Análisis optimizado de proteínas de ovocitos y embriones de Xenopus mediante inmunotransferencia

Resumen

En este artículo se describe un protocolo para el análisis de proteínas de ovocitos y embriones de Xenopus mediante inmunotransferencia. Se describen los pasos de recolección, seguidos de los pasos correspondientes al procesamiento de la muestra, SDS-PAGE, transferencia, tinción de anticuerpos e imágenes. El protocolo enfatiza el estudio de complejos de proteínas reguladoras traslacionales con anticuerpos endógenos y anticuerpos contra etiquetas de afinidad proteica.

Resumen

El análisis de proteínas mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de inmunotransferencia (western blotting) es una parte vital del conjunto de herramientas del biólogo molecular. Esta técnica separa una mezcla de proteínas complejas por peso molecular y luego analiza la presencia de proteínas diana utilizando anticuerpos específicos. La inmunotransferencia tiene una variedad de aplicaciones. Los ejemplos incluyen el uso como un enfoque dirigido para estudiar los interactores proteína-proteína o como control para confirmar la expresión o el agotamiento de los objetivos proteicos. Sin embargo, la ejecución exitosa de la inmunotransferencia requiere experimentos complicados de varios pasos. Los protocolos deben optimizarse para cada organismo, proteína objetivo y aplicación. Por lo tanto, existen lagunas de conocimiento para el uso de inmunotransferencias en muchos modelos, incluida la rana modelo Xenopus laevis.

Debido a su gran tamaño, abundante material para experimentos bioquímicos y fácil manejo, los ovocitos y embriones de X. laevis han sido vitales para estudiar los principios del control traslacional. Sin embargo, esta especie carece de protocolos específicos para inmunotransferencia robusta y rutinaria. Aquí, ofrecemos un protocolo en profundidad para Western blot optimizado para muestras de múltiples etapas de desarrollo de Xenopus . Luego analizamos los reguladores traslacionales en todo el desarrollo.

Introducción

Comprender los mecanismos celulares requiere monitorear especies de proteínas específicas. Las preguntas comunes incluyen cómo cambian en expresión espacial y temporalmente, con qué proteínas interactúan y si se modifican en respuesta a diferentes condiciones. La inmunotransferencia, conocida coloquialmente como "Western blotting", es una metodología clave para abordar estos desafíos. Un experimento de inmunotransferencia separa las proteínas de una muestra compleja, por ejemplo, lisado de células completas, y las identifica usando anticuerpos. Específicamente, las proteínas se desnaturalizan y luego se separan mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) por tamaño. Las proteínas fraccionadas de tamaño se transfieren a un soporte sólido, como una membrana de nitrocelulosa, y la proteína de interés se identifica mediante reactivos de anticuerpos. La inmunotransferencia se ha convertido en una parte estándar del conjunto de herramientas del biólogo molecular. Se usa comúnmente para monitorear la expresión de proteínas en diferentes contextos o como punto final para experimentos como ensayos de inmunoprecipitación. A pesar de estas ventajas, el análisis de los niveles de proteínas en estado estacionario con inmunotransferencia resulta un desafío, ya que el ensayo debe optimizarse para cada paso y contexto experimental (Figura 1).

Un contexto desafiante es el análisis de material de la rana africana de garras Xenopus laevis. X. laevis es un organismo importante para estudiar las interacciones ARN-proteína. Este sistema tiene numerosas ventajas, la principal de ellas es que X. laevis produce cientos de ovocitos y, posteriormente, embriones que se desarrollan sincrónicamente a la vez. Cada ovocito tiene ~25 μg de proteína¹ no vitelina, lo que proporciona abundante material para experimentos bioquímicos. El gran tamaño (~1250 μm)¹ de los ovocitos y embriones también facilita la microinyección de ARNm para expresar exógenamente proteínas marcadas o mutadas a escala². Estas cualidades permiten realizar potentes experimentos para probar el control de la traducción en X. laevis, como el ensayo de función atada, en el que se puede analizar el impacto de una proteína reguladora de la traducción en un ARNm independientemente de la capacidad de esa proteína para unirse al ARN 3,4,5,6. Sin embargo, la inmunotransferencia en ovocitos y embriones de Xenopus presenta dificultades, incluida la interferencia de grandes masas de plaquetas vitelinos en estas células tempranas⁷, que oscurecerán los resultados si no se eliminan.

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para inmunotransferencia efectiva en X. laevis, con énfasis en la detección de proteínas reguladoras de la traducción. Proporcionamos instrucciones sobre cómo recolectar y procesar ovocitos y embriones para obtener imágenes del inmunoblot final. También se incluyen instrucciones detalladas para una carga óptima de proteínas y la obtención de imágenes, así como para evitar la contaminación de la yema de la muestra. Además, discutimos posibles modificaciones del protocolo y estrategias para encontrar anticuerpos compatibles con las proteínas de Xenopus . Tenemos la intención de proporcionar a los investigadores orientación para realizar inmunotransferencia sin esfuerzo como parte de sus propios experimentos en este organismo modelo infrautilizado.

Figura 1: Flujo de trabajo para la preparación de muestras de Xenopus y el posterior análisis de inmunotransferencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todo el trabajo con animales (X. laevis) representados en este protocolo está de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UW-Madison y ha sido aprobado por él. Los detalles del equipo, los reactivos utilizados y las concentraciones de anticuerpos empleadas se enumeran en la Tabla de materiales. Se puede ver una selección de equipos en la Figura 2, a continuación.

