Artículo de método

Un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante y aislamiento de lámina propia para el perfil de células inmunitarias

DOI:

10.3791/69233

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19 de septiembre de 2025

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante (ECN) y el posterior aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado murino neonatal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad inflamatoria grave del intestino neonatal, que afecta principalmente a los recién nacidos prematuros. La ECN se caracteriza por lesión epitelial, disbiosis microbiana y una respuesta inmune desregulada, lo que a menudo resulta en necrosis intestinal e inflamación sistémica. Los modelos murinos experimentales que recapitulan los aspectos clave de la enfermedad humana han sido esenciales para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos que impulsan la enfermedad e informan el desarrollo terapéutico. Este protocolo describe un modelo de enterocolitis necrotizante (ECN) en ratones neonatal bien establecido que utiliza alimentación con fórmula, hipoxia intermitente, administración oral de lipopolisacáridos (LPS) y bacterias entéricas cultivadas de un bebé con ECN. Esta combinación induce de manera confiable características histológicas, transcripcionales e inmunológicas consistentes con la ECN en bebés humanos y ha sido fundamental en múltiples descubrimientos clave en el campo. Además, este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado de ratones neonatales. El aislamiento celular de la lámina propia permite un perfil detallado de las células inmunitarias mediante citometría de flujo, lo que facilita el análisis de las poblaciones celulares innatas y adaptativas dentro del intestino.

Introducción

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La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad inflamatoria grave del intestino que afecta casi exclusivamente a los recién nacidos prematuros. Aproximadamente el 7%-8% de los recién nacidos de muy bajo peso al nacer (<1500 g) se verán afectados por ECN, y las tasas de mortalidad asociadas con la enfermedad pueden acercarse al 50% en los neonatos que requieren intervención quirúrgica1. La patogénesis de la ECN sigue sin comprenderse completamente; sin embargo, la evidencia actual sugiere que la ECN surge de la confluencia de múltiples factores, incluida una barrera intestinal inmadura, señalización inmune desregulada y un microbioma disbiótico 2,3,4. La convergencia de estos factores puede iniciar y exacerbar las respuestas inflamatorias en el intestino, sobre todo a través de la activación del receptor tipo Toll 4 (TLR4), lo que resulta en daño epitelial y varios tipos de muerte celular, incluyendo apoptosis y necrosis 5,6. El objetivo de este protocolo es presentar un modelo de ratón reproducible y fisiológicamente relevante de ECN que recapitula la inflamación intestinal y la neumatosis intestinal (gas dentro de la pared intestinal) observadas en neonatos humanos, lo que permite la investigación mecanicista de la patogénesis de la enfermedad. Además, este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado de ratones neonatales, lo que permite a los investigadores realizar perfiles de células inmunitarias mediante citometría de flujo.

En comparación con los modelos animales más grandes, como ratas o lechonesneonatales 7,8, los modelos de ratones neonatales ofrecen varias ventajas distintas, incluido un menor costo, un mayor acceso a animales transgénicos y la capacidad de realizar experimentos en cohortes más grandes. Los modelos de ECN murina utilizan principalmente una combinación de alimentación con fórmula, estrés por frío e hipoxia para simular la fisiopatología compleja de la ECN observada en pacientes humanos 7,8,9. Sin embargo, muchos modelos murinos de ECN están limitados por su dependencia de factores estresantes microbianos amplios o alteraciones artificiales de la microbiota, lo que puede comprometer su relevancia clínica. Por el contrario, el modelo descrito en este protocolo supera estas limitaciones al integrar varios factores clave implicados en la patogénesis de la ECN en bebés humanos10,11. Específicamente, este modelo combina el estrés hipóxico, que se ha implicado en la alteración de la integridad de la barrera intestinal 3,12, con la administración oral de fórmula infantil suplementada con lipopolisacárido (LPS), un ligando TLR4 bien caracterizado que induce inflamación intestinal, así como microbioma disbiótico clínicamente relevante con bacterias entéricas cultivadas de un paciente con NEC totalis. La forma más grave de la enfermedad, caracterizada por pannecrosis intestinal10,13. Al integrar estos factores estresantes clínicamente relevantes y específicos de la enfermedad, nuestro modelo refleja con precisión las características clínicas y moleculares de la ECN. Además, para proporcionar a los investigadores un marco para interrogar los mecanismos inmunomediados que subyacen a la patogénesis de la ECN, este protocolo describe el aislamiento de células de lámina propia del intestino delgado murino neonatal para el análisis de citometría de flujo. Como sitio principal de la actividad inmune de la mucosa intestinal, la lámina propia contiene un repertorio dinámico de células inmunes residentes e infiltrantes que juegan un papel central en la inflamación asociada a ECN14. La citometría de flujo proporciona una plataforma robusta y escalable para caracterizar estas poblaciones de células inmunitarias con alta resolución, lo que permite un análisis detallado de los fenotipos celulares, la cuantificación de las respuestas inmunitarias y la identificación de las firmas inmunológicas implicadas en la patogénesis de la ECN15.

