Artículo de método

Modelo de defecto óseo diáfisario semisegmentario en ratas para evaluar el rendimiento de sustitutos óseos en regiones portantes

DOI:

10.3791/69211

30 de diciembre de 2025

En este artículo

Resumen

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Este estudio estableció un modelo de defecto semisegmentario femoral de rata para evaluar el rendimiento mecánico y osteogénico de materiales sustitutos óseos bajo condiciones portantes sin el uso de fijación interna o externa.

Resumen

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La evaluación preclínica precisa de materiales sustitutivos óseos exige modelos que no solo apoyen la regeneración tisular, sino que también reflejen los desafíos mecánicos de las condiciones fisiológicas de carga. Sin embargo, la mayoría de los modelos convencionales de defectos óseos animales no cumplen con este aspecto. Por ejemplo, los modelos de defectos calvariales, aunque ampliamente utilizados, se crean en regiones no portantes de carga. De manera similar, los defectos de perforación o parciales en huesos largos se centran principalmente en la cicatrización localizada, careciendo de una transferencia de carga suficiente para evaluar el soporte mecánico. Este estudio estableció un modelo estandarizado de defecto óseo diáfisario semisegmentario en el fémur de rata para evaluar tanto el rendimiento mecánico como biológico de los materiales sustitutos óseos en un contexto portante sin el uso de dispositivos de fijación. Utilizando una pieza de mano rápida y una fresa dental cilíndrica especializada, se creó un defecto semicilíndrico de 4 mm de longitud y 1,5 mm de radio en el eje medio lateral del fémur. Se implantaron dos materiales representativos con propiedades distintas —el hidrogel de gelatina metacriloiloida (GelMA) y el polimetilmetacrilato impreso en 3D (3DP-PMMA)— para validar la capacidad del modelo de diferenciar las propiedades mecánicas de los materiales. Los análisis radigráficos, histológicos e inmunofluorescentes realizados a las 4 semanas tras la implantación revelaron que, debido a un soporte mecánico inadecuado, la implantación de GelMA condujo a una malunión con predominancia de tejido fibroso y a una integración ósea limitada. En contraste, el 3DP-PMMA facilitó la organización de la formación ósea nueva, la continuidad periostal y el reclutamiento de células tipo piezosensible mecanosensible al componente 1 del canal iónico (Piezo1+) y de la expresión del receptor de leptina (LepR+). Este modelo proporciona una plataforma práctica y reproducible para evaluar la capacidad de carga, la osteoinductividad y el potencial de osseointegración de los biomateriales. Puede servir como una herramienta valiosa para seleccionar materiales candidatos a aplicaciones ortopédicas, como la reconstrucción del hueso largo o la reparación de fracturas.

Introducción

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En condiciones fisiológicas, el hueso desempeña un papel central en el mantenimiento de la integridad estructural y la función mecánica del cuerpo. Soporta el peso corporal, permite el movimiento y protege los órganos internos. Cuando el hueso se daña debido a un traumatismo, resección tumoral o infección, especialmente en regiones portantes, la continuidad mecánica se interrumpe. Esta alteración suele provocar complicaciones como deformidad ósea, movilidad reducida, inestabilidad de las extremidades, dolor crónico e incluso problemas potencialmente mortales derivados de fracturas graves yhemorragias 1,2. Hoy en día, se han aplicado clínicamente sustitutos óseos como el injerto óseo y biomateriales para reemplazar tejido óseo gravemente dañado o restaurar defectos óseos a gran escala. De manera similar, para los sustitutos óseos implantados, su rendimiento mecánico comprometido puede provocar fallo del implante, resultando en fracturas no unidas o incluso catastróficas en el sitio deldefecto 3,4. Para restaurar tanto la estructura como la función, los materiales de sustitución ósea no solo deben promover la regeneración ósea, sino también poseer suficiente resistencia mecánica para soportar cargasfisiológicas 5.

