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Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

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DOI:

10.3791/69155

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17 de octubre de 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

En este artículo

Resumen

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Resumen

El trastorno del espectro autista (TEA) surge de una amplia gama de factores genéticos y ambientales. Si bien numerosas mutaciones relacionadas con el TEA interrumpen el desarrollo o la plasticidad de la sinapsis, se ha demostrado que un número cada vez mayor altera la expresión y el funcionamiento de los canales iónicos activados por voltaje, lo que resulta en déficits en la excitabilidad intrínseca neuronal. Los registros de pinza de voltaje de toda la célula se pueden utilizar para caracterizar cómo las mutaciones relacionadas con ASD afectan la función del canal iónico. Sin embargo, estos experimentos no evalúan directamente cómo una conductancia iónica alterada afecta la activación del potencial de acción neuronal. La electrofisiología de pinza dinámica cierra esta brecha al permitir la inyección en tiempo real de conductancias iónicas definidas por el usuario en neuronas vivas. Esto permite realizar pruebas causales de cómo los cambios en las propiedades de los canales iónicos afectan la actividad eléctrica de un tipo de célula determinado. En este artículo de métodos, describimos cómo implementar la electrofisiología de pinza dinámica en neuronas de Purkinje de ratón adulto registradas en condiciones fisiológicas en cortes de cerebro cerebeloso preparados de forma aguda. Las neuronas de Purkinje son un modelo particularmente relevante para este trabajo porque tienen una capacidad intrínseca para disparar potenciales de acción repetitivos de alta frecuencia (20-100 Hz) y están consistentemente implicadas en la disfunción del circuito cerebeloso relacionada con el TEA. Nos centramos en Tsc1, un gen cuyas mutaciones de pérdida de función se encuentran entre las causas monogénicas más comunes de TEA. En las neuronas de Purkinje de ratón, la deleción de Tsc1 también se ha relacionado con la reducción de la expresión del canal de sodio dependiente de voltaje (Nav). Utilizamos modelos de estado cinético de Markov para simular y reproducir las propiedades de conductancia de la neurona de Purkinje Nav y luego usamos la pinza dinámica para evaluar directamente cómo los cambios en la conductancia de Nav afectan la activación intrínseca de las neuronas de Purkinje cerebelosas intactas. Proporcionamos instrucciones y recursos para modificar y ajustar los modelos de conductancia iónica. Al integrar el modelado de conductancia iónica, la abrazadera dinámica y las técnicas convencionales de pinza de parche, este enfoque proporciona un marco poderoso y flexible para vincular las perturbaciones genéticas con los resultados fisiológicos en las neuronas relevantes para el TEA.

Introducción

Investigaciones anteriores sobre los impulsores moleculares y celulares del trastorno del espectro autista (TEA) a menudo enfatizaron la disfunción sináptica como fundamental para la fisiopatología del trastorno 1,2. Numerosos estudios han demostrado un aumento de la densidad de sinapsis excitatoria 2,3,4, una poda sináptica alterada5 y alteraciones en las proteínas de densidad postsináptica 6,7 en modelos de TEA. Sin embargo, trabajos recientes han demostrado que los cambios en la excitabilidad neuronal intrínseca también son impulsores de la patología del TEA. Por ejemplo, los modelos de ratones transgénicos con TEA y las líneas celulares derivadas de pacientes han revelado una generación de potencial de acción alterada en las neuronas piramidales cerebelosasde Purkinje 8,9,10 y corticales11, así como una excitabilidad dendrítica atenuada y la integración sináptica en subclases de neuronas piramidales corticales12. Las canalopatías que involucran mutaciones de pérdida de función en SCN2A, que codifican la subunidad de α formadora de poros del canal de sodio dependiente de voltaje (Nav1.2), es ahora una causa monogénica bien conocida de TEA13, y se ha demostrado que causa déficits en la excitabilidad intrínseca de varias clases de neuronas centrales 14,15,16,17. A medida que avanzan este tipo de investigaciones, es importante establecer vínculos causales entre los cambios patógenos en las conductancias iónicas y los efectos de estos cambios en la función de las neuronas y los circuitos. La electrofisiología de pinza dinámica proporciona un enfoque eficaz para esta tarea. Sharp et al. (1992 y 1993)18,19, junto con Robinson y Kawai (1993)20 describieron inicialmente métodos de pinzamiento dinámico en los que se inyecta/agrega una conductancia iónica no lineal simulada, con o sin propiedades dependientes del voltaje, en neuronas vivas, lo que permite a los investigadores evaluar en tiempo real cómo las propiedades o los cambios putativos en una conductancia iónica dependiente de voltaje afectan la activación neuronal21, Artículo 22.

La implementación de experimentos de abrazadera dinámica se ha visto facilitada por varios sistemas de software disponibles gratuitamente, como RTXI23, QuB 24,25 y StdpC26; Sin embargo, los avances recientes han simplificado la implementación de abrazaderas dinámicas con sistemas comerciales plug-and-play que permiten desarrollar, modificar y aplicar conductancias de modelos en una sola computadora y dentro de un solo paquete de software. Aquí, proporcionamos protocolos para realizar pinzas dinámicas utilizando un sistema Sutter dPatch27 y proporcionamos una investigación de muestra en la que probamos cómo la deleción dirigida de la esclerosis tuberosa 1 (Tsc1)9, que es un locus prevalente de mutaciones para ASD28, afecta la activación intrínseca de las neuronas de Purkinje cerebelosas como resultado de cambios en la expresión de la conductancia de sodio dependiente de voltaje8.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Miami (Protocolo # 1044). Los experimentos utilizaron ratones C57BL/6J machos y hembras de tipo salvaje y líneas transgénicas con antecedentes de cepas C57BL/6J. Para los experimentos electrofisiológicos, los animales tenían entre 6 y 7 semanas. Todas las grabaciones se tomaron de las neuronas de Purkinje en los lóbulos 5, 6 o 7 en el vermis cerebeloso.

