Artículo de método

Imagen Molecular Espacial del Glycome mediante espectrometría de masas

1.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 de noviembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla los pasos clave para permitir una medición rigurosa y reproducible tanto del glucógeno como de los glicanos N-linked mediante imagen por espectrometría de masas.

Resumen

La organización espacial del glycome dentro de los tejidos es clave para la base molecular de la función fisiológica. El glycome diverso y dinámico es fundamental para procesos celulares fundamentales, incluyendo el metabolismo, la señalización y la adhesión. Las innovaciones en biología espacial han abierto nuevas vías para la imagen molecular espacial de diversas clases de glycome. Aquí describimos un protocolo optimizado para la imagen biomolecular espacial del glycome en hígado de ratón recién congelado. El flujo de trabajo comprende (1) extracción rápida y congelación, (2) corte criográfico en grosor y posición óptimos, (3) preparación tisular y digestión enzimática en tejido utilizando enzimas activas en carbohidratos, (4) aplicación matricial y adquisición de datos mediante desorción láser/espectrometría de masas asistida por matriz (MALDI-MSI), y (5) procesamiento y visualización de datos para situar los hallazgos en un contexto biológico. El uso de este enfoque permite la adquisición de mapas espaciales detallados de glicanos N-ligados y glucógeno, revelando características fisiológicas y celulares clave. Estos datos permiten definir la heterogeneidad glicómica espacial clave asociada con la función y disfunción hepática. Este flujo de trabajo permite una glicómica espacial altamente reproducible y sensible del hígado del ratón. Además, es fácilmente adaptable a otros tejidos o especies, facilitando nuevos conocimientos espaciales sobre la biología de los glicómos en salud y enfermedad.

Introducción

El campo de la biología espacial está en rápida expansión, proporcionando conocimientos clave sobre la complejidad biomolecular espacial dinámica de los organismos vivos. Se están empleando múltiples enfoques para estudiar biomoléculas distintas en un contexto biológico. Aunque algunas son técnicas altamente especializadas, la espectrometría de masas (EM) ha surgido como una técnica general importante para cuantificar una amplia gama de biomoléculas en el contexto de células, tejidos u organismos.

La Imagen por Espectrometría de Masas por Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI-MSI) es una de las técnicas generales emergentes para la imagen multiómica de biomoléculas espaciales. Inicialmente se estableció para la visualización de proteínas y péptidos en rebanadastisulares 1. Desde entonces, se ha extendido a muchas muestras y moléculas biológicasdiversas 2. La técnica puede aplicarse a muestras celulares3, organoides4, animalesmodelo 5 y muestrasde pacientes 6,7. Algunas clases moleculares pueden medirse directamente mediante enfoques basados en MSI, incluyendo muchos metabolitos y lípidos, mientras que otros tipos de biomoléculas más complejas, como proteínas y glicanos, requieren tratamiento enzimático o químico para ser adecuadas para la detección basada enMSI 2,8.

MALDI-MSI también se ha aplicado al análisis espacial de glicanos N-ligados y glucógeno, utilizando flujos de trabajo que requieren procesamiento enzimático para producir fragmentos de glicano adecuados para la detección deMSI 9,10,11,12,13,14,15. Los N-glicanos se separan del residuo de asparagina de proteínas con PNGasa F, y las cadenas de glucosa de glucógeno se escindiran con isoamilasa. Las principales ventajas del análisis de glucógeno MALDI son que proporciona una definición espacial de la distribución del glucógeno en la muestra biológica, cuantificación relativa e información sobre la ramificación de las cadenas de glucosa. Dado que tanto los flujos de trabajo de N-glicano como de glucógeno requieren el procesamiento enzimático de la muestra para el análisis de MSI, se han combinado en un flujo de trabajo integrado para el análisis de glycome (Figura 1A). Este flujo de trabajo requiere una preparación cuidadosa de muestras biológicas y un procesamiento específico para permitir el análisis del glucóma mediante EM, seguido de la adquisición y procesamiento de datos. Aunque el flujo de trabajo requiere una serie de pasos especializados, produce datos espaciales de glycome ricos y de alta calidad, altamente reproducibles y que pueden adaptarse a muchos tipos diferentes de muestras16. Además, el flujo de trabajo es modular, de modo que los pasos de procesamiento de muestras pueden ser realizados por laboratorios de investigación independientes antes de la presentación de las muestras a instalaciones especializadas que realizan los últimos pasos de adquisición y análisis de datos MALDI-MSI.

Protocolo

Esta investigación se realizó en cumplimiento con las directrices del comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Florida. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extracción del hígado