Un paso crítico previo a la traducción clínica es la evaluación realista de si un biomaterial, una vez implantado in vivo, puede satisfacer las demandas mecánicas necesarias para el soporte estructural en regiones óseas portadoras. Aunque muchos biomateriales han mostrado potencial in vitro o en modelos pequeños y no portantes, su traslado a la práctica clínica suele verse obstaculizado por la falta de modelos preclínicos fiables que simulen condiciones mecánicas in vivo. Los modelos animales actualmente utilizados para estudios de defectos óseos incluyen defectosmandibulares 6, defectoscalvariales 7, defectos de perforación en huesoslargos 8, alveollospost-extracción 9, y así sucesivamente. Estos modelos evalúan principalmente la capacidad osteogénica de un material y se centran en los puntos finales de regeneración histológica oradiográfica 10,11. Sin embargo, considerando que estos sitios son o bien no portantes o están protegidos mecánicamente, no logran replicar las condiciones de tensión dinámica que se encuentran en los huesoslargos 12. Incluso cuando las propiedades mecánicas se prueban mediante técnicas in vitro como ensayos de compresión o resistencia a la tracción, estas no logran replicar la carga dinámica y las interacciones tisulares inherentes a los entornos invivo 13.

Una gran carencia en la investigación preclínica sigue siendo la falta de un modelo animal estandarizado y reproducible que permita la evaluación mecánica in vivo de sustitutos óseos bajo condiciones portantes. Para abordar esto, el estudio actual estableció un modelo semisegmentario de defecto óseo diáfisario en ratas. Este modelo proporciona un sitio de defecto estable y reproducible en una región portante, permitiendo la evaluación directa de la capacidad de soporte mecánico de los materiales sustitutivos óseos bajo carga fisiológica, y al mismo tiempo que permite la evaluación de los resultados osteogénicos. Además, el modelo puede aplicarse a diversas especies animales, ajustando el tamaño y la ubicación de los defectos según el animal específico utilizado. No obstante, no replica completamente el complejo entorno biomecánico de los huesos humanos, y para estudios centrados únicamente en defectos no portantes, cicatrización del hueso craneal o implantes estructurales muy grandes, pueden ser más adecuados modelos alternativos.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio recibieron la aprobación del Comité Ético de la Escuela de Estomatología de China Occidental, Universidad de Sichuan (WCHSIRB-AT-2025-342). Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley machos (180 g cada una) de una fuente comercial y se asignaron aleatoriamente a dos grupos (n = 6 por grupo) según el material implantado. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación preoperatoria

  1. Artículos quirúrgicos
    1. Preparar los instrumentos quirúrgicos que se refieran a la Figura 1A, correspondientes a las etiquetas numeradas en la figura, en el siguiente orden: pinzas curvas, bisturí estéril desechable, tijeras rectas, elevador periostal, aguja de riego, una fresa dental específica de diamante (ver la vista ampliada en la Figura 1B), pieza de mano de alta velocidad, calibrador vernier, motor quirúrgico, sutura monofilamento (4-0) y soporte aguja.
    2. Prepare solución salina estéril al 0,9% para el riego.
  2. Esterilización y desinfección
    1. Esteriliza los instrumentos quirúrgicos que resistan el autoclave, como pinzas curvas, tijeras, elevador periostal, fresa dental de diamante, manoplazo de alta velocidad y portaagujas.
      NOTA: Los instrumentos deben envolverse en tejidos médicos no tejidos y sellarse con cinta de autoclave para la esterilización por vapor a 121-134 °C durante 20-25 minutos.
    2. Para instrumentos sensibles al calor, como pinzas vernier y motores quirúrgicos, expónselos a la luz ultravioleta durante al menos 30 minutos para su desinfección. Los artículos desechables, como el bisturí estéril desechable, la aguja de riego y las suturas, deben permanecer sellados en su embalaje estéril original hasta su uso.
    3. Asegúrate de que el entorno quirúrgico sea estéril y tenga control de temperatura. Limpia el banco quirúrgico y las superficies circundantes con etanol al 75%. Utiliza tejidos estériles, de grado médico y no tejidos para cubrir la mesa de operaciones.
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable; Manejar lejos de las fuentes de encendido y guardarlas en recipientes cerrados. Recoge los residuos de etanol en recipientes designados para residuos químicos para su correcta eliminación. Lleva el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad.
  3. Anestesia
    1. Pesa a la rata y calcula la dosis anestésica (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina intraperitonealmente).
    2. Inducir anestesia 20 minutos antes de la cirugía (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados) y confirmar su profundidad comprobando la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo y la pérdida del reflejo de enderezamiento.
    3. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar el secamiento corneal durante el procedimiento.