Figura 2: Extracto embrionario procesado y equipo para inmunotransferencia. (A) Extracto de ovocitos centrifugado de X. laevis en estadio VI. Los lípidos y las proteínas liposolubles suben a la parte superior, mientras que la vitelogenina (yema) y los desechos pigmentados forman un gránulo. (B) Equipo para SDS-PAGE para separar proteínas por peso molecular. (i) Fuente de alimentación, (ii) Tanque de electroforesis vertical, (iii) Tapa del tanque de electroforesis, (iv) Conjunto de electrodos, (v) Presa de amortiguación, (vi) Gel de electroforesis prefabricado; Tenga en cuenta el peine verde (arriba) y la pegatina azul (abajo), cada uno de los cuales debe quitarse. (C) Equipo para transferencia de membrana. El tanque de electroforesis vertical y la tapa se reutilizan para la transferencia después de un enjuague completo. (i) Rodillo para eliminar burbujas, (ii) Clip de transferencia, (iii) Barra de agitación pequeña, (iv) Membrana de nitrocelulosa entre dos hojas de papel azul protectoras, (v) Papel de filtro de cromatografía de celulosa, (vi) Cojines de esponja de transferencia, (vii) Fuente de vidrio para hornear para ensamblaje de transferencia, (viii) Bolsa de hielo, (ix) Núcleo de transferencia. (D) Otro equipo. (i) Liberador de gel (para recortar pocillos de gel antes de la transferencia), (ii) Palanca de apertura del casete de gel, (iii) Pinzas (para manipular membranas), (iv) Recipiente (para sujetar membranas), (v) tapa de recipiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Recogida de ovocitos y embriones de Xenopus

1. Preparación de ovocitos
   1. Obtenga ovocitos de X. laevis desfoliculados de un proveedor comercial (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) o aísle y desfolicule como se describe⁸.
   2. Cultivo aislado de ovocitos en solución de Barth modificada (MBS; 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,4 mM de CaCl₂, 0,33 mM de Ca(NO₃)₂, 0,8 mM de MgSO₄, 5 mM de Tris-HCl, 2,4 mM de NaHCO₃, pH 7,4) hasta su uso.
2. Preparación embrionaria
   1. Aísle los huevos de X. laevis y fertilícelos como se describe ^9,10.
   2. Cultivo de embriones fertilizados en solución de Ringer modificada de Marc 0,25x¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Preparar una solución de cisteína al 2% en 0,1x MMR con el pH ajustado a 8,2 utilizando NaOH.
   4. Retire 0,25 veces la MMR del plato utilizado para la fertilización y cubra los embriones con la solución de cisteína para eliminar la capa de gelatina¹². Mezcle la solución suavemente para que los embriones queden expuestos uniformemente.
   5. Monitoriza de cerca los embriones con un microscopio estereoscópico de 2x a 25x de aumento. Después de que la capa de gelatina se haya disuelto (generalmente de 3 a 5 minutos), los embriones se empaquetarán juntos. Evite la exposición prolongada a la cisteína.
   6. Retire la solución de cisteína y enjuague los embriones varias veces con 0,25 veces MMR.
   7. Cultiva en 0,25x MMR hasta la etapa de crecimiento deseada.
3. Recoger el número deseado de embriones u ovocitos (recomendado al menos cinco por muestra) en un tubo de 1,5 ml.
4. Elimine el exceso de medios con una pipeta, evitando dañar las células.
5. Utilice las muestras inmediatamente o guárdelas a -80 °C hasta su uso. Los ovocitos y embriones pueden almacenarse durante varios años.

2. Preparación del extracto de Xenopus

1. Descongele las muestras en hielo si están congeladas.
2. Añadir 10 μL de tampón de lisis celular 10x refrigerado diluido a 1x con agua desionizada doble (ver Tabla de Materiales) por embrión/ovocito y homogeneizar las muestras con un micromortero sobre hielo.
3. Centrifugar muestras a 5000 g a 4 °C en una centrífuga de sobremesa durante 10 min para granular los restos, incluida la yema y los pigmentos insolubles.
4. Retire el sobrenadante a un tubo separado de 1,5 ml, teniendo cuidado de evitar el gránulo (Figura 2A).
5. Añadir al sobrenadante un volumen igual de tampón de muestra 2x Laemmli suplementado con 2-mercaptoetanol al 5% p/v y hervir durante 10 min a 95-100 °C para desnaturalizar las proteínas de la muestra.
6. Use muestras inmediatamente o guárdelas a -20 ° C durante meses o años.

3. PÁGINA DE LA SDS

1. Preparar tampón de ejecución SDS: 1x tampón Tris-MOPS-SDS (6,06 g de Tris base, 10,46 g de ácido 3- (N-morfolino)propanosulfónico [MOPS], 1,0 g de SDS, 0,3 g de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], agua doble desionizada a 1000 ml).
2. Retire un gel prefabricado de BIS-TRIS SDS al 4-12% del empaque. Retire la pegatina en la parte inferior del gel.
3. Inserte el gel en el conjunto de electrodos frente a un dique amortiguador. Coloque el conjunto de electrodos en el tanque de electroforesis vertical (Figura 2B).
4. Llene el conjunto de electrodos y el fondo del tanque de electroforesis con 1x tampón de funcionamiento Tris-MOPS-SDS.
5. Retire suavemente el peine de gel del tampón de gel y pipeta que pasa por los pocillos para eliminar las burbujas y equilibrar el tampón.
6. Cargue con cuidado 5 μL de patrones de proteína preteñidos en el primer pocillo y 10 μL de cada muestra en los pocillos adicionales.
7. (OPCIONAL) Cargue los pocillos restantes con 10 μl de tampón de muestra 1x Laemmli para que el gel funcione de manera más uniforme.
8. Coloque la tapa en el tanque de electroforesis y conéctelo a una fuente de alimentación. Aplicar 200 V.
9. Detenga la electroforesis cuando el frente de tinte tampón de muestra salga del gel.

