El objetivo de este protocolo es proporcionar ejercicios de vuelo para la mosca de la fruta Drosophila. Los resultados representativos muestran que el entrenamiento con ejercicios de vuelo da como resultado una mayor capacidad aeróbica y resistencia a una dieta alta en grasas.
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Artículo de método
FLEX: Protocolo de entrenamiento de ejercicios de vuelo para la mosca de la fruta Drosophila
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Resumen
Resumen
Drosophila se ha convertido recientemente en un modelo popular para estudiar la obesidad y los trastornos relacionados. Si bien es relativamente fácil inducir trastornos metabólicos en Drosophila utilizando dietas específicas, crear un modelo de ejercicio para las moscas es más desafiante. Los métodos existentes, como Power Tower y Treadwheel, utilizan viales agitadores o giratorios para inducir a las moscas a subir, aprovechando su respuesta geotaxis negativa. Sin embargo, la escalada continua durante largos períodos no es natural para las moscas y puede provocar lesiones y muertes relacionadas con el ejercicio. Este documento presenta un nuevo protocolo de ejercicio que aprovecha la capacidad natural de la mosca para volar, ofreciendo un enfoque de ejercicio más natural, fisiológico y libre de lesiones. Los experimentos muestran que un régimen de ejercicio de vuelo de 5 días aumenta la capacidad bioenergética de la mosca y contrarresta los efectos adversos de una dieta occidental (WD), mejorando el comportamiento de escalada y reduciendo la mortalidad asociada a WD. Este protocolo permite el entrenamiento simultáneo de un gran número de moscas para estudiar la interacción entre el ejercicio y varios factores, incluida la dieta, los medicamentos, el envejecimiento y la genética. Juntos, este método puede complementar los métodos existentes para estudiar los efectos del ejercicio en la fisiología y el comportamiento de las moscas.
Introducción
La actividad física y el ejercicio son el foco de una intensa investigación por sus beneficios inmediatos y a largo plazo para la salud1. Debido a su poderoso efecto sistémico sobre el metabolismo, el ejercicio se utiliza cada vez más para prevenir y tratar trastornos metabólicos, cardiovasculares y neurológicos 2,3,4. A pesar de la creciente evidencia de los numerosos beneficios para la salud asociados con el ejercicio regular, los mecanismos moleculares exactos que sustentan esos beneficios siguen siendopoco conocidos. Para comprender estos mecanismos, es esencial el uso de modelos animales innovadores y de alto rendimiento. Si bien los modelos de roedores se utilizan comúnmente para investigar el impacto del ejercicio en las enfermedades metabólicas, tales estudios requieren costos significativos, supervisión regulatoria y equipo especializado 6,7.
Recientemente, Drosophila melanogaster ha surgido como un nuevo modelo para investigar la biología del ejercicio (revisado 8,9,10). Equipada con una amplia gama de potentes herramientas genéticas, un ciclo de vida corto, una progenie extensa y requisitos de mantenimiento económicos, la mosca de la fruta presenta un recurso valioso para investigar mecanismos genéticos, epigenéticos y transgeneracionales. Cuando se modela el ejercicio en moscas, los métodos actuales generalmente se basan en la geotaxis negativa, la reacción conductual para ascender11,12.
Uno de los primeros protocolos de ejercicio automatizados utilizó un aparato de ejercicio especial llamado Power Tower11. La Power Tower utiliza una unidad motora que levanta repetidamente los viales con animales y luego los deja caer para inducir la respuesta negativa de la geotaxis11. El ejercicio prolongado en la Power Tower da como resultado una reducción significativa en la disminución de la movilidad y el rendimiento cardíaco relacionados con la edad13. Además, el régimen Power Tower puede ser estresante para las moscas, y se ha informado que la intensidad excesiva del entrenamiento causa lesiones o mortalidad11.
Para abordar este problema, se desarrolló otro paradigma de ejercicio llamado ruedarodante 14. La rueda de correr también aprovecha la respuesta geotaxis negativa de Drosophila, pero en lugar de levantar y dejar caer moscas como en la Power Tower, invierte los viales con animales. A diferencia de la Power Tower, este método es más suave con las moscas y previene las lesiones relacionadas con el ejercicio y la mortalidad9. Sin embargo, las moscas en la rueda rodante podrían habituarse al movimiento de rotación, lo que podría complicar la interpretación de los resultados12. Para abordar este problema, se agregó un monitor de actividad locomotora (LAM25H, Trikinetics) para medir la actividad durante el ejercicio, cuantificar la actividad de Drosophila y tener en cuenta la habituación. Posteriormente, el nombre del sistema se actualizó a Sistema de Cuantificación de Ejercicio Rotacional (REQS)12.