El modelo NEC murino descrito en este protocolo complementa los modelos in vitro al permitir el estudio de las interacciones huésped-microbioma, las respuestas inmunes y la señalización inflamatoria dentro del entorno complejo del intestino neonatal. Reproduce aspectos clave de la patogénesis de la ECN que no se pueden modelar in vitro, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para dilucidar los mecanismos de la enfermedad y evaluar las estrategias terapéuticas. Aunque las diferencias específicas de las especies siguen siendo una limitación, este modelo ofrece una plataforma sólida y accesible para avanzar en nuestra comprensión de la ECN y acelerar el desarrollo de intervenciones específicas.

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Protocolo

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Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas éticas proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Los ratones fueron criados, mantenidos y alojados de acuerdo con los procedimientos descritos en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo una propuesta de estudio aprobada por el IACUC (protocolo no. 24-114) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se utilizaron ratones C57BL / 6J para todos los experimentos descritos en este estudio. Las crías se iniciaron en el modelo el día postnatal 4, con un peso de entre 1,8 y 2,3 g; se excluyeron los animales fuera de este rango de peso. Las cohortes experimentales tuvieron una distribución equilibrada por sexos, con machos y hembras que comprendían aproximadamente el 50% de los animales tratados. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Modelo NEC murino

NOTA: El stock bacteriano entérico se produce obteniendo el contenido entérico de un bebé que tenía la forma más grave de ECN, NEC totalis 13,16. El contenido entérico se cultiva durante la noche a 1 x g durante 16 h a 37 °C, se centrifuga a 3000 x g durante 10 min a 4 °C y se resuspende en glicerol al 50%. Se pipetean alícuotas de 20 μl en crioviales y se almacenan a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Los tiempos de cultivo seleccionados en este protocolo se eligieron por la eficiencia del flujo de trabajo. Estos puntos de tiempo se pueden ajustar según sea necesario para adaptarse a los horarios individuales del laboratorio sin afectar el modelo general. Además, este protocolo se optimizó para una capacidad máxima de 40 ratones, pero se puede ampliar según sea necesario.

