Artículo de método

In Vitro Diferenciación residente de células T CD8 con memoria usando el sistema de cocultivo organoide-célula T epitelial

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 de febrero de 2026

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1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Para estudiar la diferenciación y función de las células T CD8 in vitro, se pueden aislar células T CD8 del ratón para co-cultivarse a largo plazo con organoides epiteliales vaginales infectados preformados. Aquí describimos este proceso y evaluamos la adquisición de marcadores residentes de células T de memoria tras el co-cultivo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos mucosas barrera desempeñan un papel importante en la diferenciación y función de las células T residentes. Entre las diversas poblaciones celulares de estos tejidos, las células epiteliales son factores clave para la diferenciación de las células T. Sin embargo, nuestra comprensión de las señales derivadas de epitelios que moldean la biología de las células T en ambientes mucosos sigue siendo limitada, en gran parte debido a la falta de herramientas específicas y a la complejidad de los sistemas modelo disponibles. Aquí describimos un sistema de cocultivo organoide vaginal epitelial murino con células T CD8 que modela las interacciones dinámicas entre el epitelio infectado y las células T CD8 específicas del virus. Este protocolo permite el análisis fenotípico y funcional de las respuestas de las células T dentro de un microambiente epitelial tridimensional fisiológicamente relevante. Utilizando este sistema, demostramos la diferenciación de células T efectoras CD8 en células T de memoria (TRM) residentes en el tejido. Este versátil sistema de cultivo in vitro ofrece oportunidades reduccionistas para investigar detalles moleculares de las señales epiteliales detrás de la diferenciación de células T CD8 que gobiernan la inmunidad protectora y la inmunopatología en órganos barrera.

Introducción

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Las células T de memoria residentes CD8 (TRMs) representan una población única de células T CD8 de memoria que permanecen permanentemente en los tejidos periféricos sin circular rutinariamente a través de la sangre y los tejidos linfoides. Estas células TRM están estratégicamente situadas en órganos barrera, incluyendo piel, pulmones, intestinos y el tracto reproductor, donde actúan como centinelas contra patógenos y tumoresincipientes 1,2. Tras la detección del patógeno, las células TRM CD8 liberan rápidamente gránulos citotóxicos para eliminar directamente las células infectadas mientras secretan citocinas inflamatorias que alertan a las células tisulares circundantes y reclutan efectores inmunes circulantes para contener la diseminación delpatógeno 3,4. La eficacia de los TRM CD8 en la inmunidad contra antipatógenos, así como en la inmunoterapia contra el cáncer, ya se ha demostrado 5,6. Por tanto, posicionar una gran cantidad de TRM CD8 funcionalmente competente en los tejidos mucosos barrera es un objetivo crucial para las vacunas y las estrategias inmunoterapéuticas.

La formación y el mantenimiento del TRM CD8 en órganos periféricos depende críticamente de la programación local específica del tejido. Estas señales ambientales locales incluyen citocinas únicas derivadas del tejido y agentes metabólicos, así como interacciones intercelulares que colectivamente refuerzan la identidad específica del tejidoTRM 7,8,9. Esta programación tisular permite a TRM adaptarse a las demandas específicas de los tejidos en la ejecución de sus funciones de inmunovigilancia. Sin embargo, nuestra comprensión de la naturaleza de estas interacciones es incompleta, debido a la falta de sistemas modelo robustos que capturen fielmente estos procesos. Los modelos animales pequeños, aunque muy informativos, suelen sufrir una red de interacciones altamente interconectada y compleja que dificulta estudios rápidos y de alto rendimiento en el sector.

Aquí describimos una alternativa in vitro al modelo murino que permitirá investigar los detalles moleculares de las señales derivadas de células epiteliales detrás de la diferenciación del TRM CD8. Co-cultivando organoides epiteliales vaginales preformados (VEOs) con células T CD8 activadas, generamos TRM CD8 in vitro. Una descripción detallada del proceso de activación y cocultivo de las células T CD8 permitirá una adopción más amplia de este proceso en los tejidos, lo que conducirá a una mayor comprensión de las interacciones celulares que moldean la memoria de las células T CD8 en los tejidos de primera línea.

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Protocolo

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Todos los procedimientos que involucraban animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Brown (Protocolo número 22-10-0001).