1. Configuración y preparación de tejidos para experimentos de pinza de parche de neuronas de Purkinje

  1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga: 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 y 25 mM de dextrosa a pH 7,4 (~300 mOsM/L). Prepare también 250 ml de "solución de corte" que contenga: 240 mM de sacarosa, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 0,5 mM de CaCl2 y 7 mM de MgCl2. Rocíe (burbujas) ACSF y soluciones de corte con gas carbogenado (95 % O2 / 5% CO2) durante al menos 20 minutos antes de su uso y de forma continua durante todos los experimentos.
  2. Prepare una cámara de retención de cortes de cerebro llena de ACSF para su uso posterior. Asegúrese de que las rodajas cerebelosas (una vez agregadas a la cámara de corte) estén sumergidas con ambos lados de las rodajas cerebelosas expuestas a ACSF. Logre esto colocando rodajas sumergidas en una malla de nailon bien estirada que también esté sumergida.
  3. Prepare la estación de cirugía. Prepara cuatro trozos de cinta adhesiva que se utilizarán para sujetar al animal anestesiado. En un balde lleno de hielo o en una bandeja de hielo, coloque la mitad inferior de una placa de Petri en el hielo con las paredes hacia abajo y el fondo de la placa de Petri hacia arriba. Coloque un papel de filtro (≥ 3 cm2) en el fondo de la placa de Petri y sature con 2-3 ml de solución de corte.
    NOTA: Para los experimentos descritos, se utiliza un vibratomo compressómico para cortar cortes cerebelosos parasagitales de 350 μM. Con el compresstoma, el tejido para cortar se pega a un tubo de muestra de plástico que se ajusta a través de un tubo de metal delgado circundante. Durante el corte, el tubo de la muestra se empuja a través del tubo de metal, que permanece fijo. Después de pegar el tejido al tubo de muestra, el tejido se incrusta en agarosa al 2% calentada. La hoja del compresstoma está pegada a un soporte fijo, que está unido al brazo del vibratomo. Otros tipos de vibrátomos no requieren incrustar tejido en agarosa calentada, pero deberían funcionar igualmente bien para los experimentos descritos.
  4. Además, en el hielo, coloque una hoja de afeitar de un solo filo y un vaso de precipitados pequeño (10 ml) lleno de solución de corte. Mantenga un bloque de enfriamiento, que se usa para enfriar rápidamente la agarosa calentada una vez que se agrega al tubo de muestra, así como una jeringa de 30 ml llena de solución de corte enfriada en el hielo. Asegúrese de que la jeringa de 30 ml esté conectada a una sección de 30-60 cm de tubo intravenoso (IV) (a través del cono macho Luer lock) que esté conectado (en el extremo final) a una aguja (≥ 26 G) con una base hembra Luer lock.
  5. Coloque la solución de corte restante en un congelador a -80 °C. Una vez que esta solución de corte adquiera una consistencia de hielo fangoso (20-25 min), retírela del congelador a -80 °C y colóquela en hielo.
  6. Anestesiar a un ratón adulto de 5-8 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de 1 mL/kg de peso animal de ketamina (10 mg/mL)/xilacina (0,25 mg/mL).
  7. Hacer una solución de agarosa al 2% disolviendo 0,5 g de agarosa en 25 ml de solución de corte. Después de anestesiar al animal (no responde al pellizco del dedo del pie), caliente la solución de agarosa al 2% (~ 30 s en microondas) y transfiera la solución de agarosa caliente a un baño de agua a 40 ° C.
    NOTA: Los pasos numerados 1.8-1.18 deben completarse con urgencia y antes de que la agarosa calentada se solidifique.
  8. Sujete las extremidades del animal a la mesa de cirugía con cinta adhesiva. Con unas tijeras, abra la cavidad torácica del animal, asegurándose de que no se corten los pulmones y los órganos abdominales. Use fórceps de bloqueo o hemostáticos para mantener abierta la caja torácica, exponiendo el corazón. Para lograr esto, bloquee las pinzas en el esternón y colóquelas con cuidado hacia la parte anterior del animal (con los orificios para los dedos de la herramienta al lado de la cabeza del animal).
  9. Inserte la aguja conectada a la jeringa de 30 ml en el ventrículo izquierdo y use fórceps para comprimir el tejido alrededor de la aguja, sosteniendo la aguja dentro de la cámara intraventricular izquierda. Con unas tijeras quirúrgicas, haga un pequeño corte en la aurícula derecha y perfunda rápidamente al animal con los 25 ml de solución de corte refrigerada.
    NOTA: Asegúrese de que la perfusión ingrese al ventrículo izquierdo y salga de la aurícula derecha, eliminando la sangre del sistema circulatorio del animal.
  10. Cuando se complete la perfusión, decapitar rápidamente al animal y cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media de la cabeza hacia el bregma para exponer la superficie del cráneo.
  11. Con unas tijeras, elimine el tejido conectivo de la cara posterior del cráneo y elimine el exceso de tejido de la médula espinal, asegurándose de que la médula espinal no sobresalga del foramen magno.
  12. Coloque una hoja de tijera en el foramen magnum y corte a lo largo de la circunferencia del cráneo en ambos aspectos temporales hacia el bregma, dejando algo de tejido craneal en su lugar en el bregma.
  13. Coloque una hoja de tijera o la mitad de unas pinzas finas en el foramen magnum y levántelo superiormente, separando el cráneo del cerebro. Tenga cuidado de no empujar la hoja de la tijera o la pinza en el cerebro mientras levanta el cráneo.
  14. Use una herramienta quirúrgica de espátula para recoger debajo del cerebro (desde el anterior) y retire con cuidado el cerebro en el vaso de precipitados de 10 ml que contiene una solución de corte fría, teniendo cuidado de proteger el cerebelo a medida que se transfiere el cerebro. Cámbiese a guantes limpios en esta etapa.
  15. Retire con cuidado el cerebro del vaso de precipitados (usando la espátula) y colóquelo sobre el papel de filtro (en una placa de Petri). Utilice la cuchilla de un solo filo para cortar a lo largo del eje parasagital a unos pocos milímetros de la línea media. Deseche el tejido seccionado parasagital más pequeño. Haga un segundo corte coronal a la mitad del prosencéfalo (anterior al cerebelo). Deseche el tejido cortado coronalmente que es anterior al cerebelo.
  16. Deslice la cuchilla de un solo filo debajo de la porción anterior del prosencéfalo y levántela para rotar el tejido restante de modo que el lado del corte parasagital inicial quede hacia abajo (en el papel de filtro) y el hemisferio cerebeloso sin cortar quede hacia arriba.
  17. Coloque el tubo de muestra en posición vertical en el hielo y agregue una capa delgada de superpegamento (adhesivo de cianoacrilato) en la superficie del tubo. Con una herramienta de espátula con una curva de 90°, transfiera con cuidado el tejido cerebral del papel de filtro a la superficie del tubo de muestra, manteniendo la orientación del tejido. Asegúrese de que el hemisferio cerebeloso sin cortar continúe mirando hacia arriba. Una vez que el tejido esté colocado/pegado en el tubo de muestra, deslice el tubo de metal hacia arriba para que rodee el tejido cerebral.
  18. Con una pipeta motorizada de 10 ml, llene el tubo de muestra con la agarosa calentada (que incrusta el tejido cerebral). Enfríe rápidamente el tejido (ahora incrustado en agarosa calentada) sujetando el bloque de enfriamiento alrededor del tubo de metal durante ~ 30 s.
  19. Coloque el tubo de muestra en la cámara del baño de vibratomo y llénelo con la solución de corte fangosa. Rocíe continuamente la solución de corte durante el corte del tejido cerebral, pero no exponga directamente las rodajas cerebelosas a burbujas de gas.
  20. Corte rodajas parasagitales de 300-350 μm, transfiriendo inmediatamente cada rebanada a la cámara de retención de rebanadas, llena de ACSF a temperatura ambiente. Una vez que todas las rodajas estén en la cámara de rebanadas, incube la cámara de rebanadas en un baño de agua a 33 °C durante 25 minutos.
  21. Después de 25 minutos en el baño de agua, coloque la cámara de corte (nuevamente) a temperatura ambiente, esperando al menos 35 minutos adicionales antes de intentar grabar el parche de cualquiera de los cortes cerebelosos.

