Artículo de método

Ultrasonografía Doppler para imágenes en vivo y cuantificación de la función vascular ovárica en ratones

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DOI:

10.3791/69169

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14 de noviembre de 2025

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1Department of Animal Science, Cornell University, 2Biotechnology Resource Center Imaging Facility, Cornell University

En este artículo

Resumen

Los cambios en el flujo sanguíneo ovárico durante el período preovulatorio son esenciales para la ovulación. La ecografía Doppler se ha utilizado en humanos y animales grandes para evaluar la hemodinámica y la perfusión ovárica. Se presenta un protocolo para la aplicación de la ecografía Doppler para evaluar la hemodinámica ovárica durante las fases preovulatoria y periovulatoria en ratones.

Resumen

Para evaluar eficazmente la función vascular ovárica y comprender su papel en la fisiología y patología ovárica, los enfoques in vivo no invasivos son esenciales para capturar cambios en tiempo real sin interrumpir el flujo sanguíneo normal. La ecografía Doppler es una herramienta no invasiva bien establecida para evaluar el flujo sanguíneo ovárico en especies más grandes, pero su aplicación ha sido limitada en ratones, que son uno de los modelos animales más utilizados para la investigación en biología ovárica, como la ovulación. La ovulación es un proceso estrictamente regulado que depende de la maduración folicular coordinada estimulada por la hormona estimulante del folículo, seguida de un aumento preovulatorio de la hormona luteinizante (LH) que conduce a la ruptura de la pared del folículo y la liberación de ovocitos para la fertilización. El aumento de LH también desencadena una serie de cambios estructurales y funcionales en la vasculatura ovárica (remodelación vascular), como angiogénesis y constricción de capilares en el sitio de ruptura folicular poco antes de la ovulación. Además, se ha informado un rápido aumento en el flujo sanguíneo ovárico después del aumento de LH en múltiples especies, pero no en ratones. Este protocolo utiliza ecografía Doppler para visualizar la vasculatura ovárica murina y cuantificar los parámetros hemodinámicos. El protocolo presentado aquí informa métodos detallados para el cebado hormonal, la anestesia, el posicionamiento del ratón, la identificación del ovario y su vasculatura mediante Doppler de potencia y color, y la medición de la velocidad del flujo sanguíneo y los parámetros de resistencia. Este método permite la evaluación longitudinal en tiempo real de la función vascular ovárica en ratones vivos, proporcionando una poderosa herramienta para estudiar la función vascular ovárica tanto en contextos fisiológicos como patológicos.

Introducción

El ovario es un órgano altamente vascularizado, y los cambios cíclicos, estructurales y funcionales estrechamente regulados en su vasculatura (remodelación vascular) son esenciales para la fisiología ovárica normal, incluido el desarrollo del folículo, la ovulación y la formación del cuerpo lúteo 1,2,3,4. La remodelación vascular abarca una serie de procesos coordinados, como cambios en la permeabilidad vascular, angiogénesis, vasodilatación, vasoconstricción y cambios en el flujo sanguíneo (hemodinámica). Estos procesos permiten que el ovario ajuste rápidamente el suministro de sangre en respuesta a las señales hormonales a lo largo del ciclo estral 1,2,3,5,6,7,8,9. Las interrupciones en la remodelación vascular y el flujo sanguíneo ovárico afectan la ovulación y están implicadas en trastornos de fertilidad como el síndrome de ovario poliquístico 2,3,10,11. De manera similar, se ha demostrado que la obesidad interrumpe la angiogénesis y reduce la expresión de mediadores vasculares como la endotelina-212,13. Además, el síndrome de hiperestimulación ovárica, una complicación asociada principalmente a la estimulación ovárica a través del tratamiento con gonadotropina durante la fertilización in vitro, a menudo presenta un aumento del flujo sanguíneo estromal en el ovario, enfatizando las consecuencias perjudiciales de la función vascular desregulada14. En conjunto, estas condiciones resaltan el papel central de la remodelación vascular ovárica en el mantenimiento de la fertilidad femenina y subrayan la importancia de la hemodinámica en el apoyo a la función ovárica.

