Colección multiórgano de modelos murinos para estudios de envejecimiento

Resumen

Este protocolo proporciona un método estandarizado para la recogida de órganos en ratones jóvenes y adultos para evaluar los cambios anatómicos e histológicos relacionados con la edad en múltiples tejidos, apoyando tanto el diseño experimental ético como rentable.

Resumen

El envejecimiento es un proceso biológico sistémico y multifactorial que afecta progresivamente a casi todos los órganos y tejidos, provocando alteraciones estructurales, celulares y moleculares. Este protocolo describe un enfoque estandarizado y reproducible para evaluar los cambios anatómicos y morfológicos relacionados con la edad en ratones mediante la recogida exhaustiva de órganos para análisis histológicos y moleculares posteriores. Utilizando ratones jóvenes (2-3 meses) y de edad (20-24 meses), detallamos procedimientos paso a paso para la disección anatómica macroscópica y la extracción sistemática de órganos principales para secciones posteriores, tinción histológica y evaluación microscópica. El protocolo permite la recogida de una amplia gama de órganos y tejidos (incluyendo el cerebro, los ojos, el esófago, el timo, el corazón, la aorta, los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado, el páncreas, el estómago, el intestino delgado, el colon, el bazo, el riñón, la vejiga, la piel, el músculo esquelético, el hueso y el tejido adiposo) de un solo animal. Al maximizar el rendimiento de datos por sujeto, este flujo de trabajo apoya el uso ético de animales mediante la reducción, mejora la reproducibilidad entre estudios y facilita análisis integrativos del envejecimiento del organismo.

Introducción

El envejecimiento es un proceso sistémico que afecta a casi todos los órganos, pero la mayoría de los estudios experimentales se centran en un solo tejido, limitando la comprensión de cómo los cambios relacionados con la edad coocurren o interactúan en todo el cuerpo. El envejecimiento se manifiesta tanto en alteraciones específicas como sistémicas de tisul, incluyendo disfunción inmunitaria, cambios metabólicos, pérdida de capacidad regenerativa y degeneración^{estructural 1,2}. Aunque las investigaciones específicas de órganos han aportado valiosas perspectivas, se necesita una perspectiva más amplia para entender cómo el envejecimiento celular a través de los sistemas contribuye al declive del organismo completo. El análisis multiorgánico en modelos preclínicos in vivo, como los ratones, es esencial para identificar cambios estructurales, celulares y moleculares coordinados que contribuyen a enfermedades asociadas a la edad y a la pérdida de resiliencia fisiológica ^3,4.

El ratón de laboratorio sigue siendo un modelo preclínico esencial y bien establecido para la investigación del envejecimiento debido a su traabilidad genética, su corta esperanza de vida, sus vías de envejecimiento conservadas y su capacidad para recapitular características clave del envejecimiento humano, incluyendo la disfunción inmunitaria, la fibrosis tisular, el deterioro metabólico y el aumento de la neoplasia ^5,6,7. Sin embargo, no se utilizan ampliamente protocolos de disección multiórgano eficientes y estandarizados. Estos protocolos son necesarios para optimizar las comparaciones histológicas, reducir el uso de animales e integrar conjuntos de datos ómicos entre tejidos del mismo^{sujeto 8,9}.

Aquí presentamos un protocolo reproducible y eficiente en tiempo para la perfusión, disección y preservación multiórgano en ratones. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para la disección anatómica y la recogida de órganos principales desde ratones jóvenes (2-3 meses) y de edad (20-24 meses), incluyendo el cerebro, los ojos, el timo, el corazón, los pulmones, la aorta, los ganglios linfáticos inguinales, el tracto gastrointestinal (esófago, estómago, intestino delgado, colon), hígado, páncreas, bazo, riñones, vejiga, tejido adiposo, músculo esquelético, hueso y piel. Se incluyen instrucciones detalladas para la preservación de tejidos compatibles con los flujos de trabajo histológicos, moleculares y de criosección. Este enfoque estandarizado permite a los investigadores evaluar las características específicas y sistémicas del envejecimiento dentro de los mismos sujetos experimentales, apoyando la investigación integrada y de alta calidad sobre^{el envejecimiento} 4,10,11,12.