  1. Eutanasia y disección animal
    1. Realizar una luxación cervical y decapitación para eutanasiar al ratón (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados).
      NOTA: Para este ejemplo, se utilizó un ratón salvaje tipo C57BL/6J de 6 meses. A esta edad, los ratones pesan entre ~25 y 33 g. Una amplia gama de edades, tamaños y cepas son muy adecuadas para este análisis.
    2. Coloca inmediatamente al animal sobre una almohadilla absorbente y expone la cavidad abdominal usando un bisturí estéril.
    3. Con pinzas y tijeras estériles, aísla el hígado con la mínima manipulación y daño tisular.
      NOTA: Los cambios metabólicos ocurren rápidamente. Evite la perfusión o sedación si es posible, y asegúrese de que los pasos de disección se realicen lo más rápido posible17.
  2. Lava y limpia rápidamente el pañuelo.
    1. Sumerge suavemente el hígado en 1x solución fisiológica con fosfato (PBS) para eliminar cualquier sangrado.
    2. Sumerge el tejido en agua desionizada (DI) dos veces.
    3. Seca el exceso de agua tocando suavemente el pañuelo sobre un limpiaparabrisas limpio.
      NOTA: Las muestras más grandes que las que caben en un portaobjetos estándar de microscopio deben cortarse en pedazos antes de congelarse.
  3. Congelación de muestras
    1. Coloca el hígado limpio directamente en un pesador desechable de poliestireno preenfriado flotando sobre nitrógeno líquido.
    2. Una vez que el pañuelo cambia de color a un opaco brillante, aproximadamente 3 minutos, coloca el pañuelo en sobres de papel de aluminio prefabricados y etiquetados sobre hielo seco.
    3. Coloca los sobres de papel de aluminio junto con las muestras en un congelador a -80 °C para su almacenamiento. Las muestras pueden almacenarse a largo plazo a -80 °C.

2: Preparación de una muestra biológica

  1. Preparación para la criosección
    1. Asegúrese de que el criostato esté encendido y equilibrado a una temperatura adecuada para el tejido, entre -16 °C y -20 °C. La temperatura exacta dependerá del tipo de tejido. El hígado debe seccionarse a una temperatura ligeramente más cálida, aproximadamente entre -16 °C y -17 °C, para evitar desgarros en el tejido, mientras que otros tejidos deben seccionarse a -20 °C.
    2. Asegúrate de que haya al menos dos mandris, dos pinceles finos, unas pinzas finas y un inserto de cristal de 70 mm a la temperatura del crióstato. Además, etiqueta las lápices con lápiz antes de colocarlas en el criostato para aclimatarlas.
    3. Transfiere el tejido del congelador a -80 °C al criostato sobre hielo seco.
    4. Deja que los tejidos se aclimaten a la temperatura del criostato durante al menos 30 minutos.
    5. Asegúrate de que no haya daños en el borde del inserto de cristal y que esté liso donde el tejido se encontrará con la guía anti-rollo pasando un dedo enguantado por el borde.
    6. Coloca el inserto de cristal en la guía anti-balanceo.
    7. Toma una hoja de perfil bajo y deslízala con cuidado en el portahojas abierto, y cierra el portahojas. Coloca la protección roja de la hoja sobre la hoja hasta que se seccione.
    8. Monta el pañuelo sobre el mandril usando un medio de montaje M1, que es compatible con MS. Coloca el medio de montaje M1 a temperatura ambiente sobre el mandril dentro del criostato, cubriendo al menos dos anillos para que el tejido quede fijado.
      NOTA: El compuesto a temperatura óptima de corte (OCT) se utiliza a menudo en criosección; sin embargo, provoca supresión de iones en aplicaciones de MS y debe evitarse. Si se debe usar OCT, entonces se debe emplear un protocolo adicional de varios pasos para minimizar o eliminar el OCT. Además, algunos centros de recursos de MS no analizan muestras que estaban incrustadas en OCT.
    9. Toma unas pinzas frías y retira el papel de tela del papel de aluminio. Usa las pinzas para colocar el papel sobre el mandril en la orientación deseada.
    10. Coloca el mandril en el criostato para que el material de montaje se congele, aproximadamente 2 minutos. Una vez congelado, se endurecerá y parecerá opaco.
  2. Criosección de tejido hepático
    1. Coloca el mandril con el papel de seda montado en el portamandillas. Coloca el mandril de modo que el tejido corte en un ángulo de 90° respecto a la hoja.
    2. Retrae el portamandril hasta que el tejido no tenga contacto con la hoja. Introduce lentamente el mandril hasta que el tejido esté justo al lado de la hoja para comenzar a seccionar.
    3. Comienza a seccionar con una franja de 30 μm de grosor para eliminar el tejido no deseado.
    4. Asegúrate de que la profundidad de la placa de rollo crea una sección lisa y que el papel de seda no se enrolle sobre la placa enrollable. Si es así, afloja un poco la placa de rodaje. Si el tejido mueve la placa de rodillo y la golpea una segunda vez al reiniciar la rotación, entonces aprieta ligeramente la placa de rodillo.
    5. A medida que se acerca la sección deseada, disminuye el grosor previsto de la rebanada a 10 μm, u otro espesor deseado adecuado para la aplicación específica.
    6. Completa 10 vueltas para que el mandril tenga el grosor correcto y evitar que se replieguen y se desnivelen.
    7. Usa un pincel frío para limpiar el escenario en preparación para el seccionado. Cierra la placa enrollable sobre la hoja y toma lentamente una sección del pañuelo.
    8. Levanta la placa enrollable y usa los dos pinceles fríos y finos para alejar suavemente la sección de la hoja. Tira de la sección hacia un lado del escenario para facilitar el montaje en la corredera.
    9. Toma una lámina fría de un portaportaobjetos en el criostato y coloca un dedo índice en el lado opuesto de la lámina respecto a donde el tejido estará durante 10 segundos.
    10. Coloca suavemente el deslizador sobre el pañuelo y levántalo de nuevo. No presiones fuerte, ya que esto dañará el tejido. El tejido debe fundirse sobre la lámina y volverse translúcido.
    11. Transfiere rápidamente las láminas a un desecador para que se sequen. Seca la lámina en el desecador durante 1 hora.
    12. Tras el secado, las láminas pueden procesarse directamente para la MS o sellarse al vacío y almacenarse a -80 °C.