  1. Preparación del cultivo bacteriano
    1. El día experimental 0 a las 15:00, agregue una alícuota de 20 μL de bacterias entéricas cultivadas de un bebé con NEC totalis a un tubo de cultivo de 15 mL que contiene 2 mL de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar el cultivo bacteriano con la tapa del tubo en posición ventilada en un agitador orbitario a 37 ° C, 1 x g, durante la noche durante 16 h, e incubar un tubo de cultivo que contenga solo 2 ml de caldo LB simultáneamente como control para evaluar cualquier contaminación por LB.
      1. Confirme visualmente el cultivo durante la noche comparando la turbidez entre el cultivo bacteriano y el control transparente solo de LB; Proceda solo si el cultivo bacteriano parece turbio y el control permanece limpio.
    2. El día experimental 1, a las 07:00, alícuota 125 μL del cultivo nocturno inoculado en un matraz de cultivo celular T75 con tapa ventilada que contiene 25 mL de caldo LB. Preparar cuatro matraces T75 en total e incubarlos en posición vertical en un agitador orbital a 37 °C, 1 x g, durante 2 h para expandir el cultivo bacteriano.
      NOTA: Los cultivos nocturnos se preparan en los días experimentales 0, 1 y 2 del modelo NEC.
  2. Asignación de crías en grupos experimentales
    1. El día experimental 1 a las 07:00, pesar las crías del día 4 posnatal.
      NOTA: El rango de peso óptimo está entre 1,8 y 2,3 g, y los valores atípicos deben eliminarse del experimento.
    2. Agrupe los ratones experimentales en cohortes alimentadas con fórmula y alimentadas con madre y calcule el peso promedio de los ratones alimentados con fórmula. Separe los ratones alimentados con fórmula designados de la madre y colóquelos en una nueva jaula alojada en una incubadora infantil precalentada a 37 ° C. Mantenga a los cachorros alimentados con la madre en la jaula original con la madre.
      NOTA: Los ratones neonatales son particularmente sensibles a los cambios en la temperatura ambiente. Para mantener una regulación constante de la temperatura después de la separación de la madre, los cachorros alimentados con fórmula se mantienen en una incubadora infantil con temperatura controlada a 37 ° C. Este enfoque es consistente con los protocolos establecidos de NEC que preservan la temperatura fisiológica sin el uso de intervenciones térmicas adicionales 11,17,18,19.
    3. Repita en los días experimentales 2 y 3, pesando los ratones alimentados con fórmula y calculando el peso promedio antes del punto de alimentación de las 07:00 diariamente.
  3. Medición de la densidad óptica (OD) del cultivo bacteriano
    1. Después de 2 h de incubación a 37 °C y 1 x g, retire los cuatro matraces T75 con cultivo expandido del agitador orbital en los días experimentales 1, 2 y 3. Combine el contenido de los cuatro matraces T75, mezcle bien y pipetee 1 ml del cultivo bacteriano en una cubeta.
      1. Prepare una solución en blanco agregando 1 ml de caldo LB estéril a una cubeta. Mida la densidad óptica del cultivo bacteriano a 600 nm (OD600nm) con un espectrofotómetro.
        NOTA: El OD objetivode 600 nm es 0,6 ± 0,02. Si el DE600 nm del cultivo bacteriano está por debajo del valor objetivo, continúe la incubación como se describe en el paso 1.3.1. hasta que se alcance el ODobjetivo de 600 nm de 0,6 ± 0,02. Si el OD600nm es superior a 0,6, diluir el cultivo bacteriano con caldo LB estéril.
    2. Transfiera 80 ml del cultivo bacteriano a dos tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugue a 3000 x g durante 10 min a 4 °C. Confirme el cultivo exitoso verificando si hay un gránulo visible en el fondo de cada tubo.
  4. Preparación de fórmulas
    1. Comience la preparación de la fórmula a las 09:00 en los días experimentales 1, 2 y 3. Combine 16 ml de fórmula infantil y 8 ml de leche para cachorros en una proporción de 2:1 en un tubo centrífugo estéril de 50 ml.
    2. Retire el sobrenadante de los dos tubos de centrífuga de 50 ml que contienen cultivo bacteriano granulado (paso 1.3.2).
