Artículo de método

Formulación de dosis trazadoras de vitamina A para administración a sujetos humanos mediante la técnica de dilución de isótopos de retinol

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DOI:

10.3791/69240

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31 de marzo de 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

En este artículo

Resumen

La preparación de vitamina A estable marcada con isótopos, necesaria para la técnica de dilución de isótopos de retinol, debe cumplir con las normas de seguridad alimentaria. El protocolo muestra la preparación de la dosificación en aceite vegetal en concentraciones que serán adecuadas para el sistema de administración elegido y la plataforma analítica aplicada.

Resumen

La técnica de dilución de isótopos de retinol (RID) se basa en la administración de trazadores de vitamina A marcados isotópicamente a sujetos humanos. Aquí presentamos un método para guiar a los equipos de investigación sobre cómo preparar trazadores de isótopos estables de vitamina A tanto para estudios de investigación como para encuestas poblacionales. El artículo ofrece una visión general de la preparación, el abastecimiento de materiales, equipos y procedimientos necesarios para garantizar que los trazadores sean seguros para el consumo humano. Los trazadores isótópicos estables de vitamina A pueden obtenerse comercialmente y suelen estar marcados con deuterio [2H] o carbono-13 [13C], con pureza isomérica > 95% y enriquecimiento isotópico >99%. La preparación de los trazadores isótopos estables de vitamina A consiste en disolver el trazador en aceite vegetal comestible mediante sonicación y calor. Los trazadores deben prepararse a una concentración que esté bien dentro de los límites volumétricos del sistema de liberación. Finalmente, el trazador se aliquota en viales de vidrio ámbar estéril, y las concentraciones del trazador se confirman espectrofotométricamente.

Introducción

Para permitir un seguimiento eficaz de los programas de intervención que buscan reducir la deficiencia de vitamina A, se ha aplicado con éxito el método de dilución de isótopos de retinol (RID) para proporcionar información sobre las reservas corporales totales de vitamina A (TBS) en varios grupospoblacionales 1,2,3,4. Aunque el retinolsérico 5, la proteína de unión al retinol sérico (RBP) 6,7,8 y la respuesta a dosis relativamodificada (MRDR) 9 suelen emplearse para confirmar la deficiencia de vitamina A, el DI es el único método que cuantifica con precisión las reservas corporales totales de vitamina A en todo el espectro — desde la deficiencia subclínica hasta latoxicidad 3,10. Al administrar una dosis conocida de vitamina A marcada y medir su dilución en plasma tras el equilibrio, el método RID proporciona estimaciones precisas de TBS y reservas hepáticasde vitamina A 11,12. Es importante destacar que el método RID sigue siendo fiable incluso en poblaciones con inflamación, lo que lo hace indispensable para evaluar la eficacia de la intervención y evaluar los riesgos de toxicidad en programas de suplementación y fortificación que sesolapan 13,14.

Para realizar el método de RIM, es necesario administrar vitamina A marcada isotópicamente como una dosis oral de éster retinilo, que en la mayoría de los casos es acetato de retinilo disuelto en aceite vegetal comestible. La mayoría de los laboratorios obtendrán vitamina A marcada con isótopos de proveedorescomerciales 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Casi todos los trazadores de isótopos de vitamina A disponibles comercialmente están marcados usando isótopos estables de carbono-13 [13C] o deuterio [2H] (Tabla 1). La elección de la dosis isótopica aplicada depende del instrumento analítico utilizado para determinar la concentración sérica o plasmática de retinol marcado en masa. Mientras que la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) pueden analizar tanto [13C] como [2H]22,23,24,25,26,27, la espectrometría de masas de cromatografía-combustión-isótopo (GC-C-IRMS) solo puede analizar trazadores de retinol marcados con [13C] 4,25,28. Los límites de detección del instrumento analítico elegido, el grupo objetivo (niños o adultos) y la duración de la investigación determinarán el tamaño de la dosis que debeaplicarse 3,25,29. Hasta la fecha, las dosis de isótopos aplicadas han oscilado entre 0,3 y 4,3 mg de retinol equivalente (ER; equivalente a 1 - 15 μmol RE) enniños de 3, 4, 30 años y de 0,6 a 10,0 mg de RE (equivalente a 2 - 35 μmol RE) en adultos2, 3,31, con estudios más recientes aplicando dosis más bajas entre 0,3 y 0,6 mg de RE (1 - 3 μmol RE) en niños y 0,6 - 2,0 mg de RE (2 - 7 μmol RE) en adultos. Aunque se generó temor de que una masa alta de vitamina A en la dosis pudiera alterar la cinética subyacente de la vitamina A, un análisis reciente mediante modelado compartimental confirmó que dosis isótópicas de hasta 7 μmol RE en niños o 14 μmol RE en adultos no deberían afectar la precisión de las prediccionesTBS 29. Aquí demostraremos cómo preparar un trazador marcado con isótopos para su aplicación oral en el método de DRI, teniendo en cuenta las preocupaciones de seguridad alimentaria y la obtención de concentraciones de dosis precisas. La preparación de la dosis isótopica es vital para el método de RIM.