3. Preparación de láminas para MSI de glucómicos

  1. Preparación de enzimas
    NOTA: Se puede comprar y utilizar directamente PNGasa liofilizada baja en sal preparada para MS.
    1. La isoamilasa requiere diálisis para eliminar el exceso de sal en aplicaciones en EM. Prepara uno o más vasos de diálisis colocándolos en agua HPLC durante 15 minutos.
    2. Diálise 200 μL de isoamilasa de stock usando una copa de diálisis de 500 μL en 14,3 mL de agua HPLC durante 2 horas a 4 °C, sin remover el alcohol. Sustituye los 14,3 mL de agua HPLC por agua HPLC fresca y diálisa durante 16 horas adicionales (durante la noche) a 4 °C. Sustituye los 14,3 mL de agua HPLC por agua HPLC fresca y diálisa durante 8 horas adicionales a 4 °C.
    3. Retira suavemente la isoamilasa de la copa con una pipeta y colócala en un tubo microcentrífuga de 1,5. Mide el volumen total de la solución de isoamilasa tras la diálisis (en μL). A partir de la actividad inicial del stock, típicamente 200 unidades/mL, y el volumen final, se calcula el volumen total necesario para 3 unidades de isoamilasa.
    4. Alicotas de pipeta de 3 unidades de isoamilasa en tubos PCR de pared fina. Haz tubos de congelación rápida en nitrógeno líquido. Guarda a -80 °C. Se puede usar un tubo de solución de isoamilasa dializada para cada protocolo de pulverización, lo que es suficiente para cuatro láminas. Evita los ciclos de congelación/descongelación para mantener la actividad enzimática.
  2. Fijación y lavado de tejido
    1. Coloca las láminas en un portaobjetos y sumerge en un recipiente de cristal lleno de formalina amortiguada neutra al 10% (NBF) durante 1 hora.
    2. Quita las diapositivas del NBF. Sumerge las láminas en etanol al 70% durante 2 horas.
    3. Prepara cuatro tarros de Coplin que contienen 70%, 80%, 90% y 100% etanol. Etiqueta cada tarro claramente para evitar confusiones durante el lavado secuencial.
    4. Transfere progresivamente las láminas de la siguiente manera: 70% etanol durante 5 minutos, 80% etanol durante 5 minutos, 90% etanol durante 5 minutos, 100% etanol durante 5 minutos.
    5. Transfiere las láminas a una placa de Petri de cristal llena de xileno fresco al 100%. Asegúrate de que los toboganos estén completamente sumergidos. Incuba las láminas en un agitador a 70 rpm durante 1 hora, dependiendo del contenido lipídico del tejido. Repite este paso dos veces más usando xileno fresco en cada lavado.
      NOTA: Este protocolo está diseñado para permitir la máxima delipidación, ya que se sabe que los lípidos provocan supresión de iones y, por tanto, máxima reproducibilidad. Sin embargo, esto resulta en la deslocalización de señales, disminuyendo así la resolución que se puede obtener. La reducción de pasos de lavado, la limitación del tiempo de procesamiento y un control cuidadoso de la humedad pueden disminuir la deslocalización y, por tanto, mejorar la resolución de datos.
    6. Coloca los portaobjetos en un desecador durante la noche para que se sequen.
    7. Coloca las láminas en etanol al 70% durante 1 minuto para rehidratar. Coloca los tobogáns en agua DI durante 3 minutos. Repite el lavado con agua DI con agua DI fresca.
    8. Seca las láminas en un desecador durante 10 minutos, o hasta que estén completamente secas.
  3. Preparación de láminas para la aplicación de enzimas
    1. Prepara una cámara de humedad HTX para incubación colocando una toalla de papel empapada en agua DI debajo de la rejilla metálica. Coloca la cámara en una incubadora a 37 °C.
    2. Prepara un vaporizador llenando el depósito de agua hasta arriba con agua del grifo. Pon el temporizador a 60 minutos para encender la unidad.
    3. Preparar el tampón citracónico añadiendo 50 mL de agua de grado HPLC, 25 μL de anhídrido citracónico y 2 μL de 12 M HCl a un tubo Falcon de 50 mL. Haz un vórtice en la solución durante 10 segundos para mezclar bien. Cada tubo centrífugo de 50 mL de buffer citracónico es suficiente para cuatro portaobjetos. Verifica que el pH de la solución sea 3,0 (rango aceptable: 2,5-3,5).
    4. Llena cada correo con el buffer citracónico preparado. Coloca la lámina con el tejido mirando hacia dentro para evitar que el tejido toque los laterales y permitir una extracción eficaz de antígenos. Se pueden usar dos diapositivas por cada envío, utilizando las dos posiciones de los bordes, con ambos deslizamientos con tejidos orientados hacia dentro.