2. Procedimiento quirúrgico

  1. Preparación del sitio
    1. Coloca a la rata en una posición lateral recostada sobre el banco quirúrgico estéril. Afeitar la zona lateral del muslo correspondiente a la proyección del fémur y desinfectar la piel usando tintura de yodo al 2%, seguida de etanol al 75% (Figura 2Ba).
      PRECAUCIÓN: La tintura de yodo es inflamable e irritante. Maneja en un lugar bien ventilado usando guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Desechar las toallitas y soluciones usadas en contenedores de residuos químicos designados según las normativas de seguridad institucional.
    2. Cubre el lugar quirúrgico con la sábana estéril fenestrada para mantener la asepsia.
  2. Apertura del sitio quirúrgico
    1. Utiliza pinzas curvas para ayudar a estabilizar los tejidos, sujetar los músculos y asegurar suavemente el fémur durante toda la intervención quirúrgica (Figura 2Bb-h).
    2. Realiza una incisión longitudinal cutánea de 2-3 cm sobre la parte lateral del muslo con unas tijeras rectas para exponer los músculos subyacentes (Figura 2Bb).
    3. Identificar los músculos recto femoral y vasto lateral, y sepáralos cuidadosamente a lo largo de la fascia blanca visible (indicada por la flecha amarilla en la Figura 2Bb) usando unas tijeras rectas (Figura 2Bc).
    4. Localiza y expone las inserciones musculares en la superficie lateral del fémur (Figura 2Bd).
    5. Realiza una incisión longitudinal a lo largo de las inserciones musculares con un bisturí estéril desechable para acceder a la superficie femoral (Figura 2Be).
      NOTA: Al realizar una disección aguda (con tijeras o bisturí) para separar los tejidos blandos, ten cuidado de no dañar los vasos sanguíneos y nervios subyacentes. Si no conoces las estructuras anatómicas, utiliza pinzas de punta fina y un elevador periósteal para realizar una disección roma.
    6. Realizar una disección roma utilizando un elevador perióstico para desprender las inserciones musculares y exponer completamente la diáfisis media del fémur (Figura 2Bf).
    7. Separa además el fémur de los músculos circundantes y sujeta el diáfise medio del fémur usando pinzas curvas (Figura 2Bg).
  3. Establecimiento del modelo de defecto óseo diafisario semisegmentario
    1. Fije la fresa cilíndrica específica de diamante dental de extremo plano (Figura 1B) a la pieza de mano de alta velocidad, accionada por el motor quirúrgico. Pon el motor quirúrgico a 35.000 rpm.
    2. Con visualización directa, identifica el punto más alto del mediodiástico femoral como el centro anatómico para la creación de defectos. Perforar verticalmente hacia abajo en este punto usando la fresa hasta observar una pérdida repentina de resistencia, acompañada de la aparición de derrame sanguíneo dentro del defecto, lo que indica penetración cortical completa y acceso a la cavidad medular (Figura 2Bh).
      NOTA: Dada la variabilidad interanimal en el grosor cortical, se recomienda a los operadores familiarizarse con la anatomía femoral y realizar entrenamiento preexperimental para estandarizar este paso.
    3. Ampliar el defecto aplicando movimientos horizontales controlados de empuje-tirón centrados en el punto de penetración inicial. Extiende el defecto longitudinalmente (a lo largo del eje femoral) y lateralmente (a lo largo del diámetro femoral) para formar gradualmente un defecto semicilíndrico estandarizado de 4 mm de longitud y 1,5 mm de radio (Figura 2Bi, véase la Figura 2A para la morfología y posición del defecto).
      NOTA: Una vez establecido el punto central, utilice un calibrador vernier para ayudar en el agrandamiento escalonado de defectos, asegurando dimensiones uniformes en todos los ejemplares. El diseño cilíndrico de extremo plano de la fresa dental especializada coincide con el defecto semicilíndrico, permitiendo una preparación eficiente y reproducible.
    4. Riega continuamente el lugar quirúrgico con solución fisiológica estéril utilizando la aguja de riego para evitar necrosis térmica durante el corte óseo.
  4. Implantación por sustituto óseo
    1. Retira suavemente los restos óseos e irriga el lugar para eliminar las partículas residuales.
    2. Implantar hidrogeles de gelatina metacriloiloida (GelMA) no portantes (véase Tabla de Materiales) o polimetilmetacrilato impreso en 3D (3DP-PMMA) para ensayos mecánicos en el sitio del defecto, asegurando un ajuste ajustado (Figura 2Bj).
      NOTA: Los dos biomateriales utilizados aquí fueron seleccionados deliberadamente para representar propiedades mecánicas y biológicas contrastantes: el hidrogel GelMA actúa como un material blando y no portante con potencial osteogénico limitado, mientras que el 3DP-PMMA actúa como un andamio rígido y portante capaz de transmitir eficazmente el estrés y de apoyar la formaciónósea 14 (Figura 2A). Este contraste resalta la capacidad del modelo para evaluar implantes con una amplia gama de resistencia mecánica y rendimiento biológico, y en la práctica, el modelo de defectos puede aplicarse para probar otros materiales candidatos con propiedades mecánicas.
  5. Cierre del sitio quirúrgico
    1. Sutura las capas musculares usando suturas monofilamentos 4-0 y un soporte para agujas, teniendo cuidado de evitar una tensión excesiva (Figura 2Bk).
    2. Realizar cierre de la piel con suturas interrumpidas y desinfectar el lugar quirúrgico utilizando solución de iodóforo al 2% (Figura 2Bl).

