Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides

Resumen

Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.

Resumen

Cuerpos embrioides (EB) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de la creación de estos agregados es el método de la gota colgante, un enfoque laborioso de pipeteo un número arbitrario de las células en placas. Las interacciones entre las células madre obligado a cerca de uno al otro promueve la generación de la EBS. Debido a que los medios de comunicación en cada uno de los pozos tiene que ser intercambiados de forma manual todos los días, este enfoque es manual intensivo.

Además, debido a los parámetros ambientales como la célula-célula, las células interacciones de los factores solubles, pH, y la disponibilidad de oxígeno pueden ser funciones del tamaño de EB, las poblaciones de células obtenidas a partir de gotas colgantes tradicionales pueden variar considerablemente, incluso cuando se cultivan en condiciones idénticas. Estudios recientes han demostrado claramente que el número inicial de células que forman el conjunto puede tener efectos significativos sobre la diferenciación de células madre. Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado. Se demuestra que este método mediante la creación de cuerpos embrioides con una línea roja fluorescente de células de ratón (129S6B6-F1).

Protocolo

1. Hacer Shrinky Dink-Moho

1. Imprimir el modelo deseado en la hoja de Shrinky-dink con una impresora buena definición.
2. Hornee Shrinky-dink hoja a 163 ° C durante unos 10 minutos, o hasta que esté completamente reducido y haber adquirido una forma regular.
3. Después de Shrinky-dink molde se haya enfriado, se sumergen en un baño de isopropanol hasta que la superficie total es de apenas cubiertos.
4. Cuidadosamente, rociar un poco de acetona sobre el molde y agitar contenedores un par de veces. Añadir más isopropanol para vaciar el exceso de acetona y repetir este paso varias veces hasta que Shrinky el molde se ve limpio.
5. Molde....

Discusión

Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated (moldeados a partir de Shrinky-Dinks) y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado, ya que elimina la necesidad de fotolitografía. Podemos variar el tamaño de las cúpulas, así como la concentración de.......

Materiales

Para los medios de comunicación MESC (McCloskey laboratorio protocolo): (por los medios de comunicación total preparado: 50ml, 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml, 15 ml 1x Penn-estreptococo: 0.5 ml, 1 ml 2 mM L-glutamina: 0,5 ml, 1 ml AANE: 0.5 ml, 1 ml LIF: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50 ul, 100 ul diluido BME:. 50 ul, 100 ul (Agregar 35ul de BME filtrado estéril de 5 ml de PBS y filtro de jeringa de esterilizar Descartar después de 2 semanas. La concentración final en la solución es 0,1 mM)