2. Configuración de un modelo de conductancia basado en Markov en pinza dinámica

NOTA: La pinza dinámica es la aplicación en tiempo real de una conductancia modelada a una célula viva. El voltaje de la membrana se registra / muestrea a través de un electrodo afilado o de parche, y la señal digitalizada se envía al software de pinza dinámica, que calcula, utilizando los modelos de conductancia iónica que se aplican, la inyección de corriente de pinza dinámica adecuada para el voltaje muestreado. La señal de inyección de corriente de pinza dinámica calculada se envía al amplificador y a la etapa de cabeza para ser inyectada (mediante un electrodo) en la celda. Para que una conductancia modelada se agregue adecuadamente a una celda que dispara potenciales de acción, que impulsan cambios transitorios rápidos en el voltaje de la membrana, la frecuencia de muestreo de voltaje debe ser lo suficientemente alta, y el retraso entre la muestra de voltaje y la inyección de corriente de pinza dinámica (a veces llamada latencia) debe ser mínimo e invariante29.

  1. Antes de cualquier experimento de pinza dinámica, desarrolle u obtenga el modelo matemático de la(s) conductancia(s) iónica(s) que se utilizará en el experimento de pinza dinámica. Estos modelos pueden tener la forma de un modelo de estado cinético de Markov, un modelo de Hodgkin-Huxley (HH) o conductancia pasiva (lineal). Asegúrese de que el modelo de conductancia elegido reproduzca con precisión las propiedades cinéticas y dependientes del voltaje de la conductancia iónica prevista.
    NOTA: Los experimentadores pueden confirmar las propiedades de una conductancia iónica modelada, antes de su uso en experimentos de abrazadera dinámica, probando la conductancia modelada (in silico) en estudios de simulación de abrazadera de voltaje. Las propiedades y consideraciones importantes del estado cinético de Markov y los modelos de conductancia HH se describen en la sección Discusión. Los pasos a continuación describen la configuración de un modelo de conductancia de Markov en el software de pinza dinámica.
  2. Cree u obtenga un diagrama de transición de estado de Markov para el modelo de conductancia que se utilizará en experimentos de abrazadera dinámica. Utilice este diagrama para ensamblar con precisión el modelo de conductancia de Markov dentro del software de pinza dinámica (descrito a continuación).
    NOTA: SutterPatch es el software de adquisición de datos del amplificador dPatch. Se pueden realizar experimentos de pinza dinámica dentro del software, lo que permite el ensamblaje y la aplicación de conductancias modeladas a través de la inyección de corriente durante los protocolos de pinza de corriente. En la Figura 1A se muestra un diagrama de transición de estado de Markov para una conductancia de sodio controlada por voltaje modelada, basada en mediciones de corriente de navegación de neuronas de Purkinje de ratón. Este modelo fue desarrollado por Ransdell et al., 202230 y se ha utilizado para investigar el papel de los componentes de la corriente de sodio persistente y resurgente en la activación de neuronas de Purkinje31. Los estados de activación (C, IC, IF, IS y O) están interconectados por constantes de velocidad de transición, denotadas por variables (es decir, S0, S3, S1, S4). Este modelo se utiliza en los experimentos de abrazadera dinámica representativa y está disponible para su descarga en GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. En el software de adquisición de datos, abra la ventana Editor de abrazaderas dinámicas desde la pestaña SutterPatch > Editor de abrazaderas dinámicas o haciendo clic en el icono correspondiente en la ventana Tablero . En la Figura 1B se muestran partes de la ventana del editor de abrazaderas dinámicas.
    NOTA: La ventana Editor de pinzas dinámicas contiene todos los ajustes necesarios para aplicar la conductancia modelada durante un protocolo de grabación de pinzas de corriente. La interfaz del grupo de conductancia (Figura 1B, arriba a la izquierda) permite a los usuarios organizar y cargar simultáneamente grupos de conductancias del modelo.
  4. En la interfaz del grupo de conductancia (Figura 1B, arriba a la izquierda), cree un grupo haciendo clic en Nuevo y asígnele el nombre que desee. Una vez seleccionado un grupo de conductancia, a la derecha de la ventana en la interfaz del selector de Headstage (Figura 1B, abajo a la izquierda), seleccione el tipo de modelo para el grupo de conductancia respectivo (Modelo: Markov, Hodgkin-Huxley, conductancia variable, etc.) y cuándo se deben aplicar las conductancias del modelo, como durante una rutina/protocolo (Modo activo). La interfaz del selector de Headstage también permite la selección de la velocidad de actualización de la pinza dinámica (en kHz) y la fuente de señal de voltaje (ver Figura 1B, derecha). En Fuente de señal de voltaje, seleccione la etapa de cabecera que está registrando la señal de voltaje.
  5. En el panel selector de Headstage , para el ejemplo del modelo de Markov de conductancia de navegación (Figura 1A), seleccione Modelo de Markov para Modelo, Durante barridos para Modo activo, 200 kHz para Velocidad de actualización y Headstage 1 para Fuente de señal de voltaje. Marque la Señal de Aplicación y Comando a AuxOUT1 para iniciar los cálculos del modelo en respuesta a la señal de voltaje y agregar la inyección de corriente de pinza dinámica a cualquier protocolo de pinza de corriente, respectivamente (Figura 1B, abajo a la izquierda).
  6. Debajo de los paneles principales del Editor de abrazaderas dinámicas se encuentra la matriz de estado (Figura 1C, abajo). Edite la matriz de estado haciendo clic primero en Editar parámetros del modelo en la interfaz del selector de Headstage (Figura 1B, abajo a la izquierda). Aparecerá una nueva ventana junto al editor llamada Parámetros del modelo de Markov de Dynamic Clamp. En este panel, ingrese las ecuaciones de la matriz de estado que representan la conductancia del modelo de Markov.
  7. En el panel Configuración de canal (Figura 1B, arriba a la derecha), seleccione qué modelos de conductancia guardados se deben aplicar (en pinza dinámica). Alternativamente, seleccione un canal vacío y comience a crear una nueva conductancia modelo. A la derecha de este panel, ingrese la inversión V (potencial de inversión de iones de conductancia modelados). Para nuestro estudio que utiliza una conductancia de sodio, ingrese 55.0 mV para reflejar el potencial de inversión del sodio basado en el ACSF y la solución interna del electrodo de parche.