4. Transferencia húmeda de proteínas a una membrana

1. Mientras las muestras se electroforesan, prepare 1 L de tampón de transferencia (3,0 g de Tris Base, 4,08 g de bicina, 900 ml de agua desionizada doble, 100 ml de metanol). Preenfríe el tampón de transferencia a 4 °C.
   PRECAUCIÓN: Manipule las existencias de metanol concentrado en una campana extractora y evite el contacto con la piel. El metanol se puede sustituir por etanol.
2. Antes de que se complete la electroforesis, comience a ensamblar el "sándwich" de transferencia en el clip de transferencia (Figura 2C).
   1. Llene una fuente de vidrio para hornear con tampón de transferencia frío. En los pasos posteriores de ensamblaje de sándwich, asegúrese de que los materiales estén sumergidos en este búfer.
   2. Coloque el clip de transferencia en el plato con la mitad negra apoyada contra el fondo del plato, la mitad blanca abierta y apuntando hacia arriba, y el clip de transferencia abierto hacia la izquierda.
   3. Coloque una o dos esponjas de fibra planas sobre la mitad negra del clip de transferencia.
   4. Cortar dos papeles de cromatografía de celulosa de 0,35 mm (papeles de filtro) a medida y colocar uno encima de las esponjas.
3. Una vez completada la electroforesis, retire el gel del tanque de electroforesis.
4. Separe con cuidado las placas del gel con la palanca de apertura del casete de gel, asegurándose de que el gel permanezca adherido a una de las placas (Figura 2D). Recorta los pocillos de la parte superior del gel con el liberador de gel.
5. Coloque el gel, aún adherido a la mitad del casete de plástico, sobre el papel de filtro. Retire la mitad del casete para que el gel permanezca en el papel de filtro.
6. Corta un cuadrado de membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm para que se ajuste a las dimensiones del gel. Retire la membrana del papel protector, humedézcala brevemente en tampón de transferencia y colóquela sobre el gel.
   NOTA: Manipule la membrana con cuidado por las esquinas con guantes o fórceps para evitar la contaminación no deseada de proteínas de la membrana.
7. Coloque un segundo papel de filtro encima de la membrana de nitrocelulosa. Retire suave pero firmemente las burbujas con un rodillo en la parte superior del papel de filtro.
8. Apila una o dos esponjas de fibra más encima del papel de filtro.
9. Cierre el casete de transferencia y sujételo herméticamente, completando el 'sándwich'.
10. Inserte el sándwich de transferencia en el núcleo de transferencia con el clip de transferencia hacia arriba y el lado negro del clip de transferencia hacia el lado negro del núcleo.
11. Coloque el núcleo de transferencia en el tanque de electroforesis. Agregue una bolsa de hielo y una barra de agitación al tanque para que la barra de agitación pueda girar libremente.
    NOTA: Además o en lugar de una bolsa de hielo, la transferencia se puede realizar en una cámara frigorífica a 4 °C en el paso 4.13.
12. Llene el tanque con tampón de transferencia refrigerado. Asegure la tapa firmemente en la parte superior.
13. Conecte el aparato de transferencia a la fuente de alimentación, asegurándose de alinear los colores de los electrodos. Ejecute la transferencia durante 1 h, 100 V, a 4 °C, con la barra de agitación girando.

5. Procesamiento de membranas posterior a la transferencia

1. Prepare 10x solución salina tamponada con Tris (100 mM de base de Tris; 1,5 M de NaCl). Ajuste el pH a 8 y esterilice con filtro.
2. Prepare 1x solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBSTw) diluyendo 10x TBS solución 1:10 en 500 ml de agua desionizada doble y agregando 500 μL Tween-20.
3. Prepare el tampón de bloqueo (500 ml de TBSTw, 25 g de leche descremada en polvo).
   NOTA: La leche descremada se puede sustituir con albúmina sérica bovina (BSA) al 2-5% en el tampón de bloqueo. BSA debe usarse si la aplicación experimental implica la visualización de proteínas biotiniladas, ya que la leche contiene biotina.
4. Una vez que se complete la transferencia, retire y desmonte con cuidado el sándwich y retire la membrana de nitrocelulosa. Marque qué lado de la membrana estaba en contacto con el gel y mantenga este lado boca arriba en los pasos posteriores.
5. Prepare 50 ml de tinción de Ponceau (0,5% de Ponceau S, 1% de ácido acético), una tinción reversible para la visualización de proteínas.
   PRECAUCIÓN: La mancha de Ponceau es corrosiva. Evite el contacto con la piel.
6. Coloque la membrana en un recipiente pequeño (como se muestra en la Figura 2D) de modo que quede al ras contra el fondo del recipiente. Cubra la membrana con tinte Ponceau hasta la inmersión y balancee suavemente sobre un balancín durante 5-10 min.
7. Vierta la mancha de Ponceau.
   NOTA: La mancha Ponceau se puede reutilizar varias veces.
8. Enjuague la membrana en lavados repetidos de agua doblemente desionizada hasta que se elimine el exceso de Ponceau y las bandas de proteínas en los carriles comiencen a resolverse.
9. Confirme la eficiencia de la transferencia mediante la presencia de carriles rectos y uniformes con bandas claramente resueltas.
10. Vierta el líquido restante y sumerja la transferencia en un tampón de bloqueo para evitar que el anticuerpo inespecífico se una a la membrana en los pasos posteriores.
11. Balancee suavemente sobre una mecedora durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.