1. Configuración básica y preparación de una placa de activación

  1. Un día antes de comenzar el experimento, prepare una placa de cultivo de tejidos no tratada para sembrar con células T CD8 naïf. Preparar una solución de anticuerpos activadores en dPBS estéril a una concentración final de 1 μg/mL para anti-CD3ε (2C11) y 0,167 μg/mL para B7-1 Fc. Para una placa de 24 pozos, dispensa 600 μL de esta solución por pozo. Incuba toda la noche a 4 °C hasta que esté listo para usar.
  2. Prepara el tampón de enriquecimiento de linfocitos en dPBS estéril añadiendo un 2% de FBS despojado de carbón y 1 mM de EDTA a dPBS estéril. Guárdalos a 4 °C hasta que esté listo para usar.
  3. Prepara un tampón de lisis de glóbulos rojos de amonio-cloruro-potasio (ACK RBC) en ddH2Oañadiendo 10 mM de bicarbonato potásico, 155 mM de cloruro de amonio y 0,1 mM de EDTA. Filtra, esteriliza y déjala a temperatura ambiente.
  4. Prepara la cantidad adecuada de medio de cosecha en RPMI añadiendo un 5% de FBS despojado con carbón. Guárdalos a 4 °C hasta que esté listo para usar. Para cada ratón a recolectar, se recomienda 50 mL de medio de cosecha.
    NOTA: La penicilina/estreptomicina y la anfotericina B son opcionales, pero una concentración final de 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 0,2 μg/mL de anfotericina B puede ayudar a prevenir la contaminación bacteriana y fúngica del cultivo de células T durante el aislamiento de tejidos si esto presenta un problema.
  5. Prepara el medio de células T en RPMI añadiendo 10% de FBS despojado de carbón, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1x aminoácidos no esenciales y 1 mM de piruvato de sodio. Para una placa de 24 pozos, se utilizan 2 mL de medio de células T por pozo y 50 mL de medio de células T para una placa completa. Guárdalos a 4 °C hasta que esté listo para usar.
  6. Prepara las herramientas de disección (tijeras microdisecadoras de 0,4 mm y pinzas microdisección finas curvadas de 0,8 mm) mediante autoclav en una bolsa de esterilización o remojo en etanol al 70%.

2. Extracción y disociación de órganos linfoides secundarios de ratón adulto

  1. Enfría rápidamente una centrífuga a 4 °C con adaptadores adecuados para almacenar tubos cónicos de 15 mL.
  2. Prepara hielo para transportar tejidos y linfocitos durante los periodos de cosecha e incubación.
  3. Prepara un tubo cónico estéril de 15 mL con al menos 5 mL de medio de cosecha por ratón para diseccionar.
  4. Anestesiar y eutanasiar a un ratón transgénico adulto de células T CD8 (~8 semanas) según el protocolo institucional en una campana de flujo laminar.
  5. Sujeta las extremidades del ratón sobre una superficie limpia de espuma de poliestireno con agujas de cualquier tamaño y rocía el torso con etanol al 70% para evitar que el pelo obstruya la incisión y se pegue a las herramientas.
  6. Con tijeras microdisecadoras limpias y pinzas, haz una incisión abdominal vertical y separa la piel de la fina capa de tejido conectivo que hay debajo. Sujeta la piel sobre la superficie de la espuma de poliestireno con agujas de cualquier tamaño y corta el tejido conectivo restante para exponer los órganos dentro del torso.
  7. Localiza y extirpa cuidadosamente el bazo, eliminando el exceso de grasa con las pinzas curvas, y transfiere al tubo cónico de 15 mL que contiene el medio de cosecha. Deja el bazo sobre hielo y aísla tantos ganglios linfáticos como sea posible (por ejemplo, ilíaco e inguinal) para combinarlos con el bazo en el mismo tubo cónico sobre hielo.
    NOTA: Los ganglios linfáticos ilíacos se encuentran a ambos lados de la vena cava caudal en la región abdominal inferior bajo el tracto gastrointestinal, y los ganglios linfáticos inguinales se encuentran cerca de la ramificación de la vena epigástrica superficial a ambos lados de la piel abdominal inferior del torso. Aislar más ganglios linfáticos para mejorar el rendimiento de células T CD8 tras el enriquecimiento; sin embargo, aislar solo el bazo suele ser suficiente para proporcionar varios millones de células T CD8.
  8. Transfiere el bazo y los ganglios linfáticos a una placa marcada de 60 mm y, utilizando el extremo plano de un émbolo de jeringuilla de 3 mL, disocia mecánicamente el bazo y los ganglios linfáticos triturando el tejido hasta que no queden fragmentos grandes.
  9. Recoge la suspensión pasándola a través de un colador estéril de celda de 70 μm hacia un tubo cónico estéril nuevo de 15 mL. Lavar el plato de 60 mm con 5 mL de medio de cosecha para asegurar la transferencia completa de las células desagregadas y filtrar en el mismo tubo cónico de 15 mL.
  10. Centrifuga la suspensión a 584 × g durante 5 minutos a 4 °C. Desecha el sobrenadante y coloca el tubo en el rack pasando la parte inferior rápida y con fuerza por la rejilla de un soporte de tubo de centrifugadora para aflojar el pellet.
  11. Lisar eritrocitos resuspendiendo el pellet suelto en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos ACK. Haz el vórtice e incuba a temperatura ambiente durante 2 minutos.
  12. Después de 2 minutos, neutraliza el tampón de lisis añadiendo 2 mL de medio de cosecha. Aspirar la suspensión usando una pipeta serológica de 5 mL y filtrar a través de un filtro estéril de 70 μm de vuelta al mismo tubo cónico de 15 mL.
    NOTA: Esta filtración es importante para asegurar la eliminación de todos los grumos.
  13. Centrifuga la suspensión a 584 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 950 μL de Buffer de Enriquecimiento Linfocito.