3. Cuidados postoperatorios

  1. Transfiere a las ratas a una almohadilla eléctrica desinfectada y constante (37 °C) para permitir la recuperación postoperatoria.
  2. Administrar analgesia postoperatoria adecuada (por ejemplo, buprenorfina a 0,03 mg/kg por vía subcutánea cada 12 horas durante 48-72 horas).
  3. Cuando las ratas recuperen la conciencia, colócalas en jaulas limpias con cama suave y fácil acceso a comida y agua.
  4. Vigila diariamente la zona quirúrgica en busca de signos de infección, dehiscencia o hinchazón anormal. Observa el comportamiento, peso y movilidad de las ratas durante al menos 7 días tras la cirugía para asegurar la recuperación y evaluar su bienestar.

4. Recolección de muestras y datos

  1. Recogida de muestras
    1. Eutanasia a las ratas con inhalación de dióxido de carbono seguida de confirmación secundaria (siguiendo protocolos aprobados por la institución).
    2. Extraer los ejemplares de fémur a las 4 semanas de la implantación, con animales inicialmente aleatorizados en dos grupos de materiales (n = 6 por grupo) para evaluar el rendimiento mecánico de los materiales.
      NOTA: En el grupo GelMA, tres animales desarrollaron fracturas completas poco después de la cirugía y fueron excluidos, dejando tres muestras disponibles para análisis posteriores.
    3. Fijar las muestras femorales con paraformaldehído al 4% durante 48 horas a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora certificada. Lleva guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad o pantalla facial. Recoge las soluciones de residuos en contenedores de residuos químicos peligrosos etiquetados para su eliminación.
  2. Evaluación por microtomografía computarizada (μCT)
    1. Realizar un escaneo μCT en muestras femorales recogidas a las 4 semanas postimplantación con los siguientes parámetros de escaneo: potencial de tubo de rayos X, 70 kVp; Intensidad de rayos X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tiempo de integración, 1 x 300 ms; y tamaño voxel de 17 μm.
    2. Realizar la reconstrucción 3D usando los scripts predefinidos proporcionados en el software de la máquina μCT. Genera imágenes transversales del sitio del defecto utilizando la función de recorte de un software dedicado al procesamiento de imágenes. Sigue los flujos de trabajo estándar descritos en los manuales de software correspondientes.
  3. Tinción histológica
    1. Descalcifique las muestras a 4 °C usando ácido etilendediaminético (EDTA) al 12% (pH 7,2) durante 6 semanas en un shaker.
      NOTA: Cambia la solución EDTA cada 2 días. Verifica regularmente el progreso de la descalcificación. La descalcificación se completa cuando la muestra es flexible bajo presión o pasa por una aguja.
      PRECAUCIÓN: Desechar las soluciones EDTA según las directrices institucionales para residuos químicos acuosos. El material biológico contaminado debe tratarse como residuos biopeligrosos.
    2. Deshidrata las muestras en una serie graduada de diluciones de etanol y luego insíguelas en parafina.
    3. Corta las muestras incrustadas en parafina sagittalmente en rodajas de 6 μm de grosor.