La evaluación precisa de la función vascular ovárica requiere la medición en tiempo real de la hemodinámica sin alterar el entorno fisiológico. En humanos y modelos animales grandes como bovinos, ovejas y caballos, la ecografía Doppler es una herramienta no invasiva ampliamente utilizada para evaluar el flujo sanguíneo ovárico y la arquitectura vascular 15,16,17,18. Esta técnica permite el análisis dinámico de la vascularización ovárica y captura los cambios en el flujo sanguíneo impulsados por hormonas, lo que ofrece información valiosa sobre la función y disfunción ovárica 15,16,17,18.

A pesar del uso extensivo de ratones de laboratorio como modelo para la investigación en biología ovárica debido a su corto ciclo reproductivo y manejabilidad genética, los métodos in vivo no invasivos para estudiar el flujo sanguíneo ovárico en este modelo siguen siendo limitados19,20. Los enfoques existentes se basan en procedimientos altamente invasivos que requieren la externalización del ovario (microscopía intravital), o en técnicas como el enfoque CLARITY o las imágenes de montaje completo que carecen de resolución temporal y alteran el contexto fisiológico 1,2,3,4. Como el modelo de mamíferos más utilizado para la manipulación genética y los estudios reproductivos, el ratón presenta una oportunidad para explorar los mecanismos moleculares de la hemodinámica ovárica y evaluar intervenciones dirigidas. Esto destaca la necesidad de enfoques de imágenes no invasivos, longitudinales y cuantitativos para monitorear los cambios vasculares ováricos dinámicos in vivo.

El proceso ovulatorio, un evento central en la fertilidad femenina, ejemplifica la importancia de la remodelación vascular ovárica en la fertilidad femenina. Comienza con la maduración folicular inducida por la hormona estimulante del folículo (FSH) y culmina con el aumento de LH que desencadena la ruptura folicular y la liberación de ovocitos1. Después de la estimulación con gonadotropina coriónica equina (eCG), que imita los efectos de la FSH, la red vascular ovárica se expande2. Este crecimiento vascular progresa hacia afuera desde la médula ovárica hacia la corteza para sostener los folículos en desarrollo2. Poco antes de la ovulación, los vasos sanguíneos se extienden hacia la capa de células de la granulosa y se observa vasoconstricción localizada en el ápice folicular, el sitio de eventual rupturay liberación de ovocitos. Estos cambios vasculares coordinados son críticos para una ovulación exitosa 1,2,3. Los estudios Doppler en modelos animales grandes y humanos han revelado cambios en la hemodinámica durante el período preovulatorio, incluido un rápido aumento en la perfusión ovárica y una redistribución localizada del flujo sanguíneo dentro del folículo preovulatorio, marcado por un aumento del flujo en la base (más cercano al estroma ovárico, opuesto al ápice) y una disminución del flujo en el ápice16. El aumento de la velocidad del flujo sanguíneo ovárico inmediatamente después del aumento de LH se asoció con una ovulación exitosa en mujeres15. Sin embargo, ningún estudio ha rastreado longitudinalmente estos cambios hemodinámicos en el ovario murino intacto, lo que limita nuestra comprensión de la remodelación vascular en este modelo ampliamente utilizado.

Para abordar esta brecha, presentamos un protocolo para la ecografía Doppler que permite la visualización no invasiva del ovario murino y su vasculatura, junto con la cuantificación de la hemodinámica ovárica, incluidos los índices de velocidad y resistencia. Aunque la sonda MS-700 utilizada en este estudio tiene una resolución limitada (axial/lateral: 30/58 μm), lo que impide el análisis detallado de los capilares, aún permite una visualización y cuantificación claras de los principales vasos sanguíneos ováricos. El uso de agentes de contraste en aplicaciones futuras puede mejorar aún más la visualización vascular. En general, este enfoque permite mediciones longitudinales repetidas en el mismo animal en puntos de tiempo definidos, como durante el período preovulatorio, al tiempo que preserva la integridad fisiológica, una ventaja clave sobre las técnicas invasivas existentes.

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Protocolo

Todos los ratones utilizados se mantuvieron en estricta conformidad con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, con la aprobación ética del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cornell. Todos los animales utilizados en este protocolo eran ratones C57BL6 inmaduros (21-23 días de edad).