Protocolo

Los ratones C57BL/6J se mantuvieron en la Universidad de California, San Francisco. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) y supervisados por el Centro de Recursos para Animales de Laboratorio. Los ratones fueron alojados bajo un ciclo de 12 horas claro-oscuro, con menos de cinco ratones adultos por jaula. La eutanasia se realizó conforme a las Directrices para la Eutanasia de Animales de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA^{) 13}. Para este protocolo, se sacrificaron ratones jóvenes a los 3 meses y ratones envejecidos a los 22 meses de edad. Antes de proceder con la disección y la recogida de órganos, imprime y completa la lista de verificación de preparación (Tabla 1) y la lista de verificación para la recogida de tejidos (Tabla 2). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Dislocación cervical

NOTA: La luxación cervical debe ser realizada por una persona entrenada para minimizar el trauma excesivo en las estructuras cervicales.

1. Sujeta al ratón sujetando firmemente la base de la cola con una mano.
2. Coloca el pulgar y el índice de la mano opuesta en la base del cráneo.
3. Aplica presión firme y rápida para dislocar las vértebras cervicales. Palpar el cuello para confirmar la separación entre el cráneo y las vértebras adyacentes.
4. Confirma la eutanasia exitosa (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados) asegurando el paro respiratorio y la ausencia de respuestas a estímulos nocivos antes de proceder.
5. Registrar el peso corporal del ratón antes de la perfusión y la recogida de tejido.

2. Toracotomía y perfusión

NOTA: La perfusión es opcional. Realizar todos los procedimientos relacionados con paraformaldehído (PFA) en una campana extractora certificada de productos químicos mientras se lleva el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Deshacerse de las soluciones PFA conforme a las directrices de seguridad química de la institución. Recoge todos los residuos PFA y materiales contaminados (por ejemplo, guantes, pañuelos, contenedores) en un contenedor de residuos peligrosos claramente etiquetado y deséchalos a través de la oficina de Salud y Seguridad Ambiental de la institución, siguiendo protocolos que cumplan con las normativas locales, estatales y federales.

PRECAUCIÓN: Si se utiliza paraformaldehído (PFA) para la fijación, realiza todos los pasos bajo una campana extractora para evitar la exposición a vapores de formaldehído.

1. Coloca una tapa de poliestireno recubierto con un material absorbente para recoger el líquido de la perfusión en una bandeja de recogida. Coloca al ratón sobre esta superficie de disección en posición supina y asegura las extremidades con alfileres para estabilizar el cuerpo: las extremidades delanteras posicionadas lateralmente para abrir la cavidad torácica y las posteriores extendidas caudalmente para crear una tensión suave a lo largo de la pared abdominal.
   NOTA: Esta posición mejora la visibilidad, minimiza la obstrucción y maximiza el espacio de trabajo para la recogida de órganos.
2. Aplica etanol al 70% en la zona del pecho.
3. Utiliza tijeras afiladas para hacer una incisión transversal a nivel del diafragma, seguida de dos cortes en forma de V que se extienden para exponer la caja torácica (Figura 1A).
4. Con pinzas romas, levanta suavemente la piel y corta con cuidado cualquier fijación restante para exponer completamente la zona torácica.
5. Realizar dos incisiones en forma de V de aproximadamente 2 cm de largo a ambos lados de la caja torácica para abrir la cavidad torácica.
6. Tira del esternón y colócalo sobre el hombro del ratón junto a la cabeza.
7. Con pinzas romas, expone cuidadosamente el corazón. Elimina cualquier burbuja de aire atrapada de la línea de perfusión y luego inserta una aguja o cánula de mariposa en la punta del ventrículo izquierdo hasta una profundidad de aproximadamente 3-4 mm. Realizar una incisión de aproximadamente 5 mm de longitud en la aurícula derecha para permitir la salida del perfusado (Figura 1B).
8. Comienza la perfusión con una solución fisiológica libre de calcio y magnesio (por ejemplo, PBS, suero fisiológico o HBSS) para limpiar el sistema circulatorio.
   NOTA: La perfusión puede realizarse utilizando una jeringuilla, bomba o sistema alimentado por gravedad de 20 mL. De media, se requieren entre 15 y 20 mL de solución de perfusión por ratón para lograr una limpieza completa de sangre de la vasculatura. Una buena perfusión se indica mediante un rápido aclaramiento (blanqueamiento) del hígado y los pulmones, así como un aspecto pálido de la zona de la boca y la lengua. La perfusión completa resultará en una salida clara y libre de sangre desde el corazón.
9. Si se desea, inicia la perfusión de PFA cambiando la línea de perfusión de una solución fisiológica libre de calcio y magnesio (utilizada para el pre-lavado y la extracción de sangre) a una jeringuilla de 50 mL que contenga un 4% de paraformaldehído (PFA), manteniendo la aguja en su lugar. Ten cuidado de no introducir burbujas de aire en la línea. Continúa perfundiendo con un 4% de PFA hasta que el grado deseado de fijación se determine mediante el endurecimiento progresivo del cuerpo. Aproximadamente 30 mL de fijador son suficientes para un solo ratón.