3. Enriquecimiento y activación de células T CD8

  1. Procede a enriquecer células T CD8 naïves de linfocitos utilizando un kit de aislamiento comercial. Sigue el protocolo del fabricante.
  2. Una vez enriquecidas las células T CD8, transfiere la suspensión enriquecida a un nuevo tubo cónico estéril de 15 mL y se llena el volumen hasta 10 mL con medio de cosecha.
  3. Cuenta usando un hemocitómetro.
    NOTA: De un ratón adulto, es posible aislar al menos entre 5 y 10 millones de células T CD8 naïves con una pureza del >95%.
  4. Placar al menos 500.000 celdas en 2 mL de medio de células T por pozo de una placa de 24 pozos. Mezcla bien las células T antes de la placificación para asegurar una suspensión homogénea de célula única. Suplementar el medio de células T con una concentración final de 100 unidades/mL de IL-2, 2,5 ng/mL de IL-12 y 55 μM beta-mercaptoetanol.
  5. Retira la placa de cultivo tisular previamente recubierta con anticuerpos de los 4 °C y aspira cuidadosamente la solución de recubrimiento sin tocar el fondo de los pozos.
  6. Inmediatamente las células T de placa. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 2 días.

4. Eliminación de señales de activación y reposo de células T CD8 activadas

  1. Observa pozos activados bajo un microscopio óptico. Tras 2 días de activación, busca pequeños grupos de células T repartidas por los pozos. Los cúmulos más grandes indican una mayor activación. Si no hay racimos o pocos agrupamientos, incubar la placa a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 día más antes de continuar con el reposo.
  2. Prepara hielo para almacenar la suspensión de células T durante los periodos de incubación y cuando no se utiliza.
  3. Resuspende las células T usando una pipeta P1000 pipeteando varias veces arriba y abajo en cada esquina del pozo. Cuando las células T se hayan levantado, transfiere el contenido del pozo a un tubo cónico estéril de 50 mL y se recuenten.
    NOTA: Lavar cada pozo con 1 mL de dPBS es opcional, pero agrupar el lavado con dPBS con la suspensión de células T puede aumentar el rendimiento de las células T.
  4. Re-platéate las células T a la misma concentración que en el Paso 3.4, 250.000 células/mL a 2 mL por pozo. Preparar la cantidad adecuada de medio de células T suplementado con 100 unidades/mL de IL-2 y beta-mercaptoetanol de 55 μM.
  5. Centrifugar la suspensión a 584 × g durante 5 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el volumen adecuado de medio de células T preparado en el paso anterior para el número de pozos a placar. Mezcla bien para asegurar una suspensión homogénea de célula única.
  6. Placa 2 mL de suspensión de células T (500.000 células/pozo) en una nueva placa de cultivo de tejidos no tratada sin recubrimiento de anticuerpos. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 2 días.