6. Incubación de anticuerpos

1. Diluya el anticuerpo primario en 10 ml de tampón de bloqueo fresco a la concentración deseada.
   NOTA: La concentración óptima deberá determinarse empíricamente para cada nuevo anticuerpo. Un punto de partida típico es 1:1000, o bien siga las recomendaciones del fabricante.
2. Retire el tampón de bloqueo y reemplácelo con la mezcla de anticuerpos. Incubar, meciendo suavemente, durante la noche (~16 h) a 4 °C.
3. Vierta la solución de anticuerpos primarios y enjuague la membrana con TBSTw sumergiéndola en la solución y vertiéndolo rápidamente.
   NOTA: La mayoría de las mezclas de anticuerpos se pueden guardar y reutilizar dos o tres veces. Esto debe determinarse empíricamente para cada anticuerpo.
4. Lave la membrana sumergiéndola en TBSTw y balanceándola suavemente a temperatura ambiente durante 5 min. Realice tres lavados totales de 5 minutos.
5. Diluir el anticuerpo secundario en 30 ml de TBSTw a la concentración deseada.
   NOTA: La concentración deberá determinarse empíricamente para cada anticuerpo. Normalmente usamos 1:30,000.
6. Vierta la solución de lavado TBSTw y reemplácela con la mezcla de anticuerpos secundarios. Incubar, meciendo suavemente, durante 45 min a temperatura ambiente.
7. Enjuague rápidamente la membrana una vez con TBSTw seguido de tres lavados de TBSTw de 5 minutos.

7. Imagen de la membrana en un revelador de película

1. En un cuarto oscuro, encienda el revelador de película y deje que se caliente.
2. Corta dos cuadrados de envoltura de plástico lo suficientemente grandes como para abarcar la membrana. Con unas pinzas, coloque la membrana de nitrocelulosa "boca arriba" en el primer cuadrado de la envoltura de plástico.
3. En un tubo de 1,5 ml, mezcle cantidades iguales de los reactivos Luminol y Enhancer de quimioluminiscencia mejorada (ECL). El uso de 1 ml de la solución mezclada debería cubrir la mayoría de las membranas.
4. Pipetee el reactivo ECL sobre la membrana y manipule la membrana suavemente con la envoltura de plástico para garantizar una cobertura completa. Incubar durante 1 min.
5. Elimine el exceso de reactivo ECL agarrando la membrana con fórceps y sacudiendo suavemente el líquido o absorbiendo el líquido tocando una esquina de la membrana con una toalla de papel.
6. Coloque la membrana boca arriba en el segundo cuadrado de envoltura de plástico y doble la envoltura de plástico sobre la membrana hasta que esté sellada sin apretar. Pegue la membrana envuelta de forma segura en un casete de autorradiografía.
7. En el cuarto oscuro, coloque una película dentro del casete, cubriendo la membrana con cinta adhesiva. Cierre bien el casete y exponga la película a la membrana durante 1 min.
8. Retire con cuidado la película, teniendo cuidado de no arrastrar la película expuesta a lo largo de la membrana. Introdúcelo en el revelador de la película.
9. Al evaluar la película revelada, ajuste el tiempo de exposición con películas posteriores hasta lograr la visualización de proteínas deseada. Si la visualización de la proteína proporciona una señal débil, repita el paso de incubación del reactivo ECL con un reactivo ECL más sensible y vuelva a obtener una imagen.
10. Alinee la película revelada con los marcadores que brillan en la oscuridad y use esta referencia para marcar la posición de los estándares de proteínas preteñidos en la membrana en la película.
11. Una vez que se complete la imagen, retire con cuidado la membrana de la envoltura de plástico y sumérjala en TBSTw para eliminar el reactivo ECL restante.

8. (Opcional) Incubaciones de anticuerpos adicionales

NOTA: La eliminación de un inmunoblot se refiere a la eliminación de los anticuerpos primarios y secundarios iniciales con una solución desnaturalizante (tampón de extracción) para que el blot pueda volver a sondearse con un anticuerpo diferente. El resondeo permite analizar la misma inmunotransferencia para determinar la expresión de diferentes dianas proteicas y comparar proteínas desconocidas con proteínas bien caracterizadas que funcionan como estándares. Pruebe primero con el anticuerpo que produce la señal comparativamente más débil. De este modo, se evitan los artefactos causados por anticuerpos eliminados de forma incompleta en exposiciones posteriores y se minimiza el impacto de la pérdida de proteínas por la extracción repetida de una transferencia.

1. Elimine los anticuerpos unidos sumergiendo la membrana en un tampón de extracción y balanceando suavemente durante 5-10 min.
2. Retire la membrana del tampón de extracción y enjuague brevemente en TBSTw para eliminar cualquier solución de extracción residual.
3. Sumerja la membrana en un tampón de bloqueo y balancee suavemente durante 30 min.
4. Hacer una nueva solución de anticuerpo primario en tampón de bloqueo con la concentración deseada.
5. Añadir la nueva dilución de anticuerpos primarios a la membrana e incubar balanceándose suavemente durante la noche a 4 °C.
6. Continúe desde el paso 6.3 en adelante. La membrana se puede quitar y volver a sondear hasta tres veces más.