    3. Vuelva a suspender completamente cada uno de los dos gránulos en 2 ml de la mezcla de fórmula y transfiera la resuspensión a la mezcla de fórmula para hacer 24 ml de la fórmula NEC.
      NOTA: La concentración bacteriana final en la fórmula de NEC debe estar entre 4 y 5 x 109 UFC/ml.
    4. Etiquete seis tubos de centrífuga de 50 ml para cada uno de los seis puntos de tiempo de alimentación (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Pipetee 4 ml de la fórmula de NEC en cada tubo etiquetado.
    6. Preparar seis alícuotas de un solo uso de caldo de LPS (5 mg/ml) y almacenar en microtubos de baja unión a -20 °C. Agregue LPS (consulte la NOTA para la concentración) a la fórmula NEC inmediatamente antes de alimentar en cada punto de tiempo.
      NOTA: La cantidad de LPS agregada a la fórmula de NEC se basa en el peso corporal promedio de los cachorros alimentados con fórmula calculado a las 07:00 cada día, utilizando una dosis de 5 μg de LPS por gramo del peso corporal de los cachorros. La concentración final de LPS varía con el peso corporal. Por ejemplo, con un volumen de alimentación de 80 μL y un peso promedio de cohorte de cachorros de 2 gramos, la concentración de LPS en la fórmula sería de 0,125 mg / mL.
  5. Alimentación
    NOTA: En el día experimental 1, los ratones que se colocarán en el modelo NEC están en ayunas durante 3 h después de la separación de su madre. La primera alimentación de fórmula de NEC es a las 10:00 y continúa cada 3 h hasta las 22:00. En los días experimentales 2 y 3, los ratones se alimentan a las 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 y 22:00. Los ratones no se alimentan en el día experimental 4.
    1. Inmediatamente antes de alimentar a los ratones, descongele y agite una alícuota de LPS durante 15 s. Agregue la cantidad adecuada de LPS basada en el peso promedio de los ratones al tubo preparado de 4 ml de la fórmula NEC (consulte el paso 1.4.6 para el cálculo) y mezcle bien mediante pipeteo.
    2. Llene una jeringa de 1 ml con fórmula NEC y conecte una línea de catéter central de inserción periférica neonatal (PICC). Asegúrese de que no haya burbujas ni aire en la jeringa o en la línea PICC.
    3. Administre la fórmula NEC a los cachorros por sonda oral con la línea PICC.
      1. Sujete suavemente a cada cachorro por la piel suelta en la base de su cuello y sostenga al ratón en posición vertical. Con fórceps, guíe el extremo distal de la línea PICC hacia la orofaringe y el esófago, colocando la punta de la línea PICC dentro del estómago.
        NOTA: La distancia de inserción de la línea PICC es igual a la distancia desde la comisura de la boca hasta la parte superior de la mancha de leche en el estómago. El punto de inserción óptimo debe marcarse claramente en la línea PICC con un marcador permanente.
      2. Si se siente una resistencia significativa durante la inserción de la línea PICC, retire la línea PICC, vuelva a colocar y vuelva a intentar la inserción con cuidado.
      3. Dispense 8 μL de fórmula NEC lentamente en el estómago, monitoreando de cerca al cachorro durante la alimentación para detectar signos de aspiración. Observe la aparición de una mancha de leche blanca para confirmar un parto gástrico exitoso.
      4. Retire la línea PICC. Observe al cachorro para detectar cualquier dificultad para respirar o emesis. Si el cachorro regurgita fórmula, seque la boca y la nariz con una toallita de laboratorio con poca pelusa.
    4. Repita este proceso en cada momento de alimentación.
    5. Dos veces al día, someta a los cachorros a hipoxia durante 10 minutos inmediatamente después de las horas de alimentación de las 13:00 y 19:00.
      1. Después de dos comidas por día, coloque a los cachorros en una cámara de hipoxia conectada a un tanque de gas que contenga 95% de nitrógeno y 5% de oxígeno. Abra la válvula del tanque y controle los niveles de oxígeno dentro de la cámara de hipoxia sellada con un monitor de mano. Una vez que la cámara de hipoxia alcance el 5% ± 0,5% de oxígeno, mantenga a las crías en este nivel de oxígeno durante 10 min.