5. Infectar organoides epiteliales vaginales murinos preformados con virus

NOTA: Hemos utilizado tanto el virus del Herpes Simple-2 (HSV-2) como el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) para realizar infecciones virales en los organoides. Ambos se consideran agentes de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). Realiza todos los procedimientos que involucren agentes infecciosos dentro de un gabinete de bioseguridad certificado BSL-2. Limpia las áreas de trabajo con un 70% de etanol tanto antes como después de su uso, y desecha todos los materiales según las directrices de bioseguridad institucional. Para este protocolo, establecimos VEOs a partir de células epiteliales vaginales extraídas del epitelio vaginal de ratones C57BL/6 hembras como se describió antesde 10.

  1. Las placas VEO a una densidad de 10.000 células en 20 μL de extracto de membrana basal (BME) por pozo de una placa de 24 pozos 7-10 días antes de la infección.
  2. Un día antes del cocultivo, reserva un pozo de VEOs para tripsinizar y contar y obtener una multiplicidad precisa de infección (MOI). Precalentar tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maria a 37 °C durante 5 minutos.
    NOTA: No se utilizará tripsina-EDTA al 0,25% durante la infección; solo es necesario para disociar los VEOs durante los cálculos del MOI. Recubrir plásticos (es decir, puntas de pipeta, tubos cónicos) con un 2,5% de BSA en dPBS es opcional en este paso, pero puede ayudar a reducir la pérdida de organoides y células para un conteo más preciso.
  3. Aspira los medios de cultivo celular del pozo designado y lávate con dPBS.
  4. Dispensar 600 μL de tripsina-EDTA precalentada al 0,25% en el pozo y resuspender completamente con una pipeta P1000 recubierta de BSA para alterar mecánicamente la EMB. Transfiere el contenido del pozo a un tubo cónico estéril de 15 mL recubierto con BSA.
  5. Incuba en baño María a 37 °C durante 5 minutos. Después de 5 minutos, añade 10 mL al 10% de FBS en RPMI para calmar la tripsinización.
  6. Centrifuga la suspensión a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Desechar el sobrenadante y volver a suspender usando una punta de pipeta recubierta de BSA en 100-300 μL de medio de cultivo de células T o DMEM/F12 simple.
    NOTA: El volumen depende del tamaño del pellet. Si el pellet es apenas visible, vuelve a suspender en un volumen menor.
  7. Cuenta usando un hemocitómetro. Calcular la cantidad adecuada de virus necesaria para alcanzar 0,1 MOI utilizando el título viral conocido y la densidad celular por pozo de VEOs según la siguiente ecuación:
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  8. Aspirar medios de cultivo celular de los pozos VEO para infectar y lavar con 500 μL de dPBS precalentado (37 °C). Incuba los pozos con dPBS durante 5 minutos a 37 °C.
  9. Tras 5 minutos, descarta el dPBS y añade 500 μL de medio organoide por pozo que contenga suficientes partículas virales para lograr un MOI de 0,1. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 hora con un suave giro manual de la placa de cultivo cada 20-30 minutos.
  10. Tras la incubación de 1 hora, aspirar el medio organoide viral y lavar con 500 μL de dPBS precalentado (37 °C). Aspirar dPBS y sustituir por medios organoides frescos.

