados en líquido N2) al tubo de muestra mientras aún está en líquido N2. Esto evita la pérdida de tejido a medida que se evapora el líquido residual N2 en el tubo. Una vez fuera de N2 líquido, las muestras deben permanecer en hielo.
- Una vez en hielo, agregue volumen (10-30 μL / mg de tejido) de tampón de homogeneización a la muestra y homogeneice la muestra con Tissue-Tearor. Después de completar estos dos pasos, pase a la siguiente muestra.
NOTA: El volumen de tampón agregado a las muestras puede optimizarse según la fuente de tejido. Por ejemplo: 30 μL / mg para el músculo esquelético, 15 μL / mg para el corazón y 10 μL / mg para el cerebro. - Centrifugar muestras durante 5 min a 4 °C a 3.600 g y transferir sobrenadante a un tubo de microfuga limpio. Tenga cuidado de no tocar el gránulo. Agite y agregue ~ 150 μL a los pocillos correspondientes en una placa de 96 pocillos con fondo en V sobre hielo. Guarde el resto para el sobrenadante para el ensayo Bradford (consulte el paso 2.15)
NOTA: Si lo desea, se pueden guardar alícuotas de muestra adicionales para ensayos posteriores, como inmunotransferencia.
PRECAUCIÓN: Los pasos 2.9 a 2.14 requieren el manejo de 14C. Deseche todos los materiales contaminados de una manera aprobada por la NRC. - Retire la placa de mezcla de reacción a 4 °C y caliente a 30 °C en el termociclador sin la película. Durante este tiempo, obtenga 1 L de etanol al 66% a -20 °C y agréguelo a un vaso de precipitados de lavado con una varilla agitadora en la placa de agitación.
- Inicie la reacción añadiendo 25 μl de sobrenadante de muestra a los pocillos de reacción y 25 μl de tampón de homogeneización a los pocillos en blanco y totales. Utilice una pipeta multicanal para añadir a 1 fila de la placa de reacción a la vez, esperando al menos 1 minuto entre filas. Registre la hora en que se inició la reacción para cada fila. Consulte la Tabla 2 para obtener más información. Utilice una pipeta multicanal y asegúrese de que se añaden volúmenes iguales de líquido.
- Deje correr de 10 a 15 minutos para que la reacción se ejecute; sin embargo, el tiempo de ejecución debe ser idéntico entre filas.
- Aspire 55 μL de cada pocillo con una pipeta multicanal y dispense sobre los respectivos papeles de cromatografía preparados previamente. Mezcle la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de la aspiración. Detecte líquido en el centro de los papeles de cromatografía.
- Retire los papeles con totales de la abrazadera con fórceps después de detectar líquido del pozo. Estos se pueden colocar en papel de aluminio de manera segura para que se sequen. Deje caer todos los demás papeles de cromatografía en el baño de etanol al 66 % de agitación. El glucógeno es insoluble en etanol al 66%, mientras que la glucosa [14C]-UDP es soluble y se lavará de los papeles de cromatografía.
- Repita los pasos 2.11 y 2.12 para cada fila de la placa de reacción. Asegúrese de que el tiempo de reacción de cada fila sea el mismo registrando los tiempos de inicio y finalización de la reacción.
- Una vez que se hayan agregado todas las filas al etanol al 66% de agitación, lavar durante 15 min.
NOTA: Durante este paso y los pasos de lavado posteriores, se pueden preparar alícuotas de muestra para ensayos complementarios, como el ensayo de Bradford, responsable de determinar el volumen total de proteína para la normalización, que es necesario para calcular la actividad enzimática. - Deseche el etanol al 66% sin perder papeles de cromatografía. Lavar con 1 L de etanol nuevo al 66% durante 30 min. Este etanol al 66% puede estar a temperatura ambiente.
- Repita el paso anterior para un total de tres lavados con etanol al 66% de 30 min.
NOTA: Si lo desea, el etanol al 66% del paso de lavado final se puede guardar y almacenar a -20 °C para ensayos posteriores. - Después de eliminar el etanol al 66%, sumerja todos los papeles de cromatografía en el vaso de precipitados de lavado en acetona. La acetona facilita el proceso de secado.
- Retire los papeles de cromatografía de la acetona y colóquelos sobre papel de aluminio. Guarde o deseche la acetona.
- Seque los papeles de cromatografía bajo una lámpara de calor durante 15 min.
NOTA: Los papeles secos pueden almacenarse indefinidamente. Los papeles pueden almacenarse de forma segura hasta que estén listos para proceder a la detección de centelleo.
3. Medición de la actividad con detección de centelleo
- Con unas pinzas, mueva los papeles de cromatografía a viales de centelleo sostenidos en bastidores de centelleo. Registre cómo están orientados los trabajos de muestra.
- Agregue 5 ml de líquido de centelleo a cada vial con la bomba de tapa. Enrosque las tapas de cada vial.
- Cargue las muestras en el detector de centelleo y cargue la rejilla de parada detrás de las muestras. Asegúrese de que el programa para monitorear 14C esté seleccionado. Inicie la detección seleccionando Recuento automático.