3. Recogida de órganos y tejidos

NOTA: La secuencia de recogida de órganos es fundamental al comparar ratones jóvenes y mayores. Los órganos en animales ancianos tienden a ser frágiles y susceptibles a autólisis o daños mecánicos, por lo que es esencial un manejo rápido y constante de los tejidos. Estandarizar el orden de la recogida minimiza la variabilidad post mortem, reduce la manipulación de artefactos y garantiza una calidad de fijación uniforme entre los^{animales 14,15}. La consistencia es vital para detectar cambios morfológicos sutiles relacionados con la edad, ya que un muestreo tardío o inconsistente puede introducir sesgos. Si no se ha realizado perfusión de PFA, los órganos deben extraerse rápidamente. El páncreas, el estómago, los pulmones y el cerebro son especialmente propensos a una rápida autólisis y degradación histológica si no se procesan de inmediato. Dado que los ratones mayores suelen desarrollar lesiones neoplásicas, examina cuidadosamente el bazo, el hígado, los ganglios linfáticos, los pulmones y el timo en busca de asimetría, agrandamiento, nódulos o decoloración. Registrar estos hallazgos como parte de la carga total de la enfermedad (véase la Tabla 2).

1. Comienza con el animal en posición supina tras la perfusión o luxación cervical para recoger los órganos principales de las cavidades torácica y abdominal (Figura 1C).
2. Aplica suavemente etanol al 70% usando gasa o un pulverizador después de sujetar, lo que minimiza la contaminación del pelo y mantiene la hidratación de los tejidos en zonas sensibles. Este método ha demostrado ser eficaz en nuestras manos para reducir los restos de pelo y mejorar la visibilidad durante la disección, evitando los inconvenientes de la inmersión total.
3. Con tijeras y pinzas romas, abre cuidadosamente la cavidad abdominal realizando una incisión en la línea media desde el diafragma hasta la pelvis, seguida de dos incisiones laterales como indican las líneas rojas en la Figura 1A. Tira de la piel y la pared abdominal para exponer completamente los órganos internos.
4. Estómago, intestino delgado y colon: Desprenden el estómago en la unión esofágica dejando el extremo pilórico continuo con el intestino delgado. Libera suavemente el tracto gastrointestinal seccionando los ligamentos de soporte y luego extiende el tracto, incluyendo el intestino delgado y el colon. Corta distalmente en el recto.
   1. Para eliminar el contenido luminal, seccionar el intestino delgado proximalmente en la flexión duodenojejunal y distalmente en la unión ileocecal. Para el colon, secciona proximalmente en el ceco. Enjuaga el intestino delgado y el colon con aproximadamente 20 mL de solución fisiológica usando una jeringuilla equipada con una aguja de alimentación, asegurando suavemente el tejido con pinzas de punta fina para evitar daños.
5. Esófago: Aísla el esófago desde el cuello cervical hasta la unión gástrica.
6. Bazo y páncreas: Aisla el bazo y el páncreas de los tejidos circundantes mediante disección fina, minimizando el daño mecánico. Desconecta cuidadosamente el páncreas del bazo. Diseca y recorta inmediatamente el páncreas en pequeños trozos (≤5 mm) y sumérjalos en un fijador en los 5 minutos posteriores a la eutanasia para minimizar la autólisis y preservar la morfología tisular óptima. Inspecciona el bazo, anotando tamaño, color, forma y la presencia de cualquier anomalía visible.
7. Hígado: Usando pinzas de punta fina, agarra el tejido conectivo central entre los lóbulos hepáticos y tira suavemente hacia arriba para crear tensión. Con tijeras de disección, corta cuidadosamente todas las conexiones entre el hígado y los órganos adyacentes. Inspecciona el hígado para detectar color, consistencia y presencia de nódulos u otras anomalías.
8. Grasa visceral: Recoge muestras de depósitos viscerales de adiposo.