6. Co-cultivar células T CD8 con organoides vaginales murinos preformados infectados por virus

  1. Antes de la co-cultura (idealmente 4-24 horas antes), transfiere la BME de -80 °C a 4 °C para el descongelamiento. Anticipar la cantidad adecuada de BME para descongelar según el diseño experimental de co-cultivo: planificar 8 μL de BME por pozo de una placa de 96 pozos y 20 μL de BME por pozo de una placa de 24 pozos.
    NOTA: La BME es viscosa, y un periodo de descongelación más largo a 4 °C reducirá la viscosidad y mejorará la maniobrabilidad.
  2. Prepara un 2,5% de BSA en dPBS y esteriliza con filtro. Utiliza esta solución de BSA para recubrir todas las superficies plásticas que entren en contacto con los VEOs (es decir, puntas de pipeta, tubos cónicos).
    NOTA: Este recubrimiento evitará que los VEOs se adhieran a la superficie de plástico y se pierdan durante el manejo.
  3. Revisa los VEOs con un microscopio óptico para ver si es tamaño y salud general. Confirma que los VEOs están entre 7 y 10 días después del cultivo y que en promedio tienen un diámetro de ~100 micras. Los VEO sanos presentan pocas o ninguna célula individual y presentan una morfología uniforme y redonda.
    NOTA: Replaciar los VEOs 1:1 en co-cultivo si se cultiva en una placa de 24 pozos y re-placar en una placa de 24 pozos (es decir, un pozo de VEOs resembrará un pozo de cocultivo célula T-organoide). Si se replacan en una placa de 96 pozos desde una placa de 24 pozos, replacan los VEO 1:2 (es decir, un pozo de VEO resembrará dos pozos de cocultivo célula T-organoide).
  4. Coloque el número necesario de placas estériles de cultivo de tejidos de 96 o 24 pozos para el cocultivo en la incubadora de 37 °C.
    NOTA: Una placa calentada acelerará la adhesión y solidificación de la BME.
  5. Prepara el medio de cultivo de células T y organoides en DMEM/F12 añadiendo suplemento al 2% de B-27, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio y 0,2 μg/mL de anfotericina B. Guarda en 4 °C hasta estar listo para usar.
  6. Aspirar medios de cultivo celular de pozos VEO y lavar cada pozo con 500 μL de dPBS estéril en frío (2-8 °C).
  7. Aspirar dPBS y añadir 200-500 μL de solución de extracción de organoides en frío (2-8 °C) (al menos 10 veces el volumen de gota organoide BME). Pipete arriba y abajo con una pipeta P200 recubierta de BSA para alterar mecánicamente el BME.
  8. Incubar la placa con suaves agitaciones (~100 rpm) sobre un agitador orbital a 4 °C durante 20 minutos. Si no hay un agitador orbital frío disponible, incuba el plato sobre hielo agitándolo manualmente cada 5 minutos. Si el BME no se ha despolimerizado tras 20 minutos, alarga el tiempo de incubación según sea necesario.
  9. Transfiere el contenido de los pozos utilizando una punta de pipeta recubierta con BSA a un tubo cónico estéril de 15 mL o 50 mL recubierto con BSA sobre hielo. Centrifuga la suspensión a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  10. Desecha el sobrenadante y lava los VEOs con 5-10 mL de dPBS frío (2-8 °C) (al menos 10 veces el volumen de gotas organoides combinadas de la BME). Centrifuga la suspensión a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  11. Desecha el dPBS y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo de células T y organoides utilizando una punta de pipeta P1000 recubierta con BSA. Deja la suspensión VEO en hielo hasta que las células T estén listas para ser co-cultivadas.
  12. Comienza a recoger las células T para co-cultivarlas. Revisa las células T en reposo con un microscopio óptico para ver si es tamaño y salud general. Sin señales activadoras, las células T ralentizarán su proliferación, pero aún así deberían haber formado algunos grupos. Confirma que no hay restos celulares ni fragmentos, y que las células T tienen una morfología agrandada. Resuspende las células T usando una pipeta P1000 pipeteando varias veces arriba y abajo en cada esquina del pozo y cuenta el número total de células T vivas CD8.
    NOTA: Por pozo de una placa de 96 pozos, se siembra 100.000 células T por cada cocultivo en 8 μL de BME. Por pozo de una placa de 24 pozos, sembra 200.000 células T para cada cocultivo en 20 μL de BME.
  13. Centrifuga la suspensión a 584 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio de cultivo de células T y organoides. Combina células T con VEOs transfiriendo un número adecuado de células T para que los pozos se vayan a colocar en el tubo cónico que contiene los VEOs.
  14. Centrifugar a 584 × g durante 5 minutos a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender los VEOs y células T en la cantidad adecuada de BME. Mezclar bien con una punta de pipeta recubierta con BSA y colocar la placa sobre una placa de cultivo de tejidos precalentada, 20 μL por pozo de una placa de 24 pozos o 8 μL por pozo de una placa de 96 pozos.
    NOTA: Mantén la BME en hielo o en un bloque de refrigeración a 4 °C durante el enchapado. Colocar las puntas de la pipeta en la nevera de 4 °C durante 30 minutos antes de emplatar puede ayudar a evitar la solidificación prematura del BME.
  15. Coloca la placa boca abajo en la incubadora a 37 °C y espera 30 minutos para que la adherencia y solidificación completa de la EMB esté completa.
  16. Durante este periodo de incubación, se prepara el medio completo de cultivo de células T y organoides añadiendo 100 ng/mL de EGF murino, 55 μM beta-mercaptoetanol y 10 unidades/mL de IL-2 murina al medio de cultivo de células T y organoides prefabricado.
  17. Tras el periodo de incubación, añadir cuidadosamente 500 μL de medio de cultivo completo de células T y organoides por pozo de una placa de 24 pozos o 250 μL de medio de cultivo completo de células T y organoides por pozo de una placa de 96 pozos. Distribuir medios contra los laterales del pozo para evitar alterar la gota de EMB. Cambia el medio cada 2 días hasta que se recolecte para análisis.