Resultados

Para demostrar la eficiencia de nuestro protocolo de inmunotransferencia, analizamos proteínas de control de traducción endógenas y marcadas por afinidad en tres tipos de muestras de X. laevis: ovocitos en estadio VI, embriones en estadio 7 (blástulas) y embriones en estadio 10,5 (gástrula). Estas etapas fueron elegidas porque abarcan la transición media de la blástula (etapa 8.5), que marca el comienzo de una transcripción cigótica robusta^13,14. Debido a que el desarrollo antes de la transición de la blástula media ocurre en ausencia de transcripción, los embriones precigóticos (es decir, controlados por la madre) dependen en gran medida de los mecanismos de control de la traducción para expresar las proteínas del destino celular con la resolución temporal y espacial correcta¹⁵. Por lo tanto, la transición de la blástula media es un contexto vital en el que estudiar las interacciones ARN-proteína.

Para analizar la expresión de proteínas a través de inmunotransferencia, se inyectaron ovocitos y embriones de X. laevis con 500 pg de ARNm que codifica la mitad C-terminal de X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) fusionada con etiquetas de afinidad de hemaglutinina 3x (HA). Elegimos analizar Bicc1 debido a su relevancia para la biología de Xenopus y las interacciones proteína-ARN. Bicc1 es una proteína de unión al ARNm y un represor de la traducción que guía las decisiones sobre el destino celular en el embrión temprano 16,17,18. Más adelante en el desarrollo, afecta el patrón izquierda-derecha 19,20,21 y la función de los órganos, incluidos los riñones 22,23,24,25. Bicc1 contiene una región que dirige la represión traduccional⁵ y los dominios de homología hnRNP K (KH) que median la unión a ARNm específicos 5,26,27,28.

Se prepararon extractos de cinco ovocitos o embriones inyectados con HA-Bicc1, junto con las correspondientes muestras no inyectadas como controles negativos. Una décima parte de cada extracto se electroforesó en un gel bis-tris de gradiente de 4-12% y se transfirió en húmedo a una membrana de nitrocelulosa. La tinción de Ponceau de la membrana para detectar la transferencia exitosa de proteína total confirmó (Figura 3A). Como parte de nuestros estudios, generamos un anticuerpo en conejos que reconoce la mitad C-terminal de la proteína Bicc1 humana. Este anticuerpo se utilizó para detectar la proteína Xl-Bicc1 endógena y exógena (Figura 3B). Trabajos anteriores mostraron que la proteína Bicc1 está ausente de los ovocitos de X. laevis , pero se expresa en embriones pre-MBT, antes de que el genoma cigótico esté activo¹⁶. Esto sugiere que si bien el ARNm de Bicc1 se acumula durante la ovogénesis, se reprime traduccionalmente. De acuerdo con este trabajo previo, no se detectó Bicc1 endógeno en ovocitos. Por el contrario, el anticuerpo reconoció Bicc1 endógeno (~MW 107 kDa) en embriones en etapa 7 y 10.5. En conjunto, estos resultados validan que el anticuerpo reconoce la proteína Bicc1 endógena (Figura 3B, panel superior, punta de flecha roja). El anticuerpo Bicc1 reconoció una proteína más pequeña de aproximadamente 70 kDa en extractos preparados a partir de muestras inyectadas con ARNm (Figura 3B, panel superior, punta de flecha negra, compare los carriles 2, 4 y 6 con los carriles 1, 3 y 5). Como control de la especificidad del anticuerpo Bicc1, la membrana se despojó y se volvió a sondear con un anticuerpo contra la etiqueta de afinidad de HA. El anticuerpo HA identificó la proteína de 70 kDa en las muestras inyectadas pero no reconoció el Bicc1 endógeno (Figura 3B, segundo panel, punta de flecha negra). La detección del término C de HA-Bicc1 varía en intensidad entre las etapas debido a las diferencias en la expresión de proteínas del ARNm inyectado en los diferentes tipos de células.

A continuación, ampliamos los resultados probando la expresión de proteínas reguladoras de la traducción endógenas que interactúan con Bicc1. Primero, analizamos la expresión de la subunidad 1 del complejo de transcripción Ccr4-Not (Cnot1), una proteína de andamio grande y parte del complejo Ccr4-Not deadenilasa (CNOT). El complejo CNOT de múltiples subunidades es una de las principales deadenilasas eucariotas y es conocido principalmente por recortar la cola de poli (A) al final de los ARNm mensajeros como preludio de su degradación. Sin embargo, este complejo tiene diversos roles en el control de la traducción que se extienden más allá de la deadenilación²⁹. Estábamos interesados en ensayar la expresión de Cnot1 debido a la importancia del complejo CNOT para la regulación del ARNm y observaciones previas de que Cnot1 interactúa con Bicc1^20,30. Para analizar la expresión de Cnot1, utilizamos un anticuerpo que reconoce la proteína endógena Cnot1. Identificó dos proteínas a 250 kDa y 270 kDa en cada muestra, el tamaño predicho de Cnot1 (Figura 3B, tercer panel). Por lo tanto, este protocolo nos permite identificar fácilmente un componente crítico de un complejo regulatorio. Además, estos datos respaldan la capacidad del protocolo para identificar con éxito proteínas de alto peso molecular.

Para probar aún más la generalización de estos resultados, a continuación analizamos muestras para detectar la presencia de una helicasa de caja muerta prominente involucrada en la represión traslacional, helicasa de caja muerta 6 (Ddx6, anteriormente conocida como xp54 en Xenopus y me31b en Drosophila). Ddx6 es un componente importante de los gránulos de ribonucleoproteína, participa en el almacenamiento de ARNm e interactúa con Bicc1 y Cnot1 ^6,31,32. Un anticuerpo que reconocía el Ddx6 endógeno identificó una proteína de alrededor de 54 kDa en cada muestra (Figura 3B, cuarto panel). La expresión se redujo en embriones cigóticos (Figura 3B, compare los carriles 5 y 6 a 1-4), como se informó anteriormente³³.