  8. También en el panel Configuración del canal , proporcione el número de estados cinéticos de la conductancia seleccionada (consulte la Figura 1B, cuadro rojo superior derecho). Aquí, ingrese 9 para reflejar los 9 estados cinéticos de la conductancia modelada (consulte la Figura 1A).
  9. Debajo del panel Configuración de canal se encuentra el panel Ecuaciones de estado . Coloque las ecuaciones de la constante de la tasa de transición de estado de manera adecuada en la matriz de estado de entrada para reflejar la disposición topológica del modelo de Markov. Ingrese las ecuaciones en el panel Ecuaciones de estado y proporcione una identificación, comenzando en "S0" (Figura 1B, medio).
    NOTA: El orden con el que se ingresan estas ecuaciones no es importante, siempre que estas variables se completen adecuadamente en la matriz de estado de entrada para reflejar la topología del modelo de Markov.
  10. Para rellenar la matriz de estado de entrada con las variables de constante de velocidad ahora definidas, haga clic en Editar matriz de estado en el lado derecho del panel Ecuaciones de estado (Figura 1B, centro). A cada estado cinético se le asigna un número, comenzando en 0. Por ejemplo, para un modelo de estado de dos cinéticas, que contiene los estados X e Y, estos estados se llamarán "0" y "1" e incluirán dos constantes de velocidad de transición a1 y b1, donde a1 pasa de 0 a 1 y b1 pasa de 1 a 0.
  11. Para conectar adecuadamente estas ecuaciones usando el Editor de matrices de estado (Figura 1B, abajo), ingrese las constantes de velocidad en una tabla que contenga filas y columnas numeradas, ambas comenzando en 0 (vea el ejemplo en la Figura 1C).
    NOTA: El movimiento de un estado a otro está determinado por su posición en esta tabla en la forma "fila a columna". Por ejemplo, en el ejemplo del modelo de dos estados en el paso 2.1, la transición del estado 0 al estado 1 se basa en la constante de velocidad "a1" que luego se coloca en la fila 0, columna 1. La constante de velocidad de transición "b1" impulsa las transiciones del estado 1 al estado 0, por lo que la constante de velocidad debe colocarse en la fila 1, columna 0. En la Figura 1C, la matriz de estado de compuerta de ejemplo tiene constantes de velocidad que reflejan la topología del modelo de conductancia de navegación que se muestra en la Figura 1A. Por ejemplo, "S0" es la constante de velocidad que define las transiciones del estado cinético IC1 al IC2; por lo tanto, "S0" se coloca en la fila 0, columna 1 de la matriz de estado de entrada (Figura 1C). Las ecuaciones de la constante de velocidad de transición que definen la variable de cada constante de velocidad luego completan una matriz de estado llena (Figura 1C, inferior).
  12. A medida que las ecuaciones de la constante de velocidad se conectan a través del panel del editor de matrices de estado, las conexiones (la fila y la columna correspondientes) completarán el panel Conexiones junto a la ecuación (Figura 1B, centro a la derecha). Tome nota del estado abierto/conductor en el modelo representativo de conductancia de sodio (Figura 1A), agregado a la fila y columna 7 de la Figura 1C (arriba, cuadros rojos), que es importante para el siguiente paso.
  13. En la Figura 1B (abajo a la derecha), utilice el panel Ecuaciones de conductancia (nS) para definir la amplitud de la conductancia del modelo que se aplicará durante la abrazadera dinámica. Seleccione los estados abiertos/conductores en el modelo de Markov y proporcione un valor de conductancia (Figura 1B, inferior, cuadro rojo).
  14. Para este experimento, ingrese "400 nS" en el cuadro "G7", que agrega valores de corriente de navegación máxima que son similares a las corrientes de navegación máximas medidas en estudios de pinza de voltaje en neuronas de Purkinje de ratón.
  15. Una vez completados los pasos anteriores, haga clic en Cargar para preparar el modelo para la aplicación de pinzas dinámicas una vez que se inicie una rutina de pinzas de corriente.
  16. Utilice un proceso similar para organizar los modelos de HH; sin embargo, agregue ecuaciones para definir estados de compuerta independientes (en Ecuaciones de puerta) y conductancia bajo G máximo.
  17. Para aplicar la conductancia de pinza dinámica, primero cree una rutina de pinza de corriente usando el Editor de rutinas (haga clic en la pestaña SutterPatch > Editor de rutinas) (Figura 1D). Para crear una rutina de pinza de corriente, seleccione el canal de salida principal (que es StimOut1 en este ejemplo). Esto abrirá un panel que permite al usuario definir la salida del comando actual durante la rutina. Asegúrese de que el modo de grabación esté configurado en CC_Mode en el editor de rutinas.
    NOTA: En los experimentos representativos, debido a que este protocolo funciona con celdas de disparo espontáneo, se utiliza una rutina / protocolo de pinza de corriente sin brecha que tiene inyección de corriente cero.
  18. En los canales de entrada del editor de rutinas (Figura 1D, arriba a la derecha), defina las señales de entrada que, durante los experimentos, llenarán las ventanas de alcance grabadas. Estas entradas deben incluir una señal de voltaje y también incluir la inyección de corriente de comando de la rutina, así como la inyección de corriente de pinza dinámica, llamada Current1 y AuxIN1, respectivamente (Figura 1D, abajo a la izquierda).
  19. Para las rutinas de pinza de corriente que involucran comandos de inyección de corriente positiva y/o negativa, la señal de inyección de corriente de comando se combinará automáticamente con la señal de corriente de pinza dinámica. Cree una ventana de ámbito virtual para restar la señal de corriente del comando para que haya un registro de la inyección de corriente de pinza dinámica aislada. Para crear la nueva ventana de ámbito virtual, seleccione primero un canal de entrada adicional seleccionando la casilla de verificación Virtual1.
  20. En el Editor de rutinas, en Tipo matemático, seleccione Ecuación y seleccione (en Canal de origen) la señal de entrada de comandos de la rutina de pinza de corriente, que en este ejemplo es Current1. Ingrese una ecuación en campo abierto para restar la señal de comando de pinza de corriente de la señal de inyección de corriente de pinza dinámica.
    NOTA: Para este experimento de ejemplo, esto se hace con la ecuación t[3]-t[2]. La ventana de alcance Virtual1 ahora muestra la inyección de corriente de pinza dinámica (aislada de la señal de comando actual). Los usuarios tienen la capacidad de personalizar las etiquetas de los canales de entrada o salida haciendo doble clic en Etiqueta.