    5. Verifica que el vaporizador de alimentos emita vapor. Coloca los carteros en la vaporizadora y incuba durante 30 minutos.
    6. Transfiere los envíos a un baño María DI durante 5 minutos. Sustituye la mitad del buffer citracónico del malle por agua DI y déjalo reposar otros 5 minutos. Repite esta dilución dos veces más.
    7. Retira todo el disolvente y lava las láminas añadiendo agua 100% DI al correo y luego retirando el agua DI. Con una toallita de laboratorio, seca en zonas donde no haya tejido.
    8. Dibuja un círculo y un triángulo en la parte trasera de cada diapositiva para marcar las ubicaciones internas estándar. Aplica 1 μL de 1 mg/mL de peroxidasa de rábano picante (HRP; círculo) y 1 μL de 10 mg/mL de glucógeno hepático de conejo (triángulo) en la parte frontal de la lámina.
    9. Coloca los portaobjetos en el desecador durante 15 minutos para que se sequen completamente.
  4. Fumigación enzimática y digestión
    1. Retirar un tubo de 100 μg de PNGasa liofilizada F (500 unidades/μg) y un tubo de 3 unidades de isoamilasa y dejar que se descongele durante 10 minutos. Tubos de centrifugación a ~2000 x g durante 5 s en un tubo de microcentrífuga. Esta enzima es suficiente para pulverizar 4 láminas.
    2. Pipetear 50 μL de agua DI en cada tubo F de la PNGasa liofilizada, hacer un vórtice suavemente durante 10 segundos y centrifugar un microfuge a ~2000 x g durante 5 segundos. Pipetear la solución de 50 μL PNGasa F directamente en el tubo de isoamilasa. Añadir agua HPLC a un volumen final de 1 mL.
    3. Aplica el tubo microcentrífuga de doble enzima 10 s y centrifuga a ~2000 x g durante 5 s.
    4. Enciende el pulverizador HTX M5 y abre el software HTX M5. Asegúrate de que el tipo de bandeja esté configurado en Ambiente en la pestaña Sistema .
    5. Apaga la bomba Knauer pulsando el botón de parada en la parte delantera derecha. Enciende la bomba de jeringuilla externa usando el interruptor en su panel trasero.
    6. En el software HTX, en la pestaña Métodos , selecciona el método adecuado para la pulverización con doble enzima. Los parámetros deben ajustarse a una temperatura de tobera de 45 °C, 15 pasadas, caudal de 0,025 mL/min, velocidad de 1200 mm/min, separación de vía de 3 mm, patrón CC, presión ajustada a 10 psi, caudal de gas de 3 L/min y altura de la tobera de 40 mm.
    7. Ve a la pestaña de Temperatura y ajusta la temperatura de la boquilla del pulverizador a 45 °C. Usa una llave inglesa para mover la línea del pulverizador al conector superior.
    8. Abre la válvula de gas nitrógeno de ultra alta pureza y asegúrate de que la presión del pulverizador sea de 10 psi. En la bomba de jeringuillas, ajusta el caudal a 95 μL/min.
    9. Usando una jeringuilla y aguja nuevas, llena con 4 mL de agua HPLC. Quita todas las burbujas. Haz pasar 2 mL de agua por una sección de ~6 pulgadas de la línea del pulverizador hasta un vaso de desechos.
    10. Conecta la jeringuilla a la línea del pulverizador y haz pasar agua por la bomba de jeringuilla arrancando y funcionando a 95 μL/min durante 5 minutos.
    11. Mientras enjuagues la bomba de jeringuilla, pega las correderas en la esquina inferior izquierda de la bandeja calefactada usando una guía metálica de alineación para asegurar que el tejido quede dentro de la zona de pulverización. En la pestaña de Muestra , define los parámetros X e Y para la región de pulverización, permitiendo un ligero exceso de pulverización para asegurar una cobertura completa del portaobjetos.
    12. Después de 5 minutos, pausa la bomba, desconecta la jeringuilla, aspira aire y luego empuja aire a través de la línea del pulverizador para purgar cualquier agua residual. Repite según sea necesario.
    13. Carga la solución de doble enzima en una nueva jeringuilla y conéctala a la bomba, asegurándote de que no queden burbujas.
    14. Conecta la jeringuilla a la línea del pulverizador. En la bomba de jeringuilla, ajusta el caudal a 25 μL/min.
    15. Cuando la boquilla de pulverización alcance los 45 °C, pulsa Start en la pestaña Ciclo . Haz clic en No cuando te pidan que encendas la bomba Knauer. Pulsa Start en la bomba de jeringuilla para comenzar el spray.