   NOTA: Los animales jóvenes suelen tener una grasa visceral mínima, mientras que los animales mayores suelen mostrar una mayor acumulación de grasa, especialmente en los intestinos, riñones y regiones gonadiales.
9. Riñones y vejiga: Extirpa ambos riñones junto con los uréteres y vejiga adheridos. Desconecta cuidadosamente los riñones del tejido adiposo circundante y de las estructuras conectivas usando tijeras finas o pinzas romas. Sigue los uréteres distalmente hasta la vejiga, cortando cualquier unión restante para aislar todo el tracto urinario. Inspecciona los riñones y la vejiga para detectar tamaño, color y anomalías antes de continuar el proceso.
10. Ganglios linfáticos: Retrae la piel del peritoneo para exponer la región inguinal. Identifica los ganglios linfáticos dentro de la almohadilla grasa mamaria a lo largo de los vasos linfáticos. Aisla y elimina los ganglios con pinzas de punta fina, minimizando la alteración de la grasa y el tejido conectivo circundante.
11. Corazón: Retira cuidadosamente el corazón cortando los vasos principales.
12. Timo: Elimina cuidadosamente el timo para preservar su estructura. Ten en cuenta que el timo sufre involución con la edad, y en ratones envejecidos solo puede haber tejido tímico mínimo o nulo.
13. Pulmones: Con tijeras afiladas y pinzas de punta fina, retira cuidadosamente los pulmones junto con la tráquea unida en una sola pieza.
14. Aorta: Insertar pinzas cerradas entre la aorta y la columna y desalojar suavemente la aorta, separándola a lo largo de la parte dorsal. Ten cuidado de no romper el vaso. Utilizando pinzas de punta fina, retira cuidadosamente el tejido adiposo y conectivo circundante de la aorta bajo un microscopio de disección.
15. Músculo esquelético: Resecar la piel sobre las extremidades traseras para exponer el fémur y la musculatura circundante. Con tijeras finas, aísla cuidadosamente los músculos unidos al fémur separándolos del tejido conectivo circundante y seccionando las inserciones de los tendones para preservar la integridad de las fibras.
16. Hueso (Tibia): Con tijeras de disección, reseca la piel y el músculo que están encima para exponer la tibia. Con tijeras de disección y pinzas romas, desconecta cuidadosamente la tibia en las articulaciones de la rodilla y el tobillo. Elimina cualquier tejido blando que quede sin dañar el hueso.
17. Ojos: Con tijeras grandes de disección, decapita al ratón. Retira cuidadosamente los ojos usando pinzas de punta fina.
18. Cerebro: Reseca el cuero cabelludo para exponer la parte anterior del cráneo. Con tijeras afiladas o un bisturí, sigue las suturas craneales y levanta los segmentos óseos para exponer el cerebro (Figura 1D). Corta los bulbos olfativos y las conexiones ventrales. Extrae suavemente el cerebro de la cavidad craneal. Procesa el tejido inmediatamente para mantener la morfología.
19. Piel: Si es necesario depilar para aplicaciones posteriores, elimina el vello con un recortador eléctrico. Pellizca una porción de la piel de la espalda con pinzas romas, extisa con tijeras y recoge el tejido para su procesamiento posterior.
20. Tras retirar todos los órganos de interés, colocar toda la carcasa del ratón en un recipiente de 450 mL prellenado con PFA al 4% para archivar en caso de hallazgos inesperados o responder a las preguntas de los revisores que puedan requerir volver al tejido fijo húmedo.

4. Preservación y procesamiento de tejidos

NOTA: Para preservar la integridad del tejido, minimiza el tiempo entre la disección y la conservación. Los retrasos pueden comprometer la morfología y la calidad molecular del tejido; más detalles sobre el momento crítico de la recogida y preservación de tejidos se muestran en la Tabla 2.

PRECAUCIÓN: Si se utiliza paraformaldehído (PFA) para la fijación, realiza todos los pasos dentro de una campana extractora para evitar la exposición a vapores de formaldehído.