Curiosamente, muy pocos estudios aprovecharon las habilidades naturales de vuelo de Drosophila para modelar el ejercicio. El enfoque predominante de la investigación de vuelo ha sido en los aspectos aerodinámicos y biomecánicos de flotar y maniobrar en el aire 15,16,17,18. Varios estudios han profundizado en los mecanismos fisiológicos y celulares relacionados con el vuelo19,20. En estos estudios, la capacidad de vuelo se evaluó a través del ensayo de vuelo21,22, donde las moscas individuales se liberaron en una caja de acrílico transparente y se observó su capacidad para mantener una elevación y un vuelo constantes23.
En un estudio en particular, los investigadores examinaron los efectos del ejercicio de vuelo inducido colocando moscas en botellas conectadas a un agitador tipo vórtice. La coctelera agitó suavemente las botellas a intervalos aleatorios entre 5 min y 10 min, utilizando un temporizador programable19. Este estudio informó que el comportamiento de vuelo inducido aceleró la senescencia y la pérdida de capacidad antioxidante relacionada con la edad en los músculos de vuelo19. Sobre la base de la investigación anterior, nuestro laboratorio ha desarrollado un nuevo protocolo de ejercicio llamado FLEX (ejercicio de vuelo) mediante la integración de un sistema automatizado de geotaxis negativa con moscas de alojamiento en grandes contenedores24. Para el entrenamiento FLEX, las moscas se colocaron en peceras de tambor de plástico transparente de 1 galón atadas a una plataforma horizontal unida a un motor. El motor estaba controlado por un temporizador, que iniciaba las revoluciones del motor cada 5 minutos. Cada revolución elevaba la plataforma y luego la dejaba caer, provocando el vuelo de las moscas. El FLEX se realizó diariamente durante 7 h durante 5 días. No se observaron muertes ni lesiones asociadas al ejercicio24. Además, un régimen FLEX de 5 días en moscas con la dieta occidental (WD) anuló notablemente los efectos adversos de la WD, mejorando la supervivencia, el comportamiento de escalada y la respiración mitocondrial24. En conjunto, este artículo presenta un nuevo paradigma de ejercicio basado en la actividad de vuelo natural que no causa lesiones. Este es un procedimiento de alto rendimiento que permite entrenar simultáneamente a una gran cantidad de moscas para estudiar la interacción entre el ejercicio, la dieta, los medicamentos, el envejecimiento, el medio ambiente y / o la genética. El protocolo se puede utilizar para complementar los métodos de ejercicio existentes para estudiar los efectos de la actividad física en la fisiología y el comportamiento de las moscas.
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Protocolo
1. Configuración y funcionamiento de la máquina de ejercicios
- Construye una máquina en el taller de máquinas de la universidad. Utilice una base rectangular de aluminio de 35 mm x 35 mm x 1,4 mm con un motor de CA/CC y una plataforma horizontal de aluminio de 35 mm x 35 mm x 0,5 mm (Figura 1A).
- Para la conversión del movimiento giratorio en movimiento lineal, construya una leva redonda giratoria de 15 cm de diámetro hecha a medida montada en el motor (Figura 1B). Coloque un seguidor con un rodillo de 2 cm en la parte inferior de la plataforma horizontal para que el seguidor levante la plataforma y luego vuelva a su posición original una vez que el rodillo seguidor despeje la leva.
- Ajuste la velocidad del motor con un potenciómetro giratorio de modo que un período de rotación completo sea de aproximadamente 5,360 ms de duración.
NOTA: Las especificaciones exactas del motor, las dimensiones del seguidor y el rodillo, así como la geometría de la leva, no son críticas. Cualquier configuración motorizada que levante y deje caer de manera confiable la plataforma para desalojar las moscas y permita al usuario controlar la frecuencia de caída es aceptable. - Asegure las peceras de tambor de plástico transparente de 1 galón a la plataforma con cuerdas elásticas que se enganchan en los ojos de los tornillos (Figura 1C).
2. Protocolo FLEX
- Mantenga las moscas en una incubadora o habitación a 24 °C con un 60% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
- Recoja moscas de la misma edad dentro de los 3-4 días posteriores a la eclosión. Después de la recolección, asigne aleatoriamente las moscas a grupos de ejercicio y sedentarios. Use un número igual de moscas tanto para el grupo de ejercicio como para el sedentario.
NOTA: Las moscas pueden alojarse en densidades que oscilan entre 30 y 400 por tazón, ya que esto no interfiere con el ejercicio de vuelo. Sin embargo, los grupos experimentales y de control siempre deben emparejarse por número, sexo y edad para garantizar la comparabilidad. - Proporcione a las moscas sedentarias y controladas 7 ml de alimento de formulación. Asegure los viales de comida en los tazones con cinta adhesiva.