    16. Coloca una lámina en blanco bajo la boquilla del pulverizador para confirmar la deposición visible de la enzima en spray. Una vez observado, haz clic en Continuar en el software, coloca la tapa de cristal sobre el pulverizador y controla la aplicación uniforme, según indica un humectamiento uniforme.
    17. Cuando termine el ciclo de pulverización, pulsa stop en la bomba, apaga el gas nitrógeno y haz clic en Confirmar carga de válvulas. Limpia la línea y la etapa del pulverizador y apaga el pulverizador, asegurándote de que la bomba Knauer vuelva a funcionar.
    18. Incubar las láminas en la cámara de humedad HTX a 37 °C durante 2 horas, colocando las láminas hacia arriba. Una vez terminado, coloca los deslizadores en el desecador durante 15 minutos. Las láminas pueden permanecer en el desecador durante la noche, o el protocolo puede continuar.
  5. Preparación y aplicación de matrices MALDI
    1. Antes de la aplicación de la matriz, toma una imagen óptica de la lámina usando un escáner.
    2. Peso 40 mg de CHCA sólido en un tubo cónico de 15 mL. Disuelva el polvo de CHCA en una solución de ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo al 50% (ACN) a una concentración de 7mg/mL.
    3. Sonica la solución matricial durante 10 minutos usando ciclos de 90 s encendidos y 30 segundos apagados. Repite estos pasos 5 veces para asegurar la disolución completa y la homogeneidad.
    4. Enciende el pulverizador HTX M5 y abre el software HTX M5. Abre la válvula de gas nitrógeno y ajusta la presión del sistema a 10 psi.
    5. En el software HTX, en la pestaña Métodos , selecciona el método adecuado para la pulverización de matriz CHCA. Parámetros ajustados a una temperatura de tobera de 79 °C, 10 pasadas, caudal de 0,1 mL/min, velocidad de 1300 mm/min, separación de vía de 3 mm, patrón CC, presión fijada a 10 psi, caudal de gas de 3 L/min y altura de la tobera de 40 mm.
    6. Navega a la pestaña de Temperatura , pon la temperatura de la boquilla del pulverizador a 79 °C. Bajo la pestaña de Bomba , ajusta el caudal a 100 μL/min.
    7. Pega las correderas en la esquina inferior izquierda de la bandeja calefactada usando una guía metálica para asegurar una alineación correcta en la zona de pulverización. En la pestaña de Muestra , define los parámetros X e Y para la región de pulverización, permitiendo un ligero exceso de pulverización para asegurar una cobertura completa del portaobjetos.
    8. Usa una jeringuilla desechable y una aguja para extraer 5,5 mL de 50% de ACN (quita burbujas).
    9. Pon el pulverizador en modo CARGA . Inserta la jeringuilla de ACN e inyecta el ACN. Retira la jeringuilla ACN y cámbiala inmediatamente por una nueva que contenga 5,5 mL de solución filtrada de CHCA, inyectando asegurándose de evitar burbujas. Pon el pulverizador en modo SPRAY .
    10. Cuando la boquilla del pulverizador alcance los 79 °C, pulse Start en la pestaña de Ciclo . Haz clic en Sí cuando te lo pidan.
    11. Usa una lámina de prueba en blanco y colócala debajo de la boquilla del pulverizador. Para confirmar la deposición de pulverización en matriz visible, se encontrará una deposición en matriz amarilla en el portaobjetos. Una vez observado, haz clic en Continuar, coloca la tapa de cristal sobre el instrumento y controla la consistencia del spray. Un spray constante producirá una lámina con opacidad uniforme.
    12. Cuando termine el ciclo de pulverización, configura el pulverizador en modo LOAD y haz clic en Confirmar carga de válvulas.
    13. Limpia el pulverizador poniendo la bomba a 300 psi y bajando la temperatura a 30 °C. Absorbe y empuja por la línea 5 mL de acetonitrilo al 50% dos veces y 5 mL de metanol al 50% dos veces. Limpia el escenario con metanol 100%. Cuando la temperatura alcanza los 30 °C, cambia a LOAD, apaga el gas, apaga el pulverizador y asegúrate de que la bomba de Knauer vuelva a encenderse.
    14. Coloca las láminas en el desecador durante 15 minutos hasta que la matriz esté completamente seca. Las diapositivas deben ejecutarse lo antes posible tras la pulverización, en un plazo máximo de 14 días, para garantizar una recogida fiable de datos con la adecuada relación señal-ruido.