1. Procesar los tejidos inmediatamente después de la disección, seleccionando el protocolo adecuado (paso 4.1, 4.2 o 4.3) según la aplicación posterior prevista.
   1. Fijación de paraformaldehído (PFA): Colocar tejidos destinados al análisis histológico en un 4% de PFA a 4 °C durante 12-24 horas. Tras la fijación, lava los tejidos a fondo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el fijador residual, y luego transfiere a etanol al 70% para su almacenamiento hasta que la parafina se incruste y seccione.
2. Incrustación de compuestos a temperatura óptima de corte (OCT): Incrustar tejidos frescos en el compuesto OCT. Coloca los tejidos en moldes de incrustación llenos de compuesto OCT, eliminando burbujas de aire, incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego congela en fase de vapor de nitrógeno líquido. Sella con papel de aluminio y guarda los bloques OCT a −80 °C hasta la sección.
3. Congelación rápida en fase de vapor de nitrógeno líquido: Tejidos de congelación rápida destinados al análisis de ARN, proteínas o metabolitos en la fase de vapor del nitrógeno líquido para minimizar la formación de cristales de hielo. Coloca los tejidos en criotubos marcados y suspendelos sobre nitrógeno líquido para congelarlos rápidamente. Una vez completamente congeladas, transfiere las muestras a almacenamiento a −80 °C.

Resultados

Durante la necropsia, los ratones mayores presentan frecuentemente lesiones neoplásicas y requieren un examen cuidadoso para documentar hallazgos patológicos 13,14,16,17,18. La Figura 2A muestra a un ratón macho C57BL/6 de 22 meses en posición supina tras una perfusión. El blanqueamiento completo de los pulmones confirma una perfusión efectiva, mientras que el hígado solo presenta un blanqueamiento parcial. Una inspección más detallada del hígado reveló múltiples nódulos malignos (Figura 2B), acompañados de vesículas seminales agrandadas (Figura 2A) y esplenomegalia (Figura 2C). Estos hallazgos son comunes en ratones envejecidos y deberían documentarse como parte de la carga total de la enfermedad¹⁸.

La Figura 3 muestra órganos macroscópicamente normales recogidos tras la disección y perfusión, permitiendo evaluar la integridad anatómica y la eficiencia de la perfusión. El tracto gastrointestinal se enjuagó con solución fisiológica para eliminar el contenido digerido, resultando en un aspecto limpio y translúcido del estómago, colon e intestino delgado (Figura 3A). Estructuras adicionales, incluyendo el esófago, páncreas, bazo, depósitos viscerales de adiposo, riñones con vejiga, ganglios linfáticos, corazón y timo, fueron claramente identificables y pudieron aislarse intactos para análisis posteriores (Figuras 3B, C, E-I).

La calidad de la perfusión se evaluó examinando el blanqueamiento en tejidos altamente vascularizados. Como se muestra en las Figuras 3D y3J, el hígado y los pulmones mostraron diferencias claras entre condiciones no perfusas, bien perfundidas y parcialmente perfundidas. El blanqueado completo confirmó una perfusión exitosa, mientras que el blanqueado incompleto indicó variabilidad técnica o anomalías subyacentes. Otros tejidos, incluyendo aorta, músculo esquelético, tibia, cerebro, ojo y piel, se aislaron con morfología preservada, adecuados para aplicaciones histológicas, moleculares o de imagen posteriores (Figura 3K-P). Este procedimiento estandarizado de disección proporciona una recuperación constante de tejidos y órganos intactos y bien conservados, y permite una evaluación anatómica global que respalde una variedad de análisis posteriores. La disección y la recogida de órganos requerían aproximadamente entre 40 y 60 minutos por animal, dependiendo de la experiencia del operador y la presencia de hallazgos patológicos.

La Figura 4 muestra cambios ejemplares asociados al envejecimiento en órganos recolectados tras la incrustación de parafina, la sección y la tinción de hematoxilina y eosina (H&E). En secciones de piel de ratones mayores se observaron adelgazamiento epitelial y pérdida de folículos pilosos en comparación con controles jóvenes (Figura 4A). Las secciones renales revelaron agrandamiento de las cápsulas de Bowman junto con cambios fibróticos y necróticos, así como regiones compatibles con linfomas (Figura 4B). En las secciones pancreáticas, se observó un aumento de cuerpos^{apoptóticos 19} y regiones linfomatosas en animales ancianos, indicativo de una integridad tisular comprometida con la edad (Figura 4C). Las secciones del bazo mostraban depósitos amiloides y regiones de linfoma en animales ancianos, reflejando características adicionales de patologías relacionadas con la edad (Figura 4D).