Protocolo

El Estudio 1 fue aprobado por el Servicio Nacional de Ética en la Investigación, Comité del Noreste de Sunderland (REC 09/H0904/20) antes de su registro en la Red de Investigación Clínica del Reino Unido (UKCRN: 7413). El Estudio 2 fue aprobado por la Junta de Ética en la Investigación de la Universidad de Filipinas, Manila (ID IRB: UPMREB 2016-282-01), la Junta de Revisión Institucional de UC, Davis (ID IRB: 903681-2) y registrado en ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). El Estudio 2 formó parte del proyecto GloVitAS financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1115464: Evaluación del riesgo de toxicidad por vitamina A debido a la fortificación alimentaria a gran escala y otras intervenciones). Georg Lietz fue el investigador principal del proyecto GloVitAS y supervisó la implementación del estudio de campo. Una visión general del protocolo de estudio se ofrece en la Figura 1.

1. Criterios de inclusión y exclusión

  1. Para el estudio 1, los criterios dados fueron: Criterios de inclusión: Incluir voluntarios sanos, hombres y mujeres, con un rango de edad de 18 a 45 años. Criterios de exclusión: Excluir voluntarios con embarazo, tabaquismo, hipertensión, diabetes, IMC >30, enfermedades hepáticas/renales/gastrointestinales, trastornos metabólicos lipídicos y consumo de multivitamínicos (que contienen vitaminas A, C, E) o suplementos de β-caroteno 3 meses antes del inicio del estudio.
  2. Para el estudio 2, los criterios dados fueron: Criterios de inclusión: Incluir a niños de 12 a 18 meses que permanecieron en el área de estudio durante toda la duración del estudio. Criterios de exclusión: Excluir si los niños no recibieron suplementación con vitamina A en dosis altas y vivieron en zonas que no estuvieron expuestas a alimentos enriquecidos con vitamina A en los mercados locales.

2. Determinar la cantidad total de trazador isótopico estable para RID

  1. Decide la cantidad de trazador isótopico estable que debe recibir cada sujeto teniendo en cuenta la pureza isomérica. Se recomienda utilizar isótopos estables de vitamina A con pureza totalmente trans del >95%, ya que la actividad biológica y las vías metabólicas difieren significativamente entre isómeros geométricos. Calcula el nivel de dosis en función de los equivalentes de retinol (RE). Un ejemplo de cómo se calcula esto se da en la Tabla 2.
  2. Multiplica el nivel de dosis por el número total de sujetos. Número total base de sujetos en cálculos de potencia para el tamaño de muestra requerido, pero aumenta en función de la rotación esperada (véase la Tabla 2 por ejemplo). Aumenta la cantidad total de trazador necesario teniendo en cuenta pérdidas de pipeteo de hasta un 20%.
    NOTA: Por regla general, la preparación del isótopo debe incluir un exceso, ya que no es posible recuperar todo el material del vial. Las pérdidas se producirán además debido a la viscosidad del aceite que permanece en el exterior de la punta de la pipeta. Para obtener volúmenes precisos de la dosis durante el administración, hay que limpiar el exceso de aceite en el exterior de la punta de la pipeta. Los operadores pueden minimizar las pérdidas por pipeteo si la punta de la pipeta no se sumerge demasiado profundamente en el aceite.