4. Recogida de datos de glucomas MALDI-MSI

  1. Preparación para la recogida de datos
    1. Asegura la corredera en el portamuestras del instrumento MALDI con el adaptador de corredera. Inserta el portamuestras en el MS y asegúrate de que esté correctamente colocado para la imagen.
    2. Abre el software flexImaging e importa la imagen óptica de la diapositiva previamente grabada, véase el paso 3.4.1. Si es necesario, calibra la alineación de la imagen con la etapa del instrumento para que las secciones de tejido y los puntos estándar estén correctamente posicionados para la selección de la región.
    3. Define las regiones de imagen para las secciones de tejido, el estándar HRP, el estándar de glucógeno y el cuadrado de la matriz de control en el software. Describe cada una como una región separada.
    4. Ajusta el tamaño del paso del ráster a 50 μm, lo que da una resolución de píxel de 50 × 50 μm.
    5. En el software de control de instrumentos, selecciona el modo MS de iones positivos y ajusta el rango de escaneo a m/z 500 - 4000 con un corte de baja masa de 700,00 m/z.
    6. Carga el conjunto de parámetros de afinación de imagen MALDI preoptimizado en el software de control de instrumentos (o introduce los valores manualmente si es necesario). Verifica que las tensiones de la fuente y de los iones ópticos estén ajustadas a los valores especificados: Desplazamiento de placa MALDI 50,0 V; Deflexión 1 Delta 70.0 V; Funnel 1 RF 500.0 Vpp; Funnel 2 RF 500.0 Vpp; Multipolo RF 500.0 Vpp; Energía iónica 5.0 eV. Confirma la celda de colisión y los ajustes de temporización del TOF: Energía de colisión 10.0 eV; Collision RF 4000.0 Vpp; Tiempo de transferencia 180,0 μs; Almacenamiento previo al pulso 25,0 μs.
    7. Confirma la configuración del láser en la pestaña Láser. Selecciona Imaging 50 μm como la opción predeterminada.
    8. Calibra el espectrómetro de masas usando una mezcla de calibrantes externa como la mezcla de afinación. Introduce el calibrante y ejecuta la rutina de calibración del instrumento. Ajusta la calibración para que el error de precisión de masa esté dentro del 0,001% y la puntuación de precisión de calibración sea del 100%.
    9. Configura la adquisición para realizar una ráfaga de 320 disparos láser a la frecuencia de 10.000 Hz. La atenuación láser debe ajustarse al 37% para mantener la intensidad de la señal dentro del rango dinámico óptimo. Ajusta los disparos láser y la atenuación según sea necesario.
    10. Utiliza la función automatizada de alineación del haz del instrumento, el ajuste del perfil del objetivo y el ajuste de enfoque para asegurarte de que el láser se enfoca correctamente en la muestra. En una zona fuera del tejido, ejecuta el ajuste automático del haz bajo la pestaña Láser en el software de control para alinear el láser con la óptica iónica. Esto garantizará que el láser y la etapa se ajusten para una recogida óptima de datos. Finalmente, ejecuta la generación de perfiles de objetivo y ajustes de ajuste de foco en la pestaña de portadora de muestra.
    11. Confirma que los puntos estándar internos producen los picos de iones esperados, indicando la preparación para la recogida de datos. La HRP debería tener un pico prominente de glicanos en 1211,42. El glucógeno debería haber espaciado regularmente picos prominentes, con picos de mayor intensidad en 1013,32, 1175,37 y 1337,43.
      NOTA: Si se identifican problemas de intensidad, revisa la configuración láser. Si se identifican problemas con una precisión masiva, revisa la calibración.
  2. Recogida de datos MALDI-MSI
    1. Inicia la adquisición de imágenes MALDI-MS para las regiones definidas haciendo clic en el botón Inicio en el software de imagen. El instrumento rasterizará automáticamente el láser sobre cada región definida a intervalos de 50 μm, adquiriendo un espectro MS1 de iones positivos (m/z 500-4000) en cada píxel. El tiempo típico de recogida de datos para una sección hepática a esta resolución es de 135 minutos.
      NOTA: Tras la ejecución, el instrumento guardará automáticamente los espectros de cada píxel adquirido, creando una carpeta .d con los datos en bruto.

5. Análisis de datos MALDI-MSI

  1. Importación y exportación de datos
    1. Importa el conjunto de datos en SCiLS Lab, o en un software de análisis MSI equivalente, para visualizar mapas de intensidad iónica del glycome a lo largo de las secciones del tejido.
    2. Abre el laboratorio SCiLS. Seleccionar Nuevo. Selecciona el archivo .mis de la ejecución MALDI.
    3. Una vez que se abra el archivo .mis en SCiLS, haz clic en Siguiente. Seleccione rango automático para rango m/z. Selecciona el eje automático para Parámetros del Eje. Selecciona el tamaño absoluto del contenedor. Haz clic en Siguiente y luego en Importar. Selecciona la carpeta donde se guardará el archivo.
    4. Una vez finalizada la importación, abre el nuevo archivo .slx.
    5. Haz clic en archivo, Importar y selecciona la opción de lista de funciones desde archivo. Importa anotaciones de glycome y crea imágenes de iones yendo al panel de la lista de características, seleccionando la lista correcta y haciendo clic en el botón de crear imágenes de iones.
      NOTA: Hay listas de características robustas para N-glicanos16, 18, 19 y glucógeno13.
    6. Normaliza los datos, según corresponda. El recuento total de iones (TIC) es la normalización más utilizada.
    7. Una vez cargadas las imágenes iónicas, revisa la lista de características y asegúrate de integrar correctamente los picos, ajustando manualmente para aquellas características en las que el pico no esté completamente integrado. Para ajustar, haz clic izquierdo en el pico mientras mantienes mantenido shift. Una vez que el pico esté integrado, pulsa control y barra espaciadora en el teclado. Esto generará una nueva imagen iónica para el pico ajustado.
    8. Tras repetir el resto de la lista de características, dentro del panel de imágenes de Ion, selecciona la lista de Guardar características, nombra la lista y haz clic en Guardar.
    9. Ve a la tabla de archivos, características y abre la tabla de listas de características que acaba de guardar. Ordena por m/z. Las características ajustadas aparecerán con una celda vacía en la columna de nombre. Renombra los picos ajustados copiando y pegando el nombre y eliminando el pico original seleccionando el botón de eliminar fila seleccionada de la lista de características, situado en la parte superior central de la tabla de características.
    10. Tras ajustar todos los nombres, se obtiene una lista final anotada de picos. Haz clic en el botón de añadir intensidad que está cerca del botón de eliminar. A partir de aquí, selecciona las muestras de interés para exportar la intensidad media de las características anotadas de cada región imaginada.
    11. Asegúrese de seleccionar el modo de procesamiento del intervalo de área pico y el recuento total de iones para la normalización. Haz clic en OK. Aparecerán nuevas columnas con los datos correspondientes. Para exportar los datos, selecciona la flecha que apunta hacia afuera y guarda como .csv.