1. Estimulación hormonal para la superovulación

  1. Inyecte ratones de 21-23 días de edad que pesen 10-12 g por vía intraperitoneal con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) seguida de 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) 48 h después. Prepare cada inyección diluyendo 50 μL de hormona (reconstituida a partir de un vial de reserva de 5000 UI) en 950 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato y administre 0,1 mL por ratón.

2. Secuencia de encendido de la máquina de ultrasonido y configuración del transductor

  1. Encienda la alimentación principal ubicada en la parte posterior del sistema de imágenes. Después de que se inicie el sistema, mueva el interruptor de espera de la computadora en el lado izquierdo del carro para activar el monitor y la computadora.
  2. Conecte el transductor deseado (MS-700 utilizado aquí - 30-70 MHz) al puerto del transductor activo de la unidad de imágenes (puerto más a la derecha). Alinee el pasador de bloqueo en el conector del transductor con la muesca en el puerto, luego empuje el conector completamente hacia adentro y gire la palanca de bloqueo a la posición vertical para asegurarlo.
  3. Inicie el software de análisis haciendo clic en el icono del software. Una vez que se abra el programa y se haya detectado el transductor (automáticamente), seleccione el paquete de aplicación de ovarios . Haga clic en Nuevo para crear un nuevo estudio y elija el nombre adecuado en el menú desplegable. En la ventana Información del estudio , ingrese los campos obligatorios: Nombre del estudio; Nombre de la serie; Paquete de aplicación: Ovario; Paquete de medición: Vascular.

3. Anestesia, preparación del ratón y configuración de la etapa de ultrasonido

  1. Encienda la unidad de monitoreo fisiológico (temperatura y frecuencia cardíaca). Asegúrese de que la plataforma esté calentada (37 °C).
  2. Verifique que el nivel de isoflurano esté por encima de la línea de llenado mínima en el depósito del vaporizador. Si es necesario, agregue isoflurano con el equipo de protección personal adecuado. Abra la válvula del tanque de oxígeno lenta y completamente. Ajuste el caudal de oxígeno a 1 litro por minuto.
  3. Ajuste la llave de paso en el tubo de la pieza en Y para permitir que el oxígeno y el isoflurano fluyan hacia la cámara de inducción. Asegúrese de que la llave de paso que conduce al cono de la nariz en la plataforma del mouse esté cerrada durante este paso. Ajuste el dial del vaporizador para que administre un 3-4% de isoflurano (vol/vol) para la inducción.
  4. Coloque el ratón en la cámara de inducción y cierre la tapa de forma segura.
    NOTA: La cámara de inducción es funcionalmente hermética. Nunca deje a un animal en una cámara sellada sin flujo de gas activo.
  5. Prepare la plataforma de imágenes aplicando una pequeña cantidad de crema para electrodos a cada uno de los electrodos para garantizar un contacto adecuado para el monitoreo de la frecuencia cardíaca.
  6. Una vez que el animal esté completamente sedado, redirija el flujo de gas abriendo la llave de paso al cono de la nariz en la plataforma de imágenes y cerrando la llave de paso a la cámara de inducción.
  7. Transfiera suavemente el ratón a la plataforma de imágenes calentada. Coloque el ratón en posición prona (lado dorsal hacia arriba) (Figura 1A). Coloque el cono de la nariz de forma segura sobre la nariz del animal, asegurándose de que tanto la nariz como la boca estén cubiertas para mantener la anestesia. Pegue cada pie en la crema de electrodos en la almohadilla de electrodos correspondiente para el monitoreo fisiológico. Aplique ungüento oftálmico para evitar que la córnea se seque durante la anestesia.
  8. Reduzca la concentración de isoflurano a 1.5-2.0% para mantener la anestesia girando la perilla hacia la izquierda. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia utilizando el método del reflejo de pellizco del dedo del pie (no se debe observar retirada). Controle cuidadosamente los signos vitales del animal cada 5 minutos durante la sesión de imágenes: (i) frecuencia respiratoria; (ii) frecuencia de los latidos del corazón; (iii) cualquier movimiento que pueda indicar molestias; y (iv) asegurarse de que la plataforma de imágenes se caliente a la temperatura correcta en todo momento.
  9. Prepare el cuadrante inferior derecho de la espalda afeitando el área con una afeitadora eléctrica. Afeitarse desde la extremidad posterior derecha hasta la línea media de la espalda, permaneciendo justo lateral a la columna vertebral. Aplique una fina capa de crema depilatoria corporal en el área previamente afeitada durante 30 s a 1 min para eliminar cualquier resto de vello. Limpie bien con una gasa húmeda. Aplique una capa generosa y uniforme de gel de ultrasonido en la región afeitada para garantizar un acoplamiento acústico óptimo.
  10. Coloque la sonda del transductor en modo transversal en relación con el mouse en el soporte mecánico con la muesca de orientación hacia la izquierda del operador. Asegure la sonda en su lugar con la abrazadera.