3. Adquisición de grabaciones de pinza de corriente de neuronas de Purkinje de ratón en cortes cerebelosos parasagitales

  1. Equipe el equipo de electrofisiología con una cámara de corte de tejido perfundida (por gravedad) con ACSF calentada a una temperatura cercana a la fisiológica (34-36 °C). Coloque con cuidado una rebanada cerebelosa parasagital en la cámara de rebanada y use un arpa de rebanada para mantener la rebanada cerebelosa en una posición sumergida y fija. Asegúrese de que un electrodo de tierra clorado y una sonda de temperatura también estén sumergidos y estables dentro de la cámara de corte cerebeloso.
  2. Localice la capa de neuronas de Purkinje con una lente de objetivo de inmersión de 40x. Las neuronas de Purkinje son grandes y tienen forma de lágrima. La membrana plasmática de las células de Purkinje sanas generalmente parece lisa y el núcleo no es visible.
  3. Una vez que se identifica una neurona de Purkinje sana y se apunta para el registro de la pinza de parche, ajuste la lente del objetivo del microscopio hacia arriba. Coloque y enfoque en la punta de un microelectrodo de vidrio conectado a un soporte de electrodo y al cabezal. Controle el cabezal / microelectrodo mediante un micromanipulador robótico de 3 ejes.
    NOTA: Para estos experimentos, asegúrese de que los microelectrodos tengan valores de resistencia de 2-4 MΩ y estén llenos de una solución interna de pinza de corriente adecuada. La solución interna utilizada en experimentos representativos contiene: 144 mM de K-gluconato, 0,2 mM de EGTA, 3 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 8 mM de NaCl, 4 mM de Mg-ATP y 0,5 mM de Na-GTP.
  4. Antes de acercarse a la neurona de Purkinje objetivo, agregue 2-3 ml de presión de aire positiva en el puerto de presión del soporte del electrodo.
  5. Cambie al modo VC en el panel de control del amplificador y aplique las funciones de compensación de electrodos y compensación de voltaje de electrodos. En el ejemplo aquí, haga clic en Automático junto a las opciones de compensación de electrodos y compensación de voltaje.
  6. Comience un protocolo de prueba de sellado de membrana continua (haga clic en Prueba de membrana). Establezca los parámetros de prueba de membrana en (o cerca) de barridos de 5 ms con un paso de 5 mV o 10 mV. Ajuste el potencial de retención (retención en V) a 0 mV.
  7. Mueva el microelectrodo hacia la celda objetivo, ajustando el plano focal para mantener el enfoque en o ligeramente por debajo de la punta del electrodo. Coloque el electrodo ligeramente por encima de la membrana plasmática de la célula objetivo. Utilice el micromanipulador y la presión positiva de la punta del electrodo para alejar los desechos extracelulares del soma de la célula diana, "limpiando" la membrana superficial.
  8. Después de que la célula diana esté libre de desechos extracelulares, coloque lentamente el electrodo cerca de la superficie de la membrana en el extremo ancho del soma de la neurona de Purkinje, desde donde se extiende el axón desde el cuerpo celular. A medida que la punta del electrodo se baja a la membrana, es probable que se vea un hoyuelo en la superficie de la membrana (debido a la presión positiva del electrodo). En este punto, libere la presión positiva y use la succión bucal para aplicar una pequeña cantidad de presión negativa.
  9. En el panel de control del amplificador , cambie el potencial de retención de V a -80 mV (de 0 mV). Monitoreo de la prueba de sellado de membrana, cuando la resistencia de la pipeta alcanza ≥ 1 GΩ, aumente la presión negativa y haga clic en la función Zap en el panel de prueba de sellado de membrana para romper la membrana y lograr una configuración de abrazadera de parche de celda completa.
  10. Utilice un breve protocolo de pinza de voltaje para medir las propiedades pasivas de la membrana (valores de capacitancia y resistencia de entrada) antes de cambiar, a través del panel de control del amplificador, al modo de pinza de corriente.
  11. Después de cambiar al modo de pinza de corriente, aplique una compensación de equilibrio de puente a ≥ 70%.
  12. Antes de aplicar una conductancia de abrazadera dinámica con un electrodo de parche, corrija el error de potencial de unión (que se calcula en función de la composición de las soluciones internas y ACSF del electrodo). Para las soluciones de los experimentos representativos, aplicar una corrección del potencial de unión de 17,5 mV. En los estudios de pinza dinámica, una corrección precisa del potencial de unión es fundamental para que los modelos de conductancia utilicen una señal de voltaje precisa para calcular las inyecciones de corriente de pinza dinámica.

4. Aplicación de la conductancia dinámica de la abrazadera

  1. Debido a que las neuronas de Purkinje disparan potenciales de acción repetitivos espontáneamente, registre las propiedades de disparo antes de agregar (o restar) una conductancia iónica modelada para probar la salud celular y medir las propiedades de referencia de la excitabilidad de la membrana. Aplique la conductancia modelada haciendo clic en Cargar en la ventana de configuración de Dynamic Clamp . Ahora se verá una pequeña etiqueta DynC en el controlador dPatch, superpuesta a CC (consulte la Figura 1D, cuadros rojos).
  2. Después de encender/cargar la pinza dinámica, la conductancia de la pinza dinámica se aplica automáticamente mientras una rutina/protocolo de pinza de corriente está activa. Vea la inyección dinámica de corriente de pinza en la ventana de osciloscopio correspondiente a la señal de entrada seleccionada AuxIN1 .
    NOTA: Los registros alternos de disparo espontáneo con y sin aplicación de conductancias dinámicas mediadas por pinzas son importantes para determinar cómo la conductancia del modelo aplicado afecta la excitabilidad y para determinar si los niveles basales de excitabilidad son estables / consistentes durante todo el experimento.

Resultados

En los experimentos presentados, aplicamos, utilizando pinzas dinámicas, una conductancia de sodio (Nav) controlada por voltaje modelada a neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón adulto (6-7 semanas de edad) que están agudamente aisladas en una preparación de corte cerebeloso parasagital. Los estudios se realizan en ratones de tipo salvaje (control) y ratones transgénicos, en los que se utiliza la recombinación Cre-loxP para eliminar selectivamente la esclerosis tuberosa 1 (Tsc1) de las neuronas cerebelosas de Purkinje. El complejo de esclerosis tuberosa (CET) es un trastorno multisistémico causado por mutaciones de pérdida de función en TSC1 o TSC2 32,28,33. Las personas con CET son comúnmente diagnosticadas con trastornos de epilepsia, deterioro cognitivo y trastorno del espectro autista34,35. Los ratones con deleción Tsc1 específica de la neurona de Purkinje, denominada aquí mut / mut Tsc1, exhiben varios fenotipos conductuales relacionados con el TEA, incluidas deficiencias en la función motora, el comportamiento de interacción social y las vocalizaciones, así como comportamientos repetitivos exagerados 9,36. Tsc1mut/mut También se ha demostrado que las neuronas de Purkinje tienen un potencial de acción atenuado (Figura 2A, B), que está relacionado con amplitudes de corriente de navegación significativamente reducidas (Figura 2C) y expresión del canal de navegación en los segmentos iniciales del axón de las neuronas de PurkinjeTsc1 mut / mut 8. Las corrientes de navegación en las neuronas de PurkinjeTsc1 mut / mut tienen propiedades cinéticas y dependientes del voltaje similares a las neuronas de Purkinje de tipo salvaje8. En este modelo de ratón transgénico Tsc1 mut / mut, utilizamos pinzas dinámicas para probar si agregar conductancia de navegación a las neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut puede rescatar disparos repetitivos. Continuamos probando si la resta de la conductancia de navegación en las neuronas de Purkinje de tipo salvaje causa una atenuación similar en la activación de las neuronas de Purkinje medida en las neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut (Figura 2B). Para restar la conductancia de navegación expresada de forma nativa, aplicamos la conductancia de navegación utilizando una abrazadera dinámica; sin embargo, la polaridad de la conductancia se invierte.