- Transfiera las moscas a los tazones con anestesia ligera y breve de CO2 un día antes de comenzar el régimen de ejercicios. Cubra las aberturas de los tazones con una malla asegurada con bandas elásticas.
NOTA: Las moscas deben anestesiarse brevemente bajo CO2 ligero en una almohadilla. La exposición debe ser corta para evitar efectos conductuales duraderos; Por lo tanto, la anestesia debe realizarse 1 día antes del experimento de ejercicio. - Asegure los tazones a la plataforma con cuerdas elásticas. Realice el entrenamiento físico en una habitación con una temperatura de 24 °C y una humedad del 60%. Si la humedad en la habitación no está controlada, proporcione a las moscas acceso al agua colocando viales de algodón húmedo en las peceras y asegurando los viales a la pared de la pecera con cinta adhesiva.
- Para experimentos de control (ejercicio simulado), coloque un número igual de moscas en un recipiente colocado al lado de la máquina de ejercicios pero no unido a la plataforma.
- El ejercicio vuela durante 5 días consecutivos.
- Controle el motor con dos temporizadores (Figura 1D). El primer temporizador enciende y apaga la máquina a una hora específica del día. Comience el ejercicio a las 8 am y termine a las 3 pm.
- Use el segundo temporizador para iniciar una serie de tres revoluciones del motor, y cada secuencia ocurre cada 5 minutos. Cada revolución elevará la plataforma y luego la dejará caer, haciendo que las moscas vuelen.
- Una vez que se complete el tratamiento de ejercicios para un día determinado, devuelva los tazones a sus incubadoras. Este protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a un experimento en particular.
NOTA: Una humedad inferior al 60% puede causar un aumento de la mortalidad. Es posible que un pequeño número de moscas no inicie el vuelo después de la primera caída, pero generalmente comience a volar después de la segunda o tercera caída. Si bien no es factible rastrear el vuelo en cada individuo, la mayoría de las moscas se involucran en el vuelo, y se supone que todas las moscas eventualmente participan en el ejercicio. Además, el gran contenedor proporciona espacio para el vuelo voluntario entre caídas.
- Al final del régimen FLEX, inmovilice las moscas colocando los cuencos en la cámara frigorífica durante 5 min. Luego, transfiera las moscas a nuevos viales de alimentos para análisis adicionales de características fenotípicas o a tubos de microcentrífuga para ensayos moleculares y / o bioquímicos de interés.
NOTA: Los ejemplos de análisis adicionales incluyen ensayos conductuales y bioquímicos y / o expresión génica. Los ensayos que involucren moscas vivas deberán realizarse con prontitud de acuerdo con los objetivos específicos del ensayo fenotípico. El protocolo se puede pausar aquí con muestras para bioquímica / biología molecular congeladas y almacenadas adecuadamente, dependiendo de las evaluaciones que se realicen. Se proporciona un resumen del protocolo en la Tabla 1.
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Resultados
El protocolo FLEX fue validado previamente en un trabajo publicado de nuestro laboratorio. En un estudio publicado, demostramos que el ejercicio de vuelo mitiga los efectos metabólicos negativos de una dieta occidental (WD)24. Esta dieta se elaboró sobre la base de la dieta estándar Nutri-Fly Bloomington con las siguientes adiciones de 15% de Nutiva USDA Certified Organic, no transgénico, aceite de palma rojo, 15% de sacarosa y 0.1 M de NaCl.
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Discusión
El protocolo FLEX proporciona un método novedoso y fisiológicamente relevante para inducir el ejercicio aeróbico en Drosophila melanogaster a través del vuelo. A diferencia de los paradigmas tradicionales como Power Tower y TreadWheel, que se basan en la geotaxis negativa y la agitación mecánica, FLEX aprovecha el comportamiento de vuelo innato de la mosca. Este enfoque minimiza las lesiones inducidas por el ejercicio y las respuestas al estrés, lo que lo convierte en un modelo ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por NIDDK R01DK129455 (AKM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de cultivo de polipropileno de 17 x 100 mm y 14 mL | VWR | 60818-689 | |
| Peceras de plástico transparente de 1 galón de plástico y peceras de tambor y nbsp; | Petco | N/A | Disponible en Petco |
| Protector contra sobretensiones de 8 enchufes con temporizador digital de 7 días | BN-LINK | EGPH020028 | Disponible en Amazon |
| Motor AC/DC | Dayton | Modelo 12W368 con par de 80 IN-LBS | |
| Dieta de formulación Bloomington | Nutri-Fly | 66-112 | Disponible en Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Profesional 34120 |
| Temporizador multifuncional programable de salida con cuenta atrás y ciclo corto infinito | NEARPOW | SPM10188153502 | Disponible en Amazon |
Referencias
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