Finalmente, para asegurarnos de que las diferencias que observamos entre las muestras se debían a diferencias en la expresión, eliminamos y volvimos a sondear el inmunoblot con un anticuerpo que reconocía la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh). Gapdh sirve como un "control de carga" expresado de manera ubicua. Niveles equivalentes de expresión de Gapdh confirman la tinción de Ponceau: se analiza una cantidad igual de proteína total en todas las muestras (Figura 3B, quinto panel).

En conjunto, estos resultados confirman la eficacia de este método de inmunotransferencia. Pudimos identificar Bicc1 exógeno y endógeno en múltiples etapas de desarrollo de X. laevis relevantes para el estudio de las interacciones ARN-proteína: ovocitos y embriones pre-MBT, que contienen solo ARNm depositados por la madre, y embriones post-MBT, que también incluyen ARNm transcritos cigóticamente. Pudimos generalizar estos resultados analizando la expresión de múltiples proteínas de control de traducción en una variedad de pesos moleculares (Bicc1, Cnot1 y Ddx6) y un control de carga (Gapdh). También mostramos que este protocolo se puede usar para embriones de X. tropicalis con modificación para aumentar la cantidad de material utilizado para tener en cuenta su tamaño más pequeño (Figura complementaria 1).

Figura 3: Identificación de los niveles de proteínas reguladoras de la traducción a través de inmunotransferencia en X. laevis. (A) Tinción de Ponceau del inmunoblot para identificar la proteína total de los ovocitos de X. laevis en estadio VI, embriones en estadio 7 y embriones en estadio 10,5. Cada carril representa el 10% de la proteína preparada a partir de un extracto (0,5 ovocitos o embriones). (B) Análisis de inmunotransferencia de proteínas reguladoras de la traducción de X. laevis seleccionadas en ovocitos en estadio VI, embriones en estadio 7 y embriones en estadio 10,5. Los carriles 2, 4 y 6 corresponden a muestras microinyectadas con ARNm de HA-Bicc1 antes del análisis, mientras que los carriles 1, 3 y 5 sirven como controles negativos (no inyectados). Se utilizó el anticuerpo α-Bicc1 para analizar la expresión de Bicc1 endógeno en todas las etapas (panel superior). Posteriormente, la transferencia se eliminó y se volvió a sondear con un anticuerpo contra la etiqueta de afinidad de HA como control de la especificidad del anticuerpo α-Bicc1 (segundo panel). Las transferencias se eliminaron y se volvieron a sondear en busca de proteínas reguladoras adicionales utilizando α-Cnot1 (tercer panel) y α-Ddx6 (cuarto panel). α-Gapdh (panel inferior) sirvió como control para una carga equitativa de proteínas. Las puntas de flecha rojas marcan la ubicación del Bicc1 endógeno, mientras que las puntas de flecha negras marcan la ubicación del término C HA-Bicc1 expresado exógenamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Análisis de inmunotransferencia de la proteína Bicc1 en Xenopus laevis frente a Xenopus tropicalis. Se utilizó el anticuerpo α-Bicc1 para analizar la expresión de Bicc1 endógeno y exógeno en diferentes cantidades de extracto embrionario de X. laevis y X. tropicalis . Carril 1: 0,5 embriones de X. laevis sin inyectar. Carril 2: 0,5 HA-Bicc1 inyectó embrión de X. laevis . Carril 3: 3 embriones de X. tropicalis sin inyectar. Carril 4: 1 embrión de X. tropicalis sin inyectar. Carril 5: 0,5 embriones de X. tropicalis sin inyectar. Se utilizaron dos anticuerpos que reconocen Bicc1 endógeno: uno elevado contra Bicc1 humano (panel superior) y el otro elevado contra X. laevis Bicc1 (panel central). Se utilizó α-Gapdh (panel inferior) para controlar la carga equitativa de proteínas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aunque es simple en concepto, la inmunotransferencia es difícil en la práctica debido a múltiples pasos que abarcan varios días. Como tal, lograr resultados consistentes y de alta calidad a menudo es un desafío. Sin embargo, la inmunotransferencia es un componente vital y omnipresente de la biología moderna. Por ejemplo, la inmunotransferencia es fundamental para confirmar la traducción y expresión exitosas del ARNm microinyectado en ovocitos y embriones de X. laevis , lo que destaca su importancia para la investigación de X. laevis . Además, los experimentos de inmunoprecipitación utilizan inmunotransferencia para analizar las interacciones proteína-proteína in vivo . La detección eficiente de proteínas específicas dependerá en gran medida de su abundancia y de la calidad de los reactivos de detección de anticuerpos. En este estudio, las concentraciones estimadas de la proteína endógena que analizamos varían casi 500 veces en el huevo de Xenopus (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17.907,26 nM)³⁴, pero todas fueron detectadas fácilmente. Por debajo de este rango, se pueden realizar modificaciones en el flujo de trabajo en prácticamente cada paso de un inmunoblot, desde la recolección de muestras hasta las imágenes, para mejorar la precisión y la eficiencia de la detección, si es necesario.