Resultados

Un procesamiento cuidadoso de un hígado de un ratón de tipo salvaje, incluyendo el corte de una sección transversal completa (Figura 1A), permitió definir el glycome por MALDI-MSI, con diversos oligosacáridos derivados de glucógenos y glicanos N-ligados en un rango de m/z (Figura 1B). El glucógeno estaba ampliamente localizado en los hepatocitos hepáticos y carecía de vasos vasales y tejido conectivo en los tractos porta, como era de esperar (Figura 1C,D). Es importante destacar que los datos MALDI-MSI permitieron medir tanto la distribución espacial del glucógeno como la distribución de la longitud de la cadena, una característica clave del glucógeno en el metabolismo normal y los estados patológicos (Figura 1D). Además, diversos glicanos ligados a la N presentan diferentes organizaciones. La distribución espacial observada varía desde una amplia distribución en hepatocitos (Figura 1E) hasta focos regionales, consistente con la organización sinusoidal del hígado (Figura 1F), pasando por el marcado específico de elementos del tracto portal (Figura 1G-I).

figure-results-1
Figura 1: Análisis MALDI-MSI del hígado del ratón. (A) Esquema para métodos críticos en la preparación de muestras, adquisición de datos y análisis. (B) Muestrear espectros de masas derivados del enfoque. Las flechas en rojo demuestran los oligosacáridos regularmente espaciados derivados del glucógeno, que difieren por un monosacárido de glucosa. Las flechas en azul indican los N-glicanos, que se encuentran distribuidos a lo largo de los espectros. En el hígado, los picos de glucógeno suelen ser más prominentes, especialmente en valores m/z más altos. (C) Distribución espacial de la maltohexaosa (DP6) derivada del glucógeno en el hígado. (D) Distribución de las longitudes de las cadenas de glucógeno en el hígado. (E-G) Distribución espacial de diferentes especies de glicanos N-linked en el hígado. (H) Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para una región central enfocada, junto con anotaciones anatómicas. (I) Recuadro enfocado correspondiente que muestra la localización espacial de glicanos N-enlazados adicionales (Hex5dHex1HexNAc5) en elementos del tracto portal. Barras de escala: 500 μm. Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

MALDI-MSI es una herramienta emergente para la biología espacial de los glycomes. Es importante destacar que, aunque este protocolo se centra en la recogida de datos usando hardware específico, puede adaptarse fácilmente a plataformas MALDI-MSI de variosproveedores 13. El procesamiento de muestras es idéntico hasta el método 4, aunque algunos proveedores pueden requerir el uso de diapositivas especializadas. Las modificaciones en la recogida de datos, utilizando parámetros específicos de la plataforma MALDI-MSI, permiten una rápida adaptación de este protocolo. Se puede utilizar software específico para el procesamiento de datos, como se detalla en el paso 5, o, alternativamente, se pueden emplear plataformas para un procesamiento riguroso y reproducible de datosMALDI-MSI 19.

MALDI-MSI es una herramienta especialmente útil para entender la biología, ya que diferentes órganos, tejidos y células tienen patrones distintos para su glucoma. El hígado es muy adecuado para el análisis de glicómos porque tiene altos niveles de glucógeno y diversos glicanosN-ligados 13. Otros órganos tienen niveles y diversidad más altos de glicanos ligados a la N, y niveles más bajos deglucógeno 13. Es importante destacar que el glycome varía en diferentes órganos según el estado metabólico y de enfermedad del organismo, por lo que el glycome proporciona una fuente rica de información biológica 5,14,15,20. El desarrollo continuo de enzimas únicas activas en carbohidratos para el análisis MALDI-MSI promete extender el análisis de glicómos a biomoléculas ortogonales adicionales en el glucóma.

Aunque tiene muchas ventajas, MALDI-MSI está actualmente limitado en resolución en comparación con otras herramientas utilizadas en biología espacial. Este protocolo utilizaba la recogida de datos con resolución de 50 μm. Aunque son excelentes para el análisis fisiológico, los datos a resolución de célula única avanzarían significativamente el campo21. En particular, la deslocalización puede ser una barrera significativa para aumentar la resolución en metodologías que utilizan pulverización enzimática y posterior incubación en condiciones húmedas. Los avances recientes en hardware de procesamiento de muestras, metodologías de manipulación de muestras, hardware de adquisición de datos, el uso de etiquetado selectivo y el procesamiento de datos están permitiendo que la recopilación de datos MALDI-MSI se acerque a la resolucióncelular 22,23. Sin embargo, existen compensaciones entre resolución y relación señal-ruido y limitaciones inherentes basadas en los métodos actuales de preparación de muestras para MALDI que deben considerarse. Aplicaciones muy específicas ya están logrando el objetivo de MALDI-MSI resuelto por célula única utilizando innovaciones tanto en procesamiento de muestras24 como en algoritmos novedosos, lo que sugiere que las soluciones generales a estos problemas están al alcance 25,26,27.