      NOTA: Asegúrese de que las secciones incluyan la interfaz entre el material implantado y el tejido huésped.
    4. Realizar la tinción con hematoxilina-eosina (H&E) y la tinción tricroma de Masson utilizando kits comerciales disponibles (véase Tabla de Materiales). Realizar todos los procedimientos estrictamente conforme a los protocolos estándar del fabricante sin ninguna desviación. Observa la cicatrización del sitio del defecto mediante la histopatología.
      PRECAUCIÓN: Eliminar las soluciones de mancha y los consumibles contaminados de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad y eliminación de residuos peligrosos.
  4. Tinción inmunofluorescente (IF)
    1. Deparafinizar y rehidratar secciones de parafina de 6 μm de espesor utilizando una serie de soluciones de xileno y etanol graduado.
      PRECAUCIÓN: El xileno es inflamable y tóxico. Manipula xileno en una campana extractora usando guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Recoger los disolventes de residuos por separado en recipientes de residuos químicos para su correcta eliminación.
    2. Realizar la extracción de antígenos incubando las láminas en un tampón de citrato (pH 6,0) a 95-100 °C durante 15-20 minutos. Deja que las láminas se enfríen de forma natural a temperatura ambiente.
    3. Lava las secciones con suero salino tamponado con fosfato (PBS) durante 5 minutos y trata las secciones con 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 20 minutos para facilitar la penetración de anticuerpos. Luego bloquea los sitios de unión no específicos con albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: El Triton X-100 es un irritante; Maneja con guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad en un lugar ventilado. Desechar las soluciones Triton X-100 como residuos químicos en recipientes designados. Para todos los procedimientos, las soluciones que hayan estado en contacto con secciones de tejido, como BSA y PBS, deben considerarse residuos biológicos y deben ser recogidas y eliminadas conforme a los protocolos institucionales de bioseguridad.
    4. Incubar las secciones con anticuerpos primarios (componente 1 del canal iónico mecanosensible tipo piezo (Piezo1), diluido 1:200; receptor antileptina (LepR), diluido 1:50) en el tampón de dilución de anticuerpos. Aplicar 50 μL de solución diluida de anticuerpos en cada sección e incubar durante 12-18 horas a 4 °C en la oscuridad en una cámara humidificada.
    5. Lava las láminas con PBS (3 × 5 min) y luego incubalas con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo (diluido 1:200). Aplicar 50 μL de solución diluida de anticuerpos en cada sección e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad en una cámara humidificada.
    6. Enjuaga las láminas de nuevo en PBS (3 × 5 min), luego contra-tinte los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluido 1:50) durante 5 minutos.
    7. Monta las secciones con medio antidescoloración y cubre con un abrigo de cobertura.
    8. Visualiza y captura imágenes usando un microscopio confocal de barrido láser con la configuración adecuada del filtro.