El tipo de gel y membrana SDS-PAGE que se debe utilizar son consideraciones importantes para cualquier experimento de inmunotransferencia. Según nuestra experiencia, los geles prefabricados son más fáciles y reproducibles que los geles producidos internamente. Los geles prefabricados tienen la ventaja añadida de estar disponibles en formatos degradados en los que los geles aumentan gradualmente la concentración de poliacrilamida de arriba a abajo. Los geles de gradiente permiten a los investigadores resolver y analizar una amplia gama de proteínas con pesos moleculares muy diferentes. De este modo, se evita la típica compensación entre elegir un gel de bajo porcentaje de acrilamida (<7%), que resuelve proteínas de alto peso molecular, frente a un gel de alto porcentaje (>12%), que es mejor para resolver proteínas de bajo peso molecular. También es importante considerar si utilizar una membrana de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF) para la transferencia de proteínas. El mecanismo y las ventajas de cada tipo de membrana se han discutido ampliamente ^35,36. En resumen, el PVDF tiene una mayor capacidad de unión a proteínas (y, por lo tanto, una mayor sensibilidad) que la membrana de nitrocelulosa y es más duradero para el uso repetido. Sin embargo, el PVDF requiere una manipulación adicional en forma de activación por incubación de metanol y es más caro. Si bien encontramos que ambas membranas son adecuadas para la mayoría de las aplicaciones, usamos nitrocelulosa de forma rutinaria debido a consideraciones de costos.

La obtención de imágenes de la inmunotransferencia es un componente crucial del protocolo. Durante este paso, los investigadores deben ejercer su juicio para capturar una imagen de un inmunoblot que transmita toda la información necesaria pero mantenga el ruido de fondo al mínimo. Existen dos métodos principales de imagen para los anticuerpos conjugados con HRP estándar: película de rayos X o sistemas de imágenes digitales. En nuestra experiencia, capturar imágenes con película de rayos X tiene muchos beneficios. Las películas de rayos X son generalmente mucho más sensibles que los sistemas de imágenes digitales, lo que facilita la detección de proteínas de baja abundancia. Las películas de rayos X también producen un registro físico del experimento que se puede anotar y digitalizar en alta resolución. Sin embargo, un sistema de imágenes digitales tendrá un rango lineal muy superior, la relación entre la intensidad de la señal y la intensidad de la imagen, que un revelador de película. Debido a su sensibilidad, una película de rayos X puede sobreexponerse rápidamente, perdiendo información cuantitativa. Por lo tanto, un investigador que busque una cuantificación precisa de sus resultados debe usar un sistema de imágenes digitales o tener especial cuidado de no sobreexponer inmunotransferencias en desarrollo con una película de rayos X.

Si los resultados de inmunotransferencia no son satisfactorios después de seguir el protocolo como hemos descrito, como bandas débiles o "borrosas" en las imágenes, se pueden realizar múltiples ajustes para mejorar el resultado. Por ejemplo, se puede ajustar la cantidad de mezcla de proteínas Xenopus analizada. La proteína total de tan solo una quinta parte de un embrión puede producir resultados sólidos, aunque es posible cargar hasta dos embriones u ovocitos por carril de gel. La carga excesiva de proteínas puede dar lugar a artefactos o señales de fondo espurias durante la obtención de imágenes. Además, la electroforesis a un voltaje más bajo (100 V) durante un tiempo de funcionamiento más largo generalmente conduce a bandas de proteínas más nítidas. Del mismo modo, realizar la transferencia de proteínas durante la noche a 4 ° C a bajo voltaje (30 V) en lugar de una hora a 100 V puede mejorar la detección de proteínas, especialmente para especies de alto peso molecular. Por último, algunas incubaciones de anticuerpos primarios detectan sus objetivos de manera más robusta utilizando incubaciones de 1 hora a temperatura ambiente, en lugar de 4 ° C durante la noche. Esta modificación del protocolo debe probarse para cada anticuerpo primario.

La identificación de anticuerpos para detectar proteínas endógenas presenta un gran desafío para la inmunotransferencia en Xenopus, ya que hay relativamente pocos anticuerpos específicos de Xenopus disponibles comercialmente. Los investigadores pueden beneficiarse de fuentes no comerciales de anticuerpos Xenopus como Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), el Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (https://dshb.biology.uiowa.edu/) y el Centro Europeo de Recursos de Xenopus (https://xenopusresource.org/). Alternativamente, los anticuerpos generados para reconocer proteínas humanas o de ratón pueden ser útiles para detectar proteínas homólogas de Xenopus, dependiendo de la conservación de las regiones utilizadas para la producción de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo Bicc1 presentado en este protocolo se planteó contra la proteína Bicc1 humana. Para tales reactivos, la capacidad de reacción cruzada con las proteínas Xenopus debe determinarse empíricamente. Aunque los epítopos exactos que utilizan las empresas para crear anticuerpos son generalmente patentados, muchos proporcionarán un rango de aminoácidos para el epítopo a pedido. Esta región se puede alinear con la región correspondiente de la proteína homóloga Xenopus. Si bien el éxito no está garantizado, generalmente hemos tenido éxito cuando el epítopo utilizado para la producción de anticuerpos en la especie objetivo exhibe al menos un 75% o más de similitud con el tramo comparable de secuencia en Xenopus. Los anticuerpos generados contra proteínas no Xenopus deben validarse antes de su uso extensivo, ya que la verificación inadecuada de los anticuerpos es un importante contribuyente a la investigación irreproducible^38,39. Esto se puede hacer expresando una proteína Xenopus marcada de interés en embriones a través de microinyección de ARNm⁴⁰. El análisis de las mismas muestras con un anticuerpo hacia la etiqueta de afinidad se utiliza para confirmar que el anticuerpo contra la proteína endógena y el anticuerpo contra la proteína marcada reconocen la misma entidad (como en la Figura 3B).