Estos resultados destacan características histopatológicas representativas del envejecimiento en múltiples tejidos, demostrando la utilidad de este protocolo para detectar las características estructurales del deterioro relacionado con la edad.

Figura 1: Visión esquemática de los procedimientos de disección y exposición de órganos en ratón. (A) Puntos de incisión para abrir las cavidades torácica y abdominal (líneas rojas), incluyendo una incisión transversal a nivel del diafragma, seguida de cortes en forma de V a ambos lados de la caja torácica para abrir la cavidad torácica, y una incisión en la línea media desde el diafragma hasta la pelvis con cortes bilaterales para exponer completamente la cavidad abdominal. (B) Montaje de perfusión que muestra la inserción de una aguja mariposa en el ventrículo izquierdo e incisión en la aurícula derecha para permitir un drenaje sanguíneo eficaz. (C) Disposición anatómica de los órganos torácicos y abdominales principales tras la exposición a cavidades. (D) Pasos de disección de la cabeza, incluyendo la extracción del cuero cabelludo y la apertura del cráneo a lo largo de las suturas craneales para exponer el cerebro. Las líneas rojas indican las incisiones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Identificación de lesiones neoplásicas en ratones de edad avanzada. (A) Ratón macho C57BL/6 de 22 meses representativo en posición supina tras perfusión con 4% de PFA. El blanqueamiento completo de los pulmones (punta de flecha rosa) confirma una perfusión efectiva, mientras que el hígado (punta de flecha verde) muestra solo escaldadamiento parcial. Las puntas de flecha azules denotan vesículas seminales agrandadas. (B) Vista detallada del hígado que revela múltiples nódulos malignos (puntas de flecha negras). (C) Bazo agrandado de un ratón C57BL/6 envejecido (lado derecho) en comparación con un bazo normal de un animal joven (lado izquierdo). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Visión general de los principales órganos y la integridad tisular del ratón tras la disección y perfusión. (A) Estómago, intestino delgado y colon antes y después del enjuague con solución fisiológica para eliminar el contenido digerido. (B) Esófago. (C) Páncreas con bazo adherido. (D) Hígado sin perfusión, con blanqueamiento completo tras una perfusión efectiva, y con blanqueamiento parcial indicativo de perfusión incompleta o patología subyacente. (E) Tejido adiposo visceral. (F) Riñones con vejiga acoplada. (G) Ganglios linfáticos inguinales. (H) Corazón. (I) Timo. (J) Pulmones sin perfusión, con blanqueamiento completo tras una perfusión efectiva, y con blanqueamiento parcial. (K) Aorta. (L) Músculo esquelético aislado de la extremidad posterior. (M) Tibia con estructura ósea preservada. (N) Cerebro. (O) Ojo. (P) Piel. Barras de escala: 5 mm en A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm en todos los demás paneles. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Análisis histológico de órganos principales mediante tinción de hematoxilina y eosina (H&E). (A) Secciones de piel de ratones de 3 meses (jóvenes) y 22 meses (envejecidos). Las secciones de animales ancianos muestran adelgazamiento epitelial y pérdida de folículos pilosos. (B) Secciones renales destacando las cápsulas de Bowman. Las secciones de animales ancianos muestran agrandamiento de cápsulas, cambios fibróticos y necróticos, y linfomas (puntas de flecha naranjas). (C) Secciones pancreáticas de animales jóvenes y ancianos, con animales mayores mostrando cuerpos apoptóticos aumentados (puntas de flecha azules) y regiones linfomáticas (puntas de flecha naranjas). (D) Secciones del bazo de ratones de 3 meses (jóvenes) y de 22 meses (ancianos). Las secciones de animales envejecidos muestran depósitos de amiloides (puntas de flecha verde lima) y regiones de linfoma. Barra de escala (A-C) 100 μm. Barra de escala (D) 500 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Lista de comprobación para la preparación. Una lista paso a paso de preparaciones esenciales para la disección y preservación de tejidos de ratón, incluyendo el etiquetado de tubos y mohos, preparación de tampones y fijadores, preparación para crio-incrustación, esterilización de herramientas de disección, disposición de las estaciones de trabajo y planificación de documentación. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Lista de comprobación para la recogida de tejidos. Usa la tabla para registrar los pañuelos recogidos. Añade el tiempo de recogida y notas sobre el estado o anomalías. Prioriza los tejidos críticos para tu estudio; recoger los órganos más relevantes dentro del tiempo recomendado para evitar autólisis/degradación tisular.*Anote cualquier anomalía (incluyendo decoloración de órganos, nódulos, crecimiento maligno, tamaño anormal de órgano). **Considera documentar métodos de preservación (incluyendo fijación de PFA, incrustación OCT o congelación instantánea). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este protocolo proporciona una estrategia reproducible para la recogida sistemática de múltiples sistemas orgánicos en ratones jóvenes y mayores, permitiendo análisis anatómicos, histológicos y moleculares. Varias consideraciones técnicas pueden afectar la calidad de los resultados y abordar las limitaciones del método descrito. Primero, la variabilidad en la calidad de la perfusión es un factor importante a considerar. La perfusión incompleta puede dejar sangre residual que compromete la histologia, inmunohistoquímica y análisis moleculares. La perfusión tras una luxación cervical puede causar traumatismo en los tejidos cervicales y provocar contaminación sanguínea de los pulmones. Por tanto, la luxación cervical solo debe realizarse por personal cualificado. Para obtener resultados óptimos, la perfusión debe realizarse bajo anestesia terminal según se describe en^{otros lugares 20,21}, de acuerdo con las directrices IACUC y^{AVMA 13}. En segundo lugar, la fijación es un determinante crítico de la integridad tisular. Aunque el paraformaldehído (PFA) al 4% se utiliza ampliamente, puede penetrar inadecuadamente órganos grandes o densos, lo que resulta en una mala histología y conservación de antígenos. Esta limitación puede mitigarse usando formalina amortiguada neutra al 10% (NBF) o cortando tejidos en secciones de ≤5 mm para mejorar la^{penetración en 22}. En tercer lugar, algunos tejidos, especialmente el páncreas, el estómago y el cerebro, sufren autólisis rápidas, lo que requiere fijación o congelación en un plazo de 5-10 minutos tras la eutanasia y el uso de herramientas de disección^{preenfriadas 23}. En ratones mayores, la neoplasia puede distorsionar aún más la anatomía y complicar la disección. Pueden surgir artefactos adicionales por volumen de fijación inadecuado o congelación, lo que puede provocar contracción y efectos de borde; estos pueden minimizarse manteniendo una proporción fijador-tejido de al menos 10:1, evitando el hacinamiento y preenfriando los moldes OCT antes de incrustarlos. Por último, el uso de PFA y formalina plantea preocupaciones de seguridad y eliminación; Los fijadores basados en glioxales ofrecen alternativas menos tóxicas. Por tanto, la manipulación estandarizada, la fijación optimizada y el tiempo cuidadoso son esenciales para maximizar la reproducibilidad, la calidad del tejido y la fiabilidad de los análisis^{posteriores 24}.

