Este protocolo describe un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante (ECN) y el posterior aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado murino neonatal.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante y aislamiento de lámina propia para el perfil de células inmunitarias
En este artículo
Resumen
Resumen
La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad inflamatoria grave del intestino neonatal, que afecta principalmente a los recién nacidos prematuros. La ECN se caracteriza por lesión epitelial, disbiosis microbiana y una respuesta inmune desregulada, lo que a menudo resulta en necrosis intestinal e inflamación sistémica. Los modelos murinos experimentales que recapitulan los aspectos clave de la enfermedad humana han sido esenciales para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos que impulsan la enfermedad e informan el desarrollo terapéutico. Este protocolo describe un modelo de enterocolitis necrotizante (ECN) en ratones neonatal bien establecido que utiliza alimentación con fórmula, hipoxia intermitente, administración oral de lipopolisacáridos (LPS) y bacterias entéricas cultivadas de un bebé con ECN. Esta combinación induce de manera confiable características histológicas, transcripcionales e inmunológicas consistentes con la ECN en bebés humanos y ha sido fundamental en múltiples descubrimientos clave en el campo. Además, este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado de ratones neonatales. El aislamiento celular de la lámina propia permite un perfil detallado de las células inmunitarias mediante citometría de flujo, lo que facilita el análisis de las poblaciones celulares innatas y adaptativas dentro del intestino.
Introducción
La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad inflamatoria grave del intestino que afecta casi exclusivamente a los recién nacidos prematuros. Aproximadamente el 7%-8% de los recién nacidos de muy bajo peso al nacer (<1500 g) se verán afectados por ECN, y las tasas de mortalidad asociadas con la enfermedad pueden acercarse al 50% en los neonatos que requieren intervención quirúrgica1. La patogénesis de la ECN sigue sin comprenderse completamente; sin embargo, la evidencia actual sugiere que la ECN surge de la confluencia de múltiples factores, incluida una barrera intestinal inmadura, señalización inmun....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas éticas proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Los ratones fueron criados, mantenidos y alojados de acuerdo con los procedimientos descritos en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo una propuesta de estudio aprobada por el IACUC (protocolo no. 24-114) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se utilizaron ratones C57BL / 6J para todos los experimentos descritos en este estudio. Las crías se i....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El modelo murino neonatal de ECN descrito en este protocolo replica las características clave de la enfermedad. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 1A) reveló una reducción significativa en la supervivencia en el grupo de tratamiento con ECN en comparación con los controles alimentados por madre (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). La inspección macroscópica de los intestinos de los ratones sometidos al modelo (Figura 1B.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo integra un modelo murino neonatal fisiológicamente relevante de ECN con aislamiento de células inmunitarias de lámina propia, proporcionando una plataforma integral para investigar las respuestas inmunitarias de las mucosas durante la inflamación intestinal. Al combinar exposiciones clínicamente relevantes, como el microbioma entérico de casos humanos de ECN, estrés hipóxico y alimentación con fórmula, este modelo recapitula la patogénesis compleja y multifactorial observa.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relacionado con este manuscrito.
Agradecimientos
Este manuscrito fue apoyado por R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, la subvención de la Iniciativa Chan Zuckerberg número 2022-316749, el Premio Yang Biomedical Scholar y el Departamento de Pediatría de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 mL Syringe-Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309659 | Syringe for formula feeding |
| 1.5 mL semi-micro Disposable Cuvettes | BRAND GMBH + CO KG | 759085D | |
| 1.7 ml Microtubes Clear | Axygen - Corning Inc. | MCT-175-C | Nonpryogenic & Rnase-/Dnase-free |
| 5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580 | Airgas | X02NI95C2003186 | |
| Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93 | eBioscience Inc. | 14-0161-85 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93 | eBioscience Inc. | 14-0161-86 | |
| APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGc | BioLegend | 128015 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70 | BD Biosciences | 564455 | |
| BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5 | BD Biosciences | 566408 | |
| BD Microtainer SST | Becton Dickinson | 365867 | Serum Tube |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200 | Fisher Scientific | 12-111-365 | |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20 | Fisher Scientific | 12-111-366 | |
| BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200 | Fisher Scientific | 12-111-362 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563795 | |
| BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8 | BD Biosciences | 751263 | |
| BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2 | BD Biosciences | 563415 | |
| C57BL/6J Neonatal Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD45-VioGreen mouse | Miltenyi Biotec | 130-102-412 | |
| CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286 | Miltenyi Biotec | 130-119-659 | |
| CFX Opus Real-Time PC Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma | D9779-5g | |
| eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Life Technologies Corp. | 00-5523-00 | |
| EDTA (0.5M), pH 8.0 | Quality Biological Inc | 351-027-721 | |
| Esbilac Puppy Milk Replacer | Pet-Ag, Inc. | 99502-1 | Puppy Milk |
| Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mL | Fisher Scientific | 13-678-11F | |
| Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Genie Temp-Shaker 300 | USA Scientific, Inc. | SI-G1600 | |
| gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130096334 | |
| Ghost Dye Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| Glycerol ReagentPlus | Sigma-Aldrich | G7757-500ML | |
| GraphPad Prims Software, Version 10.0 | GraphPad | N/A | |
| Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent Stopper | Fisher Scientific | 07-000-212 | |
| Handi+ Oxygen analyzer | Maxtec | N/A | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Gibco | 141650-095 | |
| HEPES Buffer | Mediatech, Inc. | 25-060-CI | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenburg, Inc. | N/A | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | N/A | |
| Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cm | Fisher Scientific | 12-460-655 | |
| Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cm | Fisher Scientific | 12-460-598 | |
| Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style Forceps | Fisher Scientific | 12-460-110 | |
| Isolette Infant Incubator | Air-Shields Vickers | C100-200-2 Series 02 | Incubator for mice |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberly-Clark | 34120 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L3129-10mg | |
| Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics Powder | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3451 | 1.5 ml, clear, graduated, sterile |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | |
| Ohaus scout portable balance | Fisher Scientific | 30253024 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | J |
Referencias
- Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
- Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neon....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