El análisis de proteínas de unión al ARN, especialmente aquellas con funciones reguladoras como Bicc1, puede resultar un desafío debido a la escasez de reactivos y la baja expresión típica de moléculas reguladoras potentes. Este problema se hace más evidente en la inmunotransferencia, donde cada reactivo debe optimizarse por separado, y puede ser difícil encontrar anticuerpos de suficiente especificidad y sensibilidad. Nuestra intención con este protocolo es abordar las limitaciones específicas de la inmunotransferencia en Xenopus y elaborar pasos aplicables a otros sistemas, de modo que los investigadores puedan superar las dificultades de analizar las proteínas de unión al ARN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Envolvente premium resistente de 100 pies cuadrados	Saran	2570000130
Búfer de Lisis Celular 10x	Tecnología de señalización celular	#9803
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Plato oblongo de 2 cuartos para hornear/servir	Pyrex	71160010116
2x Búfer de Muestra de Laemmli	Bio-Rad	#1610737
Anticuerpo de alta afinidad anti-HA	Roche	11867423001	Preparado según las indicaciones y usado a 1:10.000 de dilución.
Anti-IgG de conejo, anticuerpo vinculado a HRP	Tecnología de señalización celular	7074S	Usado a 1:30.000 de dilución.
Casete de autoradiografía, 5 x 7 pulgadas	Productos de Investigación Internacional	420057	No es necesario si usas un sistema de imagen digital.
Morteros desechables Bel-Art	Millipore Sigma	BAF199230001
Anticuerpo de conejo bicaudal-C (humano)	Envigo Bioproducts (ahora Inotiv)	N/A	Pedido personalizado. Usado a 1:20.000 de dilución.
Anticuerpo de conejo Bicaudal-C (Xenopus)	Envigo Bioproducts (ahora Inotiv)	N/A	Pedido personalizado. Usado a 1:20.000 de dilución. Ref. Park et al., 2016
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A3294	Un sustituto de la leche desnatada en el amortiguador de bloqueo.
Centrífuga 5425	Eppendorf	13-864-456
Película CL-XPosure	ThermoFisher Scientific	34091	No es necesario si usas un sistema de imagen digital.
Anticuerpo monoclonal de conejo CNOT1 (D5M1K)	Tecnología de señalización celular	#44613	Usado con dilución 1:2.000.
DDX6/RCK (D26C11) Anticuerpo monoclonal de conejo	Tecnología de señalización celular	#8988	Se usa a una dilución 1:5.000.
Revelador E-Z Store and Pour	Imagen MXR	103633	No es necesario si usas un sistema de imagen digital.
Tienda E-Z y Fixer	Imagen MXR	114511	No es necesario si usas un sistema de imagen digital.
Anticuerpo monoclonal GAPDH	ProteinTech	60004-1-IG	Usado a 1:40.000 de dilución.
Liberador de gel	Bio-Rad	#1653320
Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra, HRP	Invitrogen	A16066	Preparado según las indicaciones y usado a 1:40.000 de dilución.
Bolsa de hielo, 8 oz, 5 x 3 x 1"	Uline	S-18256
L-Cisteína	Sigma-Aldrich	C7352
Procesador de película médica	Konica Minolta	SRX-101A	No es necesario si usas un sistema de imagen digital.
Mini-PROTEAN  Palanca de apertura de casete	Bio-Rad	#4560000
Mini-PROTEAN  Celda de electroforesis tetra vertical	Bio-Rad	#1658004
Tanque de electroforesis MSE PRO de 700 ml Western Blot	MSE Suministros	BB2369
Membrana de nitrocelulosa, 0,45 y micro; m	Bio-Rad	#1620115
Leche seca desnatada	Sanalac	1570000180
Peroxidasa AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Inmunoresearch	112-035-003	Preparado según las indicaciones y usado a 1:100.000 de dilución.
Polisorbato (Preadolescente) 20	Biorreactivos de Fisher	BP337-500
Ponceau S	VWR Ciencias de la Vida	K793-500ML	Se puede hacer una aproximación con 0,5% Ponceau S y 1% ácido acético
Fuente de alimentación básica PowerPac	Bio-Rad	1645050
Balancín 2D de velocidad variable PR1MA	MidSci	R2D-30
Escalera de Estándares Duales de Proteína Precision Plus	Bio-Rad	#1610374	Se puede usar cualquier escalera de proteínas que elija.
Papel filtro para cromatografía de celulosa pura, 0,35 mm	Fisher Scientific	05-714-4
Restaurar el amortiguador de desmontaje de Western Blot	ThermoFisher Scientific	#21059
Cloruro de sodio	Fisher Chemical	S640-10
Caja de almacenamiento 300 mL	Rosti Mepal	RST46608	Para bloqueo de membranas de nitrocelulosa, incubación de anticuerpos y lavados
Sustrato de máxima sensibilidad de SuperSignal West Femto	ThermoFisher Scientific	#34094	Un sustrato quimioluminiscente (ECL) mejorado que contiene dos componentes: luminol y potenciador. Este reactivo ECL tiene una baja sensibilidad al femtograma.
Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico PLUS	ThermoFisher Scientific	#34580	Un sustrato quimioluminiscente (ECL) mejorado que contiene dos componentes: luminol y potenciador. Este reactivo ECL tiene una sensibilidad de picogramo a femtograma.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4– 12%, 10 pozos de geles de poliacrilamida	GenScript	M00652
Polvo de Transferencia Buffer	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiological	77-86-1
Tris-MOPS-SDS Pólvora de Amortiguador de Funcionamiento	GenScript	M00138