Al extraer tejidos de más de 15 órganos dentro del mismo animal, este flujo de trabajo maximiza el rendimiento biológico por sujeto y se alinea con los mandatos éticos para reducir el uso de animales. El procedimiento sistemático puede ampliarse fácilmente a estudios de rendimiento medio que examinen el deterioro fisiológico relacionado con la edad y patologías específicas de^{órganos 25}.

El procesamiento rápido de tejidos propensos a la autólisis es esencial para preservar la integridad histológica. El uso de soluciones fisiológicas libres de calcio y magnesio, seguidas de PFA al 4%, preserva de forma fiable la arquitectura de los órganos y minimiza la autólisis en tejidos sensibles como el páncreas y el sistema digestivo. A diferencia de los protocolos centrados en órganos individuales o modelos de enfermedades, este enfoque permite la recogida rápida y consistente de múltiples órganos, reduciendo la variabilidad y mejorando el rendimiento. La disección completa, desde la perfusión hasta la excisión final del tejido, puede completarse en 60 minutos por animal, lo que la hace adecuada para estudios a gran escala o con sensibilidad al^{tiempo 3,11,26}. La adherencia a una secuencia precisa de perfusión-fijación minimiza los artefactos y permite resultados reproducibles.

La consistencia en la recogida, recorte e incrustación de tejidos es esencial para una evaluación histopatológica precisa, especialmente en estudios longitudinales o multicéntricos. La variabilidad en el manejo de los tejidos puede introducir artefactos, hallazgos patológicos oscuros o conducir a una mala interpretación de la carga de la enfermedad. Las Guías Revisadas para el Muestreo y Recorte de Órganos en Ratas y Ratones, como las Guías de Reni de Reni, proporcionan protocolos detallados y estandarizados para minimizar tales^{inconsistencias 22}. La adopción de estos métodos armonizados mejora la comparabilidad de datos entre estudios e instituciones, fortalece la reproducibilidad y mejora la integridad de los resultados basados en patología en la investigación sobre el envejecimiento ^4,9.