7. Recoger células T CD8 cocultivadas para análisis de citometría de flujo

  1. Una vez que las coculturas alcanzan al menos el día 7 en cultivo, se cosechan para análisis. Si las células T no expresan marcadores similares a TRM en cocultivo antes del día 7, optimiza la fecha de extracción entre el día 7 y 14, dependiendo de la adquisición fenotípica y la viabilidad de VEO y células T.
  2. Preparar un tampón de clasificación celular activada fluorescente (FACS) para la tinción y análisis por citometría de flujo añadiendo 0,2% p/v albúmina sérica bovina y 0,1% w/v de azida sódica a dPBS.
    NOTA: La azida de sodio es un químico agudamente tóxico. Seguir las recomendaciones institucionales en la gestión y eliminación de todos los residuos, cumpliendo con las normativas institucionales de bioseguridad.
  3. Prepara un cóctel de anticuerpos fluorescentes en un tampón FACS para la tinción superficial, dependiendo de qué marcadores se deseen para el análisis. Para cada pozo, debe tener en cuenta al menos 50 μL de cóctel de anticuerpos.
  4. Prepara un tinte de viabilidad fluorescente en dPBS. Para cada pozo, hay al menos 50 μL de tinte de viabilidad.
  5. Retira cuidadosamente el medio de cada pozo y resuspende completamente en un buffer FACS frío (2-8 °C), pipeteando arriba y abajo 10-20 veces para alterar mecánicamente la BME. Transfiere el contenido de cada pozo a una placa de fondo redondeado de 96 pozos etiquetada.
  6. Centrifugar a 859 × g durante 2 minutos a 4 °C. Baja la rampa de desaceleración para todos los pasos de centrifugación a partir de ahí para evitar la pérdida de muestra por la remezcla de pellets.
  7. Retira el sobrenadante invirtiendo la placa y expulsando el líquido con un solo movimiento firme hacia abajo. Resuspende en 50 μL de cóctel de anticuerpos. Pipetear arriba y abajo al menos 5 veces usando una pipeta multicanal para asegurar una resuspensión completa del pellet celular.
  8. Incubar durante 30 minutos a 4 °C o a temperatura ambiente según sea necesario, protegido de la luz. Al final del periodo de incubación, añadir 150 μL de dPBS a cada pozo utilizando una pipeta multicanal y una centrifugadora a 859 × g durante 2 minutos a 4 °C.
  9. Decanta el sobrenadante girando la placa boca abajo y lanzándola hacia abajo una vez en un movimiento continuo. Resuspende en 50 μL de tinte de viabilidad. Pipetear arriba y abajo al menos 5 veces usando una pipeta multicanal para asegurar una resuspensión completa del pellet celular.
  10. Incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final del periodo de incubación, añade 150 μL de tampón FACS a cada pozo usando una pipeta multicanal y una centrifugadora a 859 × g durante 2 minutos a 4 °C.
  11. Decantar el sobrenadante como antes y volver a suspender 150 μL de tampón FACS si las muestras se van a analizar inmediatamente en un citómetro de flujo o fijar 150 μL de paraformaldehído al 0,5% y dejarlo a 4 °C. Pipetear arriba y abajo al menos 5 veces usando una pipeta multicanal para asegurar una resuspensión completa del pellet celular. Filtrar muestras fijas para evitar obstrucciones del instrumento y hacer funcionar con un citómetro de flujo en un plazo de 12-36 horas para evitar la pérdida de fluorescencia.
    NOTA: El paraformaldehído se considera un químico peligroso. Seguir las normativas institucionales de bioseguridad en el manejo y la eliminación.