- Imprimir resultados
- Deseche los tubos de centelleo y el contenido de una manera aprobada por la NRC.
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Resultados
Siguiendo el protocolo, una impresión creada a partir del detector de centelleo contendrá la cantidad medida de radiación ionizante emitida por cada papel de cromatografía que contiene vial, directamente correlacionada con el nivel de actividad de la glucógeno sintasa. El detector de centelleo calculará los recuentos por minuto (CPM) de radiación detectada para cada muestra, blanco y total durante un período de tiempo determinado. Primero convierta CPM a DPM (desintegraciones por minuto)...
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Discusión
La medición de la actividad de la enzima glucógeno sintasa es una herramienta valiosa para monitorear el metabolismo del glucógeno en diversos estados metabólicos y de enfermedad. La medición en ausencia y presencia de glucosa-6-fosfato (G6P) ofrece información sobre el estado regulador de la enzima y un índice indirecto del estado de fosforilación. El ensayo de incorporación de glucosa [U-14C]-UDP es una técnica eficiente y bien documentada para medir la actividad enzimática ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada en parte por la Universidad Estatal de Ball, la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana-Muncie y Aro Biotherapeutics.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [14C] Uridina 5-difosfo-glucosa | Productos químicos radiomarcados estadounidenses | ARCO 0154 | |
| 31 Artículo de cromatografía ETCHR | Whatman | 3031 915 | |
| Hidrato de clorhidrato de benzamidina | Sigma | B6506 | |
| Beta mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| Baño seco | Torey Pines Scientific | SC25 | |
| Etanol (200 grados) | PharmcoAaper | 111000200 | |
| Ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| Ácido etilendediaminático tetraacético (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Glucosa-6-fosfato sal | Sigma | G7879 | |
| Glucógeno del hígado de conejo (Tipo III) | Sigma | G8876 | |
| Microplaca, fondo plano, 96 pozos | Greiner | 655101 | |
| Microplaca, PCR, 96 pozos | DOT Scientific | 951-PCR | |
| Contador de centelleo multiusos | Beckman Coulter | LS 6500 | |
| Dihidrato de fluoruro potásico | Sigma | 221872 | |
| Cóctel inhibidor de proteasas | GoldBio | GB-108-2 | |
| Cóctel de centelleo | Productos de Investigación Internacional | 111195 | |
| Viales de centelleo | Productos de Investigación Internacional | 125509 | |
| Fluoruro de sodio | Sigma | S7920 | |
| Desgarro tisular | Productos Biospec | Modelo 398 | |
| Tosilisina Clorometil Cetona (TLCK) | Sigma | T7254 | |
| Base de Trizma (99,9%) | Sigma | T1503 | |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma | T3253 | |
| Uridina 5-difospoglucosa | Sigma | U-4625 |
Referencias
- Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
- Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
- Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Mol Biol Rep. 39 (1), 585-591 (2012).
- Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J Vis Exp. (174), e63046(2021).
- Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. J Biol Chem. 240, 588-593 (1965).
- Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Arch Biochem Biophys. 81 (2), 508-520 (1959).
- Schalin-Jantti, C., Harkonen, M., Groop, L. C. Impaired activation of glycogen synthase in people at increased risk for developing NIDDM. Diabetes. 41 (5), 598-604 (1992).
- Huang, X., Hansson, M., Laurila, E., Ahren, B., Groop, L. Fat feeding impairs glycogen synthase activity in mice without effects on its gene expression. Metabolism. 52 (5), 535-539 (2003).
- Holt, B. D., et al. A novel CD71 Centyrin: Gys1 siRNA conjugate reduces glycogen synthesis and glycogen levels in a mouse model of Pompe disease. Mol Ther. 33 (1), 235-248 (2025).
- Prats, C., et al. Phosphorylation-dependent translocation of glycogen synthase to a novel structure during glycogen resynthesis. J Biol Chem. 280 (24), 23165-23172 (2005).
- Perezleon, J. A., Osorio-Paz, I., Francois, L., Salceda, R. Immunohistochemical localization of glycogen synthase and GSK3beta: Control of glycogen content in retina. Neurochem Res. 38 (5), 1063-1069 (2013).
- Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDP-glucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
- Parker, G. J., Lund, K. C., Taylor, R. P., McClain, D. A. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem. 278 (12), 10022-10027 (2003).
- Niederwanger, A., Kranebitter, M., Ritsch, A., Patsch, J. R., Pedrini, M. T. A gel filtration assay to determine glycogen synthase activity. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 820 (1), 143-145 (2005).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL. Mol Cell Biol. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Quick and humane sacrifice of a mouse by cervical dislocation. CSH Protoc. 2006 (1), prot4357(2006).
- Gomes, F. R., et al. Glycogen storage and muscle glucose transporters (GLUT-4) of mice selectively bred for high voluntary wheel running. J Exp Biol. 212 (Pt 2), 238-248 (2009).
- Greenberg, C. C., Jurczak, M. J., Danos, A. M., Brady, M. J. Glycogen branches out: new perspectives on the role of glycogen metabolism in the integration of metabolic pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (1), E1-E8 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).
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Reimpresiones y permisos