Recoger una multitud de órganos es especialmente importante en la investigación sobre el envejecimiento, donde entender cómo interactúan los sistemas orgánicos es esencial para descubrir los procesos que impulsan el deterioro fisiológico de todo el cuerpo con la edad. Aunque este enfoque también puede ser beneficioso para una variedad de otras cuestiones de investigación, el enfoque de este protocolo es apoyar estudios de envejecimiento donde los cambios relacionados con la edad puedan afectar a múltiples sistemas orgánicos simultáneamente. Sin embargo, también puede aplicarse a estudios centrados en fibrosis, regeneración y senescencia, especialmente aquellos que integran transcriptómica o el descubrimiento de biomarcadores^{multitisulares 9,27,28}.

Las evaluaciones histológicas revelaron alteraciones características asociadas a la edad en múltiples tejidos (Figura 4). En la piel, los animales envejecidos mostraron adelgazamiento epitelial y pérdida de folículos pilosos. En el riñón, las secciones de ratones envejecidos mostraron el agrandamiento de la cápsula de Bowman junto con cambios fibróticos, necróticos y linfomatosos. El tejido pancreático de animales ancianos mostró acumulación de cuerpos apoptóticos y linfomas, mientras que las secciones del bazo mostraron depósitos de amiloide y regiones adicionales de linfoma. Estas observaciones son coherentes con fenotipos de envejecimiento murino establecidos y demuestran la utilidad de este protocolo para detectar marcadores histopatológicos representativos de envejecimiento 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

En resumen, este protocolo ofrece un marco fiable y escalable para la recogida y preservación de tejidos en modelos de envejecimiento preclínicos. Puede adoptarse tanto en estudios exploratorios como basados en hipótesis para descubrir mecanismos específicos y sistémicos de tejido relacionados con el envejecimiento, la degeneración y la resiliencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Almohadilla absorbente
Edad C57BL/6J ratones	El Laboratorio Jackson & nbsp;	#000664
Bandejas de recogida
Recortadoras inalámbricas	BravMini+	CLP-41590	Para la depilación
Spray de etanol 70%	Fisher Scientific	50-163-3592
Pinzas Extra 5 INOX	Dumont	F6521-1EA	Pinzas de punta extra fina para ganglios linfáticos
Pinzas	MilliporeSigma	XX6200006P	Pinzas de extremo romo
Pinzas 5 INOX	Dumont	F6521-1EA	Pinzas de punta fina
Solución salina balanceada de Hank (HBSS) 1x 500 mL	Gibco	14025092
Tijeras microdiseccionadoras (rectas, filosas/filosas, 25mm)	Roboz Surgical	RS-5668	Microtijeras estándar, acero inoxidable, hoja de 25 mm (M-37)
Tijeras microdiseccionadoras (cuchillas rectas, afiladas/afiladas, finas)	Roboz Surgical	RS-5918	Tijeras finas de disección, 4,5" de longitud (H-327)
NBF	Sigma	HT501128	Para la fijación
Solución fisiológica normal	Cytiva	76081-514
Temperatura óptima de corte (OCT)	Fisher Scientific	23730571
Paraformaldehído (PFA) 4%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710	Para la fijación
Placas de Petri 100 mL x 15 mL	MilliporeSigma	P5856-500EA
Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS)	Gibco	10010023
Pines	Eisco Labs	DISPINS1	Asegurar el ratón durante la disección
Jeringuilla de plástico 20 mL, bloqueo luer	FisherBrand	302830	Para la perfusión
Caja Seal'N Freeze (Contenedor criogénico)	Ted Pella, Inc.	20956
Criorays Seal'N Freeze	Ted Pella, Inc.	20956-1	Para colocar muestras en el contenedor criogénico
Aguja Mariposa Sol-Vet con adaptador	Sol-Millenium Medical	110301070003	para la perfusión
Tapa de poliestireno
Tek tissular Cyromold (Biopsia)	Sakura	25608-922
Ratones jóvenes C57BL/6J	El Laboratorio Jackson & nbsp;	#000664