El modelo de estado cinético de Markov (Figura 1A) utilizado para simular la conductancia de navegación de la neurona de Purkinje contiene nueve estados cinéticos, ocho de los cuales no son conductores, que están etiquetados como cerrados (C1, C2 y C3), inactivados-cerrados (IC1 e IC2), inactivados rápidamente (IF1 e IF2) e inactivados lentamente (IS). Hay un estado cinético abierto/conductor (O)30,31. Las constantes de velocidad de transición, que se muestran entre los estados cinéticos marcados (Figura 1A) determinan la proporción de canales/conductancia simulados que ocupan cada estado cinético. El voltaje de la membrana afecta a cada una de las constantes de velocidad del modelo. Las corrientes de navegación simuladas producidas por este modelo (in silico) en experimentos simulados de pinza de voltaje se muestran (en rojo) a la derecha de las corrientes de navegación medidas a partir de neuronas de Purkinje aisladas de forma aguda, que se muestran en negro (Figura 1A, inferior). El comando de voltaje que evoca estas corrientes de navegación simuladas (rojas) y neuronas de Purkinje (negras) se presenta sobre las trazas de corriente en negro. Tenga en cuenta que, en el comando de voltaje, un paso de despolarización inicial (a 0 mV) da como resultado una corriente de sodio entrante transitoria rápida, que, en la traza simulada, refleja los canales que transitan desde los estados cerrados no conductores al estado cinético abierto, lo que permite una breve corriente hacia adentro antes de que los canales de estado abierto se acumulen en los estados cinéticos de inactivación rápida (IF1 e IF2). Este paso de voltaje de despolarización es breve (5 ms) y el potencial de membrana se eleva posteriormente a un voltaje repolarizado intermedio de -45 mV, en el que el potencial se mantiene durante 80 ms (Figura 1A, inferior). Durante este paso de voltaje de repolarización, es notable que hay un resurgimiento de la corriente de sodio hacia adentro, un componente de corriente conocido como corriente de sodio resurgente (INaR). Durante este paso de 80 ms a -45 mV, INaR exhibe una disminución lenta (en comparación con INaT) en amplitud, alcanzando finalmente un estado estacionario de corriente entrante, que es el componente de corriente de navegación persistente (INaP). La activación de INaR modelada (Figura 1A, inferior, roja) durante la repolarización de la membrana refleja canales simulados que se recuperan de los estados cinéticos de inactivación rápida (IF1 + IF2) al estado abierto/conductor. Con el tiempo (manteniéndose a -45 mV), una parte de los canales simulados que ocupan el estado abierto se acumulan en un estado cinético absorbente de inactivación lenta (IS), que se refleja como desintegración de INaR, y una parte de estos canales permanece en el estado abierto/conductor, reflejado como el componente de corriente INaP de estado estacionario30,31.

En los experimentos/resultados representativos, el modelo de conductancia de Nav Markov (Figura 1A) se agregó a las neuronas de Purkinje adultas en cortes cerebelosos aislados de forma aguda. En la Figura 3A se presenta una representación de dibujos animados de esta configuración experimental. Para aplicar la conductancia de navegación modelada a través de la inyección dinámica de corriente de pinza, utilizamos el sistema amplificador dPatch (que se muestra en la Figura 3B), que tiene una conversión de analógico a digital (A/D) y de digital a analógico (D/A) totalmente integrada. Este sistema también maneja transformaciones de señales a través de procesadores centrales ARM integrados (externos a la PC) y tiene un circuito FPGA (matriz programable en campo) integrado que permite el procesamiento casi instantáneo de señales de entrada y retroalimentación (envío de señales de salida) al electrodo de inyección de corriente27. Los experimentos aquí involucraron la aplicación (en pinza dinámica) de un modelo de conductancia de Markov complejo, que pudimos aplicar con velocidades de actualización de inyección de corriente de hasta 500 kHz.

La adición de la conductancia de navegación simulada (400 nS) a las neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut durante los registros de pinza de corriente sin espacio resultó en aumentos claros en las frecuencias de disparo repetitivo de las células (Figura 3C1, D1), lo que indica que la adición de conductancia de navegación en estas células puede ser suficiente para rescatar déficits en la excitabilidad de la neurona de Purkinje Tsc1 mut / mut, aunque no examinamos el repertorio completo de déficits informados en Tsc1mut / mut Excitabilidad de la neurona de Purkinje8. Como es evidente en las trazas representativas que se muestran en la Figura 3C2 (arriba), las neuronas de Purkinje de tipo salvaje tienen una capacidad intrínseca para disparar potenciales de acción repetitivos a altas frecuencias. Usando pinza dinámica, restamos la conductancia de navegación modelada de las neuronas de Purkinje de tipo salvaje aplicando la conductancia de navegación modelada con una polaridad inversa (negativa) (-400 nS). La resta de la conductancia de Nav modelada resultó en una reducción inmediata y obvia en la activación repetitiva (Figura 3C2, inferior), lo que también es consistente con la hipótesis de que las corrientes de Nav reducidas medidas en las neuronas Tsc1 mut / mut Purkinje contribuyen a las propiedades de activación atenuadas medidas en estas células8. A través de varias neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut o de tipo salvaje, estos experimentos de pinza dinámica, en los que se agregó o restó la conductancia de navegación, respectivamente, dieron como resultado efectos consistentes en la frecuencia de disparo. La adición de la conductancia Nav aumentó significativamente la frecuencia de disparo de la neurona de Purkinje mut / mut Tsc1 mut (Figura 3D1), y en las neuronas de Purkinje de tipo salvaje, la sustracción de la conductancia Nav redujo significativamente (P = 0,031) la frecuencia de disparo (Figura 3D2) (prueba t pareada de Student).