4. Identificación del ovario y de los vasos sanguíneos ováricos mediante ecografía Doppler

  1. En el panel de control, presione la tecla B-Mode para activar la ventana de imágenes en escala de grises estándar, que permite la visualización de estructuras anatómicas.
  2. Baje suavemente el transductor sobre el área afeitada cubierta con gel de ultrasonido.
    1. Asegúrese de que la plataforma de imágenes y el mouse estén colocados planos (paralelos a la superficie del banco) y que el transductor esté bajado perpendicularmente (ángulo de 90 ° - vertical) al mouse y la plataforma (Figura 1A).
    2. Para ubicar el ovario, tire de la piel hacia la izquierda, luego coloque el transductor cerca de la región superior del cuadrante afeitado, más cerca de la línea media de la espalda. Alinee el borde izquierdo de la sonda adyacente a la columna vertebral, con el borde derecho extendiéndose ligeramente sobre el flanco lateral derecho.
  3. Para identificar el ovario, primero detecte el riñón, una estructura ovoide grande de color gris claro (5 mm × 6 mm) con corteza y médula visibles. A continuación, empuje la plataforma de imagen ligeramente hacia delante (hacia la cabeza del ratón), haciendo que aparezca el ovario y el tejido adiposo periovárico (POAT).
    NOTA: El ovario es una estructura pequeña, circular, hipoecoica (gris oscuro), de aproximadamente 1 x 2 mm (en etapa preovulatoria), ubicada lateral a la médula espinal. El POAT parece hiperecoico (blanco brillante).
  4. Para capturar y almacenar videos del ovario en modo B, espere a que aumente el número de fotogramas (hasta 100 fotogramas) y presione el botón Cine Store en el teclado.
  5. Para confirmar la identificación de los ovarios y visualizar los vasos sanguíneos con alta sensibilidad al flujo de baja velocidad, cambie del modo B al modo Doppler de potencia presionando la tecla designada en el panel de control.
  6. Ajuste los siguientes ajustes Doppler de potencia para una visualización óptima de la vasculatura ovárica girando los mandos del teclado: Ganancia Doppler: 32-55 dB; Sensibilidad: 5; Rango dinámico: 15 DR; Velocidad 1 kHz.
    NOTA: Los valores se pueden ver en el panel lateral izquierdo y cambiarán cuando se giren las perillas
  7. En el modo Doppler de potencia o en el modo Doppler color (presione la tecla designada en el teclado), identifique los siguientes vasos moviendo la plataforma suavemente hacia adelante y hacia atrás para visualizar diferentes aspectos de la vasculatura: (i) La arteria ovárica (OA), que se ramifica desde la aorta abdominal y viene desde la dirección del POAT para ingresar al hilio ovárico; (ii) Los vasos medulares (MV) dentro de la médula central; y (iii) Los vasos corticales (CV) que rodean los folículos en desarrollo en la corteza externa (Figura 1B).
    NOTA: Es posible que los vasos corticales no sean visibles de manera constante debido a su pequeño diámetro y baja velocidad de flujo. Los vasos en la base del folículo son más fácilmente detectables, mientras que los del ápice a menudo no son visibles, particularmente justo antes de la ovulación.
  8. Presione Cine store para capturar videos del ovario y su vasculatura en modo Doppler a color o en color en cualquier momento para guardar el video que se muestra actualmente en la pantalla.
  9. Para distinguir entre flujo arterial y venoso, presione la tecla Color Doppler Mode en el teclado. En este modo, la dirección del flujo está codificada por colores: el rojo indica el flujo hacia el transductor, mientras que el azul indica el flujo que se aleja de él. El vaso con la velocidad promedio más alta es la arteria ovárica.
  10. Los cambios en la perfusión sanguínea se pueden apreciar en el modo Doppler de color o de potencia visualizando el tamaño de los vasos sanguíneos y la intensidad del color (amarillo en Doppler de potencia, rojo o azul en Doppler de color).