        NOTA: El caudal debe optimizarse para disminuir del 20% al 5% de oxígeno a una velocidad constante y controlada durante un período de 2 minutos.
    6. Observe a los cachorros de ratón entre comidas para detectar signos de dificultad respiratoria, decoloración pálida o apnea. Si estos signos están presentes, retire al cachorro afectado de la cámara de hipoxia, observe cuidadosamente la recuperación y, si es necesario, eutanasia a los cachorros de acuerdo con la política de IACUC.
    7. Continúe la alimentación por sonda oral y la exposición a la hipoxia en puntos de tiempo programados durante las 72 h completas de duración del modelo NEC.
      NOTA: Si el día experimental 1 comienza el lunes a las 10:00, el punto final de 72 h ocurrirá a las 10:00 del jueves. Esto se designa como el día 4 del modelo. Los ratones no se alimentan a las 07:00 del día 4 del modelo y se les sacrifica en este punto de tiempo final de las 10:00 para la recolección de tejidos.
  6. Eutanasia de animales y recolección de tejido
    1. En la mañana del día 4 del modelo, pese y registre el sexo de cada cachorro, luego eutanasia de acuerdo con las pautas de IACUC.
    2. Después de la eutanasia, recolecte sangre de cada cachorro en un tubo separador de suero que contiene un activador de coágulos y un gel.
    3. Centrifugar a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C para separar el suero. Pipetee el suero en tubos marcados de 1,7 ml y guárdelo a -80 °C.
    4. Hacer una incisión de 1-2 cm en la línea media a través de la pared abdominal y el peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal. Inspeccione el intestino expuesto en busca de características distintivas de la ECN, incluida la distensión, el eritema, la acumulación de gases dentro de la pared intestinal (neumatosis intestinal) y las burbujas de aire visibles.
    5. Identificar y resecar el duodeno a través del recto distal. Coloque el pañuelo en una placa de Petri sobre hielo. Use solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para enjuagar el intestino.
    6. Identifique el ciego y córtelo proximalmente para separar el ciego y el colon del intestino delgado. Separe las piezas comenzando en el íleon distal y trabajando hacia el yeyuno. Coloque una pieza de 1 cm en un tubo que contenga tampón de lisis de ARN y perlas de óxido de circonio de 1,5 mm en hielo para su análisis transcripcional.
      1. Enjuague una pieza de 1,5 cm con una jeringa que contenga PBS unida a una aguja roma de 24 G y luego colóquela en un tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%. Congele rápidamente un trozo de intestino de 1 cm y guárdelo a -80 °C para el análisis de proteínas. Congele rápidamente un trozo de intestino de 1 cm y guárdelo a -80 °C para cualquier ensayo adicional.
    7. Procese el tejido recogido en tampón de lisis de ARN en un batidor de perlas (5,50 m/s, 1,0 min., ciclo = 1,0, pausa de permanencia: 10 s, 4 °C) para homogeneizar el tejido, luego guárdelo a -80 °C.
  7. Fijación de tejidos
    1. Coloque los trozos de tejido recogidos en PFA al 4% en un balancín a 4 °C para que se fijen durante 24 h. Después de 24 h, retire el PFA al 4% de cada tubo y reemplácelo con 1 ml de PBS para lavar el tejido. Vuelva a colocar los tubos en el balancín a 4 °C durante 15 min. Repita el lavado PBS una vez.
      1. Retire el PBS y agregue 1 ml de etanol al 50% a cada tubo y regrese los tubos al balancín a 4 ° C durante 15 min. Retire el etanol al 50% y agregue 1 ml de etanol al 70%, y guárdelo a 4 ° C hasta que el tejido pueda procesarse en bloques de histología de parafina.
        NOTA: Se pueden recolectar segmentos intestinales adicionales o muestras de heces según sea necesario para un análisis adicional.