figure-results-1
Figura 1: Configuración de un modelo de Markov en el software de abrazadera dinámica. (A) Se muestra un diagrama de transición de estado de Markov para un modelo que reproduce las propiedades de conductancia de navegación medidas en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón30. Este modelo incluye nueve estados cinéticos. De estos, 8 son estados no conductores: tres cerrados (C), dos inactivados-cerrados (IC), dos inactivados rápidos (IF) y uno lento-inactivado (IS). El modelo incluye un estado cinético abierto (O), que es la conducción. Entre estados cinéticos adyacentes, las conexiones/ocupación de estado que transicionan a lo largo del tiempo se definen mediante constantes de velocidad de transición, que se muestran como S0-S15. Tenga en cuenta que a cada estado cinético también se le asigna un valor numérico (rojo), lo que permite a los usuarios definir el modelo de Markov y su topología de estado cinético en una matriz de estado de compuerta (que se muestra en el panel C, que se describe a continuación). (B) Se presentan los paneles/interfaces gráficas con los que los usuarios trabajan en el Editor de abrazadera dinámica SutterPatch. Tenga en cuenta que la disposición de estos paneles del Editor de abrazaderas dinámicas no es coherente con la disposición tal como aparece en el software de abrazaderas dinámicas. Además, no se muestran todos los paneles asociados con el Editor de abrazaderas dinámicas. (C) (panel superior) Se muestra un ejemplo de una matriz de estado de compuerta con variables ingresadas que corresponden a la topología del diagrama de transición de estado que se muestra en el panel A. Los cuadros rojos en la matriz de estado de compuerta resaltan la fila y la columna 7, que corresponden al estado cinético abierto (O) del modelo. Dentro de la columna 7, se enumeran todas las constantes de velocidad que definen las transiciones al estado cinético abierto (O) y, dentro de la fila 7, se enumeran todas las constantes de velocidad que definen las transiciones que salen del estado cinético abierto (O). Con esta organización, la matriz de estado de activación describe el número de estados cinéticos, las variables de constante de velocidad y la topología (interconexiones entre estados cinéticos) del modelo. En (D) se muestran los paneles/interfaces de usuario SutterPatch asociados con la carga de modelos de conductancia de pinza dinámica, junto con las interfaces involucradas en la creación de rutinas de pinza de corriente. Las interacciones del usuario con estos modelos se describen en los pasos del protocolo 2.17-2.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Las neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut tienen una excitabilidad de membrana atenuada en comparación con los controles de tipo salvaje. (A) Las grabaciones de pinza de corriente de células completas de las neuronas de Purkinje de tipo salvaje (superior, negro) y Tsc1mut / mut (inferior, azul) revelan una activación atenuada en la célula mutante Tsc1. (B) Las frecuencias de disparo reducidas en las neuronas Tsc1 mut / mut Purkinje, en comparación con los controles de tipo salvaje, son consistentes en todas las células. La frecuencia media (±± SEM) de activación espontánea de las neuronasTsc1 mut/mutPurkinje es significativamente (P < 0,0001) menor en comparación con las células de tipo salvaje (prueba t no apareada de Welch; control N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Las mediciones de pinza de voltaje de las corrientes de navegación en neuronas de Purkinje adultas revelan que el pico medio (±± SEM) de corriente de navegación transitoria rápida (INaT) se reduce significativamente en las células mut / mut Tsc1, en comparación con los controles de tipo salvaje. (P = 0,007, ANOVA de dos vías RM; control de tipo salvaje: N = 6, n = 22, negro; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, cuadrados azules). Los registrosde NaT de ejemplo, evocados por un paso de despolarización de -35 mV, se muestran como un panel insertado a la derecha del panel C. Datos publicados previamente en Brown et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Uso de pinzas dinámicas para determinar los efectos de una conductancia iónica en la excitabilidad de la neurona de Purkinje. La pinza dinámica implica muestrear el voltaje de la membrana (a través de un electrodo de registro) y calcular, en función del voltaje muestreado, la salida de corriente de una conductancia modelo. Luego, la corriente computarizada se aplica a una celda biológica utilizando un electrodo de inyección de corriente. El panel (A) representa esta disposición experimental. Si el muestreo de voltaje se realiza a una frecuencia suficiente y hay un retraso mínimo (latencia) entre el muestreo de voltaje y la aplicación de la corriente calculada, esta técnica se puede utilizar para evaluar cómo la suma o resta de una conductancia modelada afecta la activación neuronal y la excitabilidad de la membrana. (B) En experimentos representativos, se adquirieron grabaciones de abrazadera dinámica utilizando el software SutterPatch y el sistema amplificador dPatch. dPatch es un amplificador de abrazadera de parche que tiene procesadores de señal externos y un digitalizador totalmente integrado, lo que lo hace muy adecuado para grabaciones de abrazadera dinámica (ver Discusión). (C) Registros representativos de pinza de corriente de disparo espontáneo de neuronas de Purkinje, antes y después de usar pinza dinámica para sumar o restar 400 nS de la conductancia de navegación modelada (presentada en la Figura 1A). En C1 (izquierda), los registros son de una neurona de Purkinje Tsc1 mut / mut con disparo atenuado. La adición de una conductancia de navegación de 400 nS da como resultado un claro aumento en la frecuencia de disparo de esta celda. Alternativamente, en C2, los registros son de una neurona de Purkinje de tipo salvaje. En este experimento, la conductancia de navegación modelada se aplica con una polaridad invertida (-400 nS), lo que da como resultado una sustracción de conductancia de navegación y una clara reducción en la frecuencia de disparo repetitivo. Los registros de inyección de corriente de pinza dinámica, que se muestran en gris, se presentan debajo de los registros de disparo de potencial de acción (voltaje), que se muestran en negro. (D) Los resultados de estos experimentos de pinza dinámica, presentados como los cambios en la frecuencia de disparo espontáneo después de agregar la conductancia de Nav a las neuronas de Purkinje Tsc1 mut / mut (D1, n = 3) o restar la conductancia de Nav de las neuronas de Purkinje de tipo salvaje (D2, n = 3), revelan efectos consistentes y significativos de agregar o restar esta conductancia a través de Tsc1mut / mut (P = 0.029) y tipo salvaje (P = 0,031), respectivamente (prueba t de Student pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los circuitos cerebelosos funcionan en la propiocepción y el control motor 37,38, pero también son críticos para comportamientos complejos como las interacciones sociales y el procesamiento emocional 39,40,41. La patología en la estructura y función cerebelosa a menudo está relacionada con el TEA 42,43,44,45,46. La arquitectura simple de los circuitos cerebelosos47 y el claro papel del cerebelo en la patología del TEA lo convierten en una región cerebral atractiva para investigar los impulsores moleculares y celulares de los déficits conductuales del TEA, así como las posibles terapias. La electrofisiología de pinza dinámica ofrece una herramienta importante para estas investigaciones, lo que permite a los investigadores probar directamente las relaciones causales entre los cambios relacionados con el TEA en las propiedades de los canales iónicos / conductancias iónicas y la activación de las neuronas cerebelosas. Si bien los métodos de pinza dinámica son particularmente adecuados para las investigaciones de cambios relacionados con el TEA en la excitabilidad neuronal, esta técnica es relevante para investigar una variedad de mecanismos patológicos que afectan a las células con membranas excitables. Además, la pinza dinámica sigue siendo una excelente herramienta para diseccionar los complejos procesos mediante los cuales las neuronas y las células musculares regulan y mantienen la activación adecuada del potencial de acción.

La ejecución precisa de los experimentos de abrazadera dinámica requiere un control cuidadoso de los parámetros técnicos. Específicamente, los experimentadores deben conocer y comprender las consecuencias de la variabilidad potencial en el retraso entre el muestreo de voltaje y la inyección de corriente, a menudo denominada fluctuación29, así como las propiedades pasivas del electrodo, las limitaciones de la pinza de espacio y la fidelidad fisiológica de la preparación experimental bajo investigación. Bettencourt et al. (2008)48 y Butera et al. (2001)29 demostraron previamente que lograr altas velocidades de muestreo de al menos 50 kHz es fundamental para capturar con precisión conductancias iónicas rápidas, con latencias de retroalimentación idealmente mantenidas por debajo del 25% (≤ 5 μs) del intervalo de muestreo. Las tasas de muestreo nominales notificadas por los sistemas comerciales, en particular las plataformas basadas en Windows, pueden ser engañosas; por lo tanto, a menudo es necesaria una verificación independiente del desempeño, lo que es discutido con más detalle por Milescu et al. (2008) 25 y Clausen et al. (2012) 49. También se deben considerar las restricciones de espacio, particularmente cuando se trabaja con neuronas intactas que tienen morfologías complejas y propiedades de membrana no isopotenciales. Por ejemplo, intentar aplicar (o restar) una conductancia con un electrodo que es distal al sitio de integración, como el AIS, dará como resultado una representación inexacta de los efectos de la conductancia aplicada. La resistencia deficiente (alta) del electrodo, la compensación de capacitancia inadecuada y/o la falta de corrección del error de potencial de unión también pueden causar una tergiversación de las mediciones de voltaje (señal de entrada) y, en consecuencia, la aplicación incorrecta de las conductancias iónicas modeladas50,51.