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Resultados

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Visualización microscópica de la co-cultura de organoides infectados con células T CD8
Los VEOs preformados del ratón fueron infectados con LCMV y co-cultivados con células T CD8 específicas para LCMV. También hemos realizado estos cocultivos con el modelo de infección por HSV-2 para establecer la versatilidad del protocolo, pero estamos mostrando datos microscópicos para el modelo LCMV e hemos incluido datos de diferenciación de células T en el modelo HSV-2 a continu...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los TRM CD8 dependen de señales ambientales locales para la diferenciación y el mantenimiento. Estas señales inculcan programación específica para los tejidos que permite a los TRM CD8 adaptarse a su entorno y realizar sus funciones de inmunovigilancia según sea necesario. Desafortunadamente, los TRM no sobrevivieron in vitro una vez extraídos del tejido, lo que ha limitado su análisisdetallado 12,13. En este protocolo, ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses en competencia que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la subvención R01AI177704-01A1, R21AI183017-01 de los Institutos Nacionales de Salud, la subvención semilla de la Universidad de Brown (a L.K.B.) y F31AI186444 (a Y.L.). Queremos agradecer al Dr. Dorian B. McGavern (NINDS, NIH) por proporcionar el virus de la coriomeningitis linfocítica que expresa el YFP. Agradecemos la ayuda del Dr. Sanghyun Lee y su laboratorio por la ayuda con la imagen de Citación-5 y el núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Brown para facilitar los ensayos basados en flujo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución acuosa de paraformaldehído al 16%Ciencias de la Microscopía Electrónica15710-S
Placas de cultivo de poliestireno no tratadas de múltiples pozos de 24 pozosVWR Internacional10861-558
2-MercaptoetanolGibco21985023
3 mL de jeringuillas estérilesFisher Scientific14-955-457
5 mL, y nbsp; Snap Cap,   Tubos de ensayo de poliestireno estériles y con fondo redondeadoHalcón352058
Placas de Petri de 60 mmFisher ScientificFB0875713A 
70 y mu; Filtros celulares estérilesFisher Scientific22-363-548
Microplacas de fondo redondeado de poliestireno no tratado de 96 pozosGreiner Bio-One650101
Placas de cultivo de tejido múltiple de pozo no tratadas de poliestireno de 96 pozosVWR Internacional10861-562
Albúmina bovina/fracción VQuímica TermocientíficaJ6465518
Cloruro de amonioFisher ScientificA661-500
Anfotericina B Sigma-AldrichA9528-100MG
Suplemento B-27Gibco17504044
Lector multimodo de imagen de celdas ioTek Cytation 5
DMEM/F12 1:1 MediumCytivaSH30271. FS
Solución de sal tamponada con fosfato de Dulbecco 1xCorning21031CV
Ácido etilendediaminético tetraacético (solución 0,5 M/pH 8,0)Fisher ScientificBP2482-500
Tijeras Micro Disecadoras Extra FinasRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Suero bovino fetal - Tratado con carbón vegetal/DextránR& Sistemas DS11650
Software Flowjo v10Becton, Dickinson y CompañíaFlowJo (RRID:SCR_008520)
Pinzas GraefeRoboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Solución HEPESCytivaSH30237.01
L-Glutamina (200 mM)GibcoA2916801
Magnet 5mLBioleyenda480019
Mouse CD8 Naï Kit de aislamiento de células T veBioleyenda480044
Proteína recombinante EGF del ratónGibco315091MG
Solución de aminoácidos no esenciales (100 veces)Gibco11140050
Solución de penicilina-estreptomicinaCytivaSV30010
Bicarbonato de potasioMP Biomedicina0215255780
CD3 y epsilón antiratón purificado; AnticuerpoBioleyenda100360
Ratón recombinante B7.1 (CD80)-Fc Chimera (sin portadora)Bioleyenda555406
Ratón recombinante IL-12 (p70) (sin portador)Bioleyenda577004
Ratón recombinante IL-2 (sin portador)Bioleyenda575406
Extracto de membrana basal con factor de crecimiento reducidoR& Sistemas DBME001-10
Medios RPMI 1640CytivaSH30027.LS
Azida de sodioFisher ScientificS227I-25
Piruvato de sodio (100 mM)Gibco11360070
Tripsina 0,25% proteasa con tripsina porcinaCytivaSH30042.02
Tinte de viabilidad (Rojo 780)Cytek Biosciences13-0865-T100

Referencias

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