2. Aislamiento de células inmunitarias de lámina propia

NOTA: Este protocolo está optimizado para el aislamiento de células de lámina propia de ratones neonatales aproximadamente a la semana de edad. Si se necesitan muestras de referencia para la citometría de flujo espectral, se pueden usar destetes (semanas postnatales 3-4). Para muestras de destete, duplique todos los volúmenes de reactivos especificados en el protocolo.

  1. Preparación de reactivos
    1. Prepare 1x la solución salina equilibrada de Hank sin Ca2+ y Mg2+ (HBSS W/O) que contenga 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) y guárdelo a temperatura ambiente.
    2. Preparar tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) disolviendo albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en PBS + 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y almacenar a 4 °C.
    3. El día antes de realizar el aislamiento celular de la lámina propia, prepare la solución de predigestión agregando 5 mM de EDTA, 5% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mM de ditiotreitol (DTT) a HBSS W/O.
    4. Prepare la solución de digestión inmediatamente antes de realizar el aislamiento celular de la lámina propia complementando el medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) con 10% de FBS y mg/ml de colagenasa IV.
      NOTA: HBSS W/O se puede preparar con anticipación y almacenar a temperatura ambiente. La zona de amortiguación FACS debe prepararse con antelación y almacenarse a 4 °C. Las soluciones de predigestión y digestión deben prepararse frescas inmediatamente antes de realizar el aislamiento de la lámina propia y mantenerse en hielo.
  2. Recolección y preparación del tejido intestinal para la digestión
    1. Localice el ciego y transecte proximalmente para extirpar el ciego y el colon. Extirpe 2-3 cm del intestino delgado distal (íleon) y colóquelo sobre HBSS frío W/O en una placa de Petri (reanudando desde el paso 1.6.5).
    2. Con una aguja roma de 24 G unida a una jeringa, enjuague completamente la luz intestinal con HBSS frío W/O mientras estabiliza el tejido con fórceps. Confirme visualmente que la luz intestinal está libre de heces después del lavado.
    3. Retire con cuidado cualquier resto de tejido conectivo del segmento intestinal con pinzas finas o tijeras.
    4. Cortar el intestino longitudinalmente para abrirlo, luego seccionarlo transversalmente en segmentos de 1-1 cm.
  3. Disociación de la lámina propia
    1. Transfiera los segmentos intestinales a un tubo de centrífuga de 1 ml que contenga 1 ml de solución de predigestión que se haya enfriado en hielo.
    2. Incubar la muestra a 37 °C durante 20 min con rotación continua para facilitar la disociación del tejido.
    3. Agite suavemente el tubo, luego vierta el contenido a través de un filtro celular de 10 μm colocado sobre un tubo de centrífuga de 5 ml.
      NOTA: El filtrado recogido a través del filtro de 10 μm contiene linfocitos intraepiteliales (IEL) y puede utilizarse para el análisis posterior si se desea.
    4. Transfiera los fragmentos de tejido a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de solución de digestión precalentada a 37 °C. Posteriormente, incubar la muestra durante 40 min a 37 °C con rotación continua.
    5. Transfiera toda la muestra a un tubo de disociación tisular automatizado y ejecute el programa de disociación que consta de cuatro ciclos de rotación de 15 s cada uno, alternando entre direcciones en sentido horario y antihorario.
      NOTA: Una alternativa a un disociador de tejidos automatizado es moler manualmente el tejido intestinal utilizando las puntas esmeriladas de dos portaobjetos de microscopio. Si usa este método, aplique una presión suave y uniforme para evitar un estrés mecánico excesivo, ya que esto puede reducir significativamente la viabilidad celular.
    6. Agite suavemente la suspensión celular y, a continuación, centrifugue las muestras en el tubo de disociación tisular a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el sedimento, luego vuelva a suspender las células en ml de tampón FACS helado.
    8. Coloque un colador celular de 10 μm en un tubo de centrífuga de 5 ml. Transfiera la suspensión de celda resuspendida a través del filtro, luego lave el filtro con un ml adicional de tampón FACS helado.
    9. Cuente las células y evalúe la viabilidad utilizando azul de tripano o un colorante de viabilidad. Centrifugar el volumen requerido para la citometría de flujo a 30 × g durante 5 min a 4 °C. Utilice las celdas inmediatamente para aplicaciones posteriores para preservar la viabilidad y la expresión del marcador.

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Resultados

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El modelo murino neonatal de ECN descrito en este protocolo replica las características clave de la enfermedad. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 1A) reveló una reducción significativa en la supervivencia en el grupo de tratamiento con ECN en comparación con los controles alimentados por madre (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). La inspección macroscópica de los intestinos de los ratones sometidos al modelo (Figura 1B...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo integra un modelo murino neonatal fisiológicamente relevante de ECN con aislamiento de células inmunitarias de lámina propia, proporcionando una plataforma integral para investigar las respuestas inmunitarias de las mucosas durante la inflamación intestinal. Al combinar exposiciones clínicamente relevantes, como el microbioma entérico de casos humanos de ECN, estrés hipóxico y alimentación con fórmula, este modelo recapitula la patogénesis compleja y multifactorial observa...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relacionado con este manuscrito.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito fue apoyado por R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, la subvención de la Iniciativa Chan Zuckerberg número 2022-316749, el Premio Yang Biomedical Scholar y el Departamento de Pediatría de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Syringe for formula feeding
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator for mice
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
ParaformaldehydeThermo ScientificJ

Referencias

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