Miles de modelos de Markov y HH están disponibles gratuitamente para los investigadores en bases de datos en línea como ModelDB52 y Channelpedia53, con el apoyo del Proyecto Cerebro Humano y el Laboratorio de Microcircuitos Neuronales, respectivamente. Estas bases de datos incluyen modelos para conductancias sinápticas, conductancias de canales iónicos y modelos de neuronas basados en conductancia, que se escriben principalmente en NEURON, MATLAB o Python. Los archivos de base de datos generalmente proporcionan las ecuaciones del modelo necesarias, así como cualquier información miscelánea sobre los tipos de células y los experimentos que informaron el modelo.

Tanto los modelos de conductancia de Markov como los de HH contienen estados/variables de activación conductores (simulando canales abiertos/activados) y no conductores (canales simulados cerrados). Sin embargo, estos tipos de modelos difieren en la forma en que se calcula el valor de conductancia en cada voltaje muestreado, y los modelos de Markov requieren más potencia computacional pero proporcionan más detalles en las propiedades de activación de los canales simulados. Por ejemplo, en los modelos HH, los estados conductores y no conductores son variables independientes, cada una determinada por la entrada de voltaje y la cinética de compuerta del estado respectivo 54,55. A diferencia de los modelos de Markov, los modelos de HH no simulan ni restringen las transiciones entre estados de compuerta, como el tránsito de canales simulados desde el estado cinético activado/abierto directamente al estado cinético de inactivación rápida en un modelo de conductancia de sodio dependiente de voltaje25. Esto hace que los modelos de HH sean menos complejos desde el punto de vista computacional54,55 y permite a los investigadores agregar múltiples modelos de HH de conductancia rápida simultáneamente, mientras mantienen altas tasas de muestreo y actualización.

Los modelos de estado cinético de Markov se componen de estados cinéticos discretos, que pueden ser conductores o no conductores, y estos estados están interconectados en una topología fija. En las simulaciones del modelo de Markov, la conductancia se calcula en cada voltaje muestreado por la proporción de canales simulados que ocupan los estados cinéticos conductores. La proporción de canales simulados que ocupan cada estado cinético (a lo largo del tiempo) está determinada por constantes de velocidad, que son parámetros que rigen la velocidad a la que la ocupación del estado pasa de un estado cinético a otro. Las constantes de velocidad tienen unidades de segundos inversos (s-1), que representan una probabilidad de transición por unidad de tiempo. Dependiendo del modelo, los valores de las constantes de velocidad pueden depender de factores dinámicos como el voltaje o la temperatura.

En los modelos de Markov, las ecuaciones diferenciales ordinarias se utilizan para describir la ocupación dependiente del tiempo de cada estado cinético. Estas ecuaciones gobiernan cómo evoluciona la probabilidad de estar en cada estado con el tiempo, en función de las constantes de la tasa de transición. Esto se representa mediante una matriz de tasas Q: figure-discussion-156. Como se discutió anteriormente, las constantes de velocidad de transición (r), que determinan el movimiento entre estados, pueden verse influenciadas por el voltaje de entrada (V) y los parámetros α y β, que reflejan la cinética de la conductancia a través de los voltajes. Estas ecuaciones se pueden describir como: figure-discussion-2, y se pueden representar visualmente en forma de gráficos que incluyen conexiones (constantes de velocidad de transición) dentro y fuera de cada estado cinético del modelo 56,57,58. Se puede encontrar una discusión útil sobre el desarrollo de los modelos de Markov y su topología en Schoening y Silva (2024)56.

Desde el inicio de la pinza dinámica en su forma actual, en la que se modelan y aplican conductancias iónicas no lineales (a través de un electrodo de inyección de corriente) a células vivas en tiempo real19,59, los métodos y recursos para esta técnica han evolucionado y son cada vez más accesibles y rentables debido a innovaciones como los sistemas de bajo costo basados en microcontroladores60 y el software gratuito de código abierto23, 25,26. Los sistemas comerciales, como dPatch de Sutter Instrument o Cybercyte de Cytocybernetics, facilitan aún más la implementación rápida de experimentos de pinzas dinámicas a través de soluciones integradas de hardware y software27,61.

La versatilidad de la abrazadera dinámica permite diversas aplicaciones, incluida la creación de sinapsis químicas y eléctricas virtuales, la incorporación de neuronas reales dentro de redes artificiales (o viceversa) y la adición de canales iónicos virtuales62. Es importante destacar que la dependencia del voltaje, las propiedades cinéticas y las amplitudes de una conductancia aplicada se pueden ajustar rápidamente, lo que permite a los investigadores probar directamente cómo la escala de uno o más parámetros afecta la activación del potencial de acción y la excitabilidad de la membrana31. Los sistemas actuales ofrecen altas velocidades de muestreo, lo que permite la aplicación precisa de conductancias transitorias rápidas y se pueden integrar fácilmente con equipos electrofisiológicos convencionales60,63, solidificando la pinza dinámica como un método ideal para avanzar en nuestra comprensión de la función y disfunción neuronal.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Telly Galiatsatos y Josh Stanford de Sutter Instrument por su ayuda en las consultas técnicas. También reconocemos y agradecemos a Jan Dolzer por su ayuda en el inicio de los estudios de pinzas dinámicas dPatch.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reactivo
Tubo de vidrio capilar, boroscilicate, pared estándar de diámetro diâmetro 1,5 mm diámetro interior 0,86 mm de longitud 10 cmWarner Instruments64-0793Equipo
CleanBenchTMC63-9090EEquipo
Compresstome VF-500-Z vibratome Instrumentos prescisionarioshttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Equipo
Dell OptiPlex 7080Dellhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusEquipo
DextrosaFisher ChemicalD16-500 Reactivo
Sistema amplificador dPatchInstrumento SutterFG-DPATCHEquipo
EGTAEMD Millipore324626-25GMReactivo
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reactivo
Calefactor en líneaWarner Instruments64-0102Equipo
KclFisher ChemicalP330-500 Reactivo
KetaminaProductos Veterinarios Dechra193.40620.3 Reactivo
K-gluconatoTCI ChemicalsG0040Reactivo
Software de LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Equipo
Baño María LSE 6LCorning6783Equipo
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reactivo
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reactivo
Tirador de pipetas modelo P-1000Instrumento SutterFG-P1000Equipo
NaClFisher ChemicalS271-500 Reactivo
Na-GTPMP Biomedicina56001-37-7Reactivo
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Reactivo
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reactivo
Software ocularDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareEquipo
CuchillaPersonna60-0139-CTNEquipo
Arpa de corteWarner Instruments64-0255Equipo
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Equipo
SuperpegamentoLoctite8040-00-142-9193Equipo
Software SutterPatchInstrumento Sutterhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchEquipo
Controlador de temperaturaWarner Instruments64-2400Equipo
XilazinaMP Biomedicina158307Reactivo

Referencias

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