5. Evaluación de la hemodinámica con ecografía Doppler color y potencia

  1. Mientras está en el modo Doppler color o Doppler de potencia, presione el botón Doppler de onda pulsada (PW) en el teclado del sistema de ultrasonido. Esto abre la puerta de volumen de muestra (es decir, las dos líneas horizontales). Presione el botón PW por segunda vez para activar la forma de onda espectral Doppler en el panel inferior.
  2. Coloque la compuerta de la muestra (herramienta de medición ajustable: permite al usuario definir el área donde se medirán las velocidades) dentro del centro de la luz del vaso, asegurando la alineación con la dirección del flujo sanguíneo. Ajuste el ángulo de insonación para que sea lo más paralelo posible al recipiente y manténgalo a ≤60 ° para garantizar cálculos de velocidad precisos. Ajuste el ángulo de insonación girando la perilla de ángulo correspondiente.
  3. Coloque la compuerta de muestra en las siguientes posiciones para cada tipo de recipiente. Arteria ovárica: dentro del vaso justo proximal a su punto de entrada al ovario. Vaso medular: en el punto central de ramificación, donde la VM se ramifica en vasos corticales. Este punto de ramificación aparece como un charco de sangre justo después de ingresar al ovario. Vaso cortical: dentro de un vaso en la base de un folículo en crecimiento, cuando es identificable.
  4. Una vez que la puerta de muestra esté colocada en la ubicación deseada y se vea una forma de onda de pulso clara, presione Cine Store para grabar y guardar tanto la imagen de ultrasonido como la forma de onda Doppler espectral correspondiente.
  5. Una vez completada la imagen, retire suavemente el mouse de la plataforma de imágenes. Limpie cualquier gel de ultrasonido de la parte posterior y coloque el mouse sobre una almohadilla térmica hasta que se despierte por completo.

6. Exportación y almacenamiento de datos

  1. Después de completar todas las imágenes y guardar los fotogramas fijos y bucles de cine deseados utilizando la función Cine Store , presione el botón Gestión de estudios ubicado en la parte superior izquierda del teclado del sistema de ultrasonido. Esto abrirá la ventana del Navegador de estudio , mostrando una lista de todas las imágenes guardadas y bucles de cine de la sesión actual.
  2. En la ventana Navegador de estudio , seleccione los archivos que desea guardar.
    1. Para guardar una serie completa, seleccione el nombre de la serie correspondiente: esto resaltará automáticamente todas las imágenes asociadas y los bucles de cine. Haga clic en el botón Copiar a para continuar.
    2. Cuando se le solicite, haga clic en la carpeta de destino o en la unidad externa donde se deben guardar los archivos exportados. Confirme que el formato de archivo y la ruta de destino son correctos antes de finalizar la exportación.

7. Apague la secuencia y limpie

NOTA: Estos pasos deben completarse inmediatamente después de que se concluya la creación de imágenes y se hayan guardado y exportado todos los datos.

  1. Después de exportar todos los datos necesarios, haga clic en el icono Apagar en la ventana Navegador de estudio de la aplicación de software de análisis. Esto apagará de forma segura tanto la computadora de adquisición como el panel de control.
  2. Deje que los ventiladores de enfriamiento del sistema funcionen durante 5-10 minutos. Una vez que se complete el enfriamiento, apague la alimentación principal usando la palanca ubicada en la parte posterior del carro de imágenes.
  3. Apague todos los equipos auxiliares: suministro de oxígeno, vaporizador de isoflurano y unidad de monitoreo fisiológico.
  4. Limpie el transductor de ultrasonido: primero limpie cualquier resto de gel de ultrasonido con toallitas sin pelusa, luego desinfecte la superficie con toallitas húmedas sin pelusa o toallitas desinfectantes recomendadas para equipos electrónicos sensibles.
  5. Limpie la plataforma del mouse y el teclado con toallitas desinfectantes. No use alcohol etílico en los electrodos de la plataforma del mouse, ya que puede dañar los componentes sensibles.
  6. Limpie la cámara de inducción con toallas de papel húmedas. Deseche las toallas de papel en el contenedor de desechos de riesgo biológico.
  7. Deseche todos los materiales de un solo uso (p. ej., guantes, cinta quirúrgica, gasa, aplicadores con punta de algodón) en el contenedor de riesgo biológico designado.