Tras la recogida de datos, la lámina puede teñirse mediante H&E para fines de anotación histológica. Sin embargo, el daño celular y tisular está asociado con la recogida de datos MALDI-MSI, por lo que esta estrategia limita el alcance de la anotación celular. Alternativamente, se pueden utilizar cortes de tejido secuenciales para H&E. Esta estrategia proporciona datos de alta calidad, pero requiere alineación e integración de cortes de muestra discretos.

Cabe destacar que los tejidos con parafina fijada en formalina (FFPE) son muy adecuados para el análisis de glycome por MALDI-MSI, con pequeños cambios en el protocolo para la preparación de la muestra13. Sin embargo, el tejido FFPE no puede utilizarse eficazmente para metabolómica y otros análisis similares, por lo que se prefieren muestras frescas congeladas, como se detalla aquí, para enfoquesmultiómicos 28. La preparación de muestras es un componente fundamental de cualquier pipeline MSI para biomoléculas lábiles, lo que requiere enfoques especiales para la recolección y manipulación de muestras17, 29, 30.

Las metodologías para ampliar la generalidad y la utilización generalizada de los enfoques basados en MALDI-MSI están avanzando rápidamente, con mejoras notables en hardware ysoftware 19. Además, los enfoques recientes de vanguardia multiómica28 y multimodal21 , combinados con aprendizaje automático e inteligencia artificial, son especialmente prometedores para manejar estos conjuntos de datos altamentecomplejos 31.

Divulgaciones

R.C.S., M.S.G. y C.W.V.K. son codirectores del Centro de Investigación Avanzada de Biomoléculas Espaciales (CASBR) en la Universidad de Florida y cofundadores de Sugar3 LLC. R.C.S. ha recibido apoyo para la investigación y/o honorarios de consultoría de Maze Therapeutics. M.S.G. ha recibido apoyo para la investigación, compuestos para investigación o honorarios de consultoría de Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics y Aro Biotherapeutics. M.S.G. es miembro del consejo asesor científico de Chelsea's Hope, la Fundación del Síndrome de Deficiencia de Glut1 y la Fundación para Enfermedades Corporales de Poliglucosana en Adultos.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros de los laboratorios Vander Kooi, Sun y Gentry por sus fructíferas discusiones. Este estudio fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a la Instalación de Recursos Compartidos de Adquisición de Biomuestras y Patología Traslacional del Centro de Cáncer Markey de la Universidad de Kentucky, P30CA177558 a D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 a R.C.S., R35NS116824 a M.S.G., R01DC019054 a C.W.V.K. y a la Facultad de Medicina de la Universidad de Florida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Almohadilla absorbenteDenville ScientificB1623
Acetonitrilo (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Papel de aluminioFisher Scientific & nbsp;15078292
Anhídrido citracónicoSigma-Aldrich125318
Tubo cónico (15 mL)Alkali ScientificCW5600
Tarros CoplinDWK Ciencias de la Vida900570
Cryostat  LeicaCM1860
Cilindro crioplásticoLeica14041926491
DesecadorBel ArtF424004131
Vaso de diálisisThermo Fisher88400
EtanolFisher Scientific & nbsp;22032601
Vaporizador de comidaRival CKRVSTLM21   
Inserto de vidrio (70 mm)Compañía de GelLGI50
GlucógenoSigma-AldrichG8876Estándar
Peroxidasa de rábano picante (HRP)Sigma-AldrichP8125Estándar
Agua HPLCSigma-Aldrich270733-4X4L
Pulverizador HTXTecnologías HTXM5
Ácido clorhídricoFisher Scientific & nbsp;A144-500
IsoamilasaMegazymeE-ISAMY
Bomba KnauerKnauerP 4.1 S
Hoja de perfil bajoCiencias de la Microscopía Electrónica63059-01
Soporte de montaje M1Epredia1310
Espectrómetro de masasBruker DaltonicstimsTOF fleX
Tubo Microfuge (1,5 mL)Alkali ScientificCN3016
AgujaBD305109
NBF de formalina amortiguada en neutralMillipore sigmaHT501128-4L
Gas nitrógenoAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific & nbsp;SH30256. FS
Tubos de PCRSocios de MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Biografía de BulldogNZPULT10LY
Laboratorio SCiLSBruker Daltonics1889000
ShakerTermo Científica88882007
Diapositiva   Ciencias del microscopio electrónico71873-02
Correo de diapositivasProductos RPI212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagenodoB01080010
Pinzas estérilesDR InstrumentsS08098
Bisturí estérilWPIWPI-500240
Tijeras SterilesHerramientas Científicas Fines14084-08
Jeringuilla   Grainger19G342
Bomba de jeringuillaNueva EraNE-300
CintaFisher Scientific & nbsp;15-901-R
Pincel finoAnezus#00
Ácido trifluoroacéticoSigma-AldrichT6508-1L
Mezcla de melodías, ESI de baja concentraciónAgilentG1969-85000
Barcos de pesoSigma-AldrichHS120882
XilenoSigma-Aldrich534056
ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinnámico (CHCA)Compañía Química de Caimán15254

Referencias

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Mapeo del glicomaimágenes por espectrometría de masasMALDI MSIglicanos N-ligadoslocalización del glucógenodigestión enzimática de tejidosglicómica de hígado de ratónenzimas activas sobre carbohidratosheterogeneidad glicómica espacial
Imagen Molecular Espacial del Glycome mediante espectrometría de masas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.