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Resultados

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En este estudio, se estableció el modelo de defecto óseo diáfisario semisegmentario en ratas perforando un defecto de 4 mm de longitud y 1,5 mm de radio en el centro del fémur con una fresa cilíndrica específica de diamante de extremo plano (Figura 2A). Para demostrar la capacidad del modelo para probar el rendimiento mecánico y biológico de los materiales, establecimos dos grupos de comparación, con defectos implantados con hidrogeles GelMA o 3DP-PMMA (

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Discusión

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Además de las propiedades ampliamente enfatizadas de osteoinductividad, osteointegración ybiocompatibilidad 5, la respuesta mecánica y la capacidad de carga de los sustitutos óseos son igualmente vitales, especialmente para reparar defectos en huesos quesoportan peso 22. Las evaluaciones convencionales del rendimiento mecánico suelen basarse en métodos in vitro, como máquinas de prueba universal, pruebas de compresión o análisis de...

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Divulgaciones

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Todos los datos y las imágenes originales están incluidos en este artículo. Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Sichuan (2025ZNSFSC0754).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de iodóforo al 2%Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Ninguno
Polimetacrilato de polimetil impreso en 3D (3DP-PMMA)amablemente proporcionado por la Facultad de Ciencia e Ingeniería de Polímeros de la Universidad de SichuanNinguno
4% de paraformaldehídoBiosharpBL539A
75% de etanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Ninguno
Bolas de algodónHaishi Hainuo Group Co.,   Ltd.Ninguno
Palitos de algodónLakong Medical Devices Co., Ltd.Ninguno
Solución de tinción DAPIBeyotime Cat#C1005
Bisturí estéril desechableHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.20100227
Gelatina metacriloilo-hidrogeles (GelMA)amablemente proporcionado por la Facultad de Ciencia e Ingeniería de Polímeros de la Universidad de SichuanNinguno
GelMA 20%CellinkIKG125000005
IgG Anti-Ratón de Cabra y H L (Alexa Fluor 594)Abcamab150116
Cabras Anti-Conejo IgG y L (Alexa Fluor y registro 488)Abcamab150077
Kit de manchas de hematoxilina y eosinaBiosharpC1005
Pieza de mano de alta velocidadFoshan SCS Medical Instrument Co., Ltd.9018499000
Aguja de riegoSichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Ninguno
Masson' s Kit de tinte tricromoSolarbioG1340
Tejidos no tejidos médicosHenan Yadu Industrial Co., Ltd. & nbsp;Ninguno
Tejidos no tejidos médicosHenan Yadu Industrial Co., Ltd. & nbsp;Ninguno
Tomografía microcomputarizada (& micro; CT) Scanco Medical AGμ CT 45
Imita 20.0 para imágenes de sección transversal (función de recorte)MaterialiseNinguno
PortaagujasChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno
Anticuerpo Ob-R/Receptor de Leptina (B-3)Santa CruzSC-8391
Sistema de escaneo de diapositivas enteras de grado Olympus Research VS200Chengdu Knowledge Technology Co., LtdVS200
Elevador periósticoChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno
Anticuerpo PIEZO1NovusNBP1-78446
Solución salinaSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Ninguno
Software de visualización médica Scanco para reconstrucción de imágenes 3D (scripts predefinidos)Scanco Medical AGNinguno
Fresa dental específica para diamantes (TF-22/170-021m/845-021m)Compañía de Materiales Dentales DiantongNinguno
Ratas Sprague-Dawley...Byrness Weil Biotech LtdNinguno
Tijeras rectasChengdu Shifeng Co., Ltd.Ninguno
Motor quirúrgicoMARATÓNN3-140232
Suturas quirúrgicas (monofilamento 4-0)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Ninguno
Pinza vernierDe charcuteríaDL91150

Referencias

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