8. Medición de parámetros hemodinámicos mediante formas de onda de pulso Doppler

  1. En la aplicación de análisis, haga clic en copiar desde, seleccione el nombre adecuado en el menú desplegable, navegue hasta donde se guardó el estudio, selecciónelo y haga clic en Aceptar para importarlo.
  2. Abra la imagen PW Doppler deseada y haga clic en el icono de medidas en la esquina inferior izquierda para abrir el panel de medición.
  3. Haga clic en la herramienta de medición de velocidad en la esquina superior izquierda del panel de medición para cuantificar las tres velocidades sistólicas máximas (PSV) y las velocidades diastólicas finales (EDV) más altas de la forma de onda Doppler espectral haciendo clic en la parte superior de las ondas PSV y EDV (la herramienta medirá automáticamente el tamaño de la onda desde el punto de clic hasta el eje x). Solo incluya formas de onda que muestren al menos tres ciclos cardíacos distintos con picos claros y consistentes de PSV y EDV.
  4. Para calcular la velocidad media, primero calcule el promedio de los tres valores de PSV seleccionados y el promedio de los tres valores de EDV. Luego calcule la velocidad media usando la fórmula: Velocidad media = (PSV promedio + EDV promedio) / 2.
  5. Para velocidades por debajo del umbral de detección de 10 mm/s, asigne un valor de 5 mm/s (velocidad media por debajo del umbral) o descarte la medición en función del propósito de la investigación.
  6. Para calcular el índice resistivo (RI), utilice la fórmula estándar: RI = (PSV - EDV)/PSV. Este índice proporciona una medida de la resistencia vascular y debe calcularse utilizando los valores promedio de PSV y EDV para mayor precisión.
  7. Para calcular el índice de pulsatilidad (PI), utilice la fórmula estándar: PI = (PSV - EDV)/Velocidad media

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Resultados

El objetivo de este protocolo es aplicar la ecografía Doppler para visualizar el ovario murino y su vasculatura, evaluar los cambios en la perfusión ovárica y cuantificar la hemodinámica ovárica.

La Figura 2 muestra imágenes representativas del mismo ovario en múltiples puntos de tiempo durante el período periovulatorio (12 h antes y 12 h después de la ovulación) después de la inyección de hCG. La Figura 2A

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Discusión

Este estudio presenta un método no invasivo para visualizar y cuantificar la hemodinámica ovárica in vivo mediante ecografía Doppler. A diferencia de los métodos existentes, este enfoque permite la evaluación en tiempo real del flujo sanguíneo sin interrumpir la función vascular. La ecografía Doppler es una herramienta ampliamente utilizada y eficaz para evaluar la morfología ovárica y la función vascular en humanos y modelos animales grandes 15,16,17,18....

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue respaldado por NICHD 1R01HD109392. Los datos de imágenes se adquirieron a través de la Instalación de Imágenes del Centro de Recursos de Biotecnología (BRC) de Cornell, con S10OD016191 de los NIH para el ultrasonido VisualSonics Vevo-2100.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cinta quirúrgica 3MVWR International LLCMMM1534-3
Gel de transmisión de ultrasonidos Aquasonic Clear  ParkerPKR-03-08
Cortadora de peloSkull Shaver LLCBBT 2020
Gonadotropina Coriónica HumanaSigma Aldrich9002-61-3
Nair Body Cream depiladorNairDepilación
Optixcare Eye Lube Plus AventixOPX-4252
Crema para electrodos Parker SignacremeParkerPKR-17-05-CS
Suero de yegua embarazada GonadotropinaEnzimas creativasNATE-0969
Sistema de imagen VisualSonics Vevo 2100VisualSonics Inc.

Referencias

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