3. Determinar la cantidad de aceite vegetal necesaria para disolver el trazador de isótopos estable

  1. Decide qué aceite vegetal usar y el volumen de la dosis por sujeto (Tabla 2). Determina la cantidad de aceite añadido por el sistema de administración utilizado durante la dosificación de los sujetos.
    NOTA: Utilizamos aceite de girasol debido al alto contenido de vitamina E, que ayuda a la estabilidad de la preparación de vitaminaA 32,33. Sin embargo, otros grupos han empleado otros aceites vegetales para cumplir con las normas dietéticas locales. Dado que el DI depende de la entrega precisa de trazadores estables marcados con isótopos, se recomienda usar una pipeta de desplazamiento positivo para la aplicación de dosis preparada en aceite comestible. La mayoría de los estudios recientes han utilizado volúmenes de hasta 250 μL, especialmente si la dosis se administra a niños 1,7,23.
  2. Calcular la concentración de dosis del trazador isótopico estable en el aceite vegetal [mg/mL]. Determina el volumen total de aceite vegetal necesario. Calcular el peso del aceite requerido, basándose en el volumen calculado y la densidad relativa del aceite vegetal (véase la Tabla 2 para un ejemplo).
    NOTA: Para mayor precisión, se recomienda pesar el aceite para la preparación estable del trazador isotópico. Una vez calculado el volumen total de aceite necesario, se puede ordenar el trazador estable marcado con isótopos. Es importante solicitar que el trazador isótopico se envíe en una botella de volumen suficiente para permitir al equipo de investigación pesar el aceite vegetal directamente en la botella que contiene el trazador marcado con isótopos.

4. Preparación de trazadores estables marcados con isótopos en áreas dedicadas a la preparación de alimentos

  1. Abre cuidadosamente la tapa de la botella ámbar que contiene la cantidad total predeterminada del trazador isótopo estable y colócala sobre una balanza analítica, que luego se ajusta a cero.
  2. Añade el aceite gota a gota hasta alcanzar el peso deseado (con una precisión de ± 0,1 g) usando una jeringuilla estéril de 10 mL.
    NOTA: Como algunos cristales de acetato de retinilo pueden quedar atrapados dentro del tapón de la botella ámbar, la botella debe abrirse con mucho cuidado. Tras añadir el aceite vegetal a la botella ámbar, el tapón se coloca cuidadosamente de nuevo en la botella, que luego se agita cuidadosamente a mano para volver a suspender los cristales de acetato de retinilo que queden dentro de la tapa.
  3. Coloque la botella en un baño maria sónico con potencia ultrasónica: 14 W/L y frecuencia de funcionamiento: 44 kHz. Llena con agua por encima del nivel de aceite de la botella, pero por debajo del nivel de la tapa, para evitar que el agua entre accidentalmente en la preparación.
  4. Sonica la botella durante 15 minutos antes de mezclar cuidadosamente a mano, seguida de una sonicación durante otros 15 minutos. Debe asegurarse que la temperatura del baño maria sonicante no supere los 50 °C.
    NOTA: Al usar aceite de girasol para la preparación, hemos comprobado que la isomerización a retinoides cis no ocurre cuando la dosis se expone a 50 °C durante 30 minutos (véase la Figura 2). Sin embargo, las preparaciones deben ser analizadas por HPLC para evaluar el grado de isomerización térmica.
  5. Coloca la botella en un baño maria caliente a 50 °C durante 30 minutos para disolver completamente los microcristales.
  6. Toma una muestra de 20 μL de aceite para comprobar la presencia de microcristales bajo un microscopio óptico a 200x de aumento en un laboratorio. Si hay microcristales presentes, repite el procedimiento de sonicación y calentamiento.
  7. Una vez lograda la disolución completa, se alicuota la preparación total del aceite en viales ámbar de vidrio estériles de 2 a 4 mL. Utilice pipetas de desplazamiento positivo para este procedimiento y así evitar la contaminación cruzada.
    NOTA: El volumen de trazador isótopico estable añadido a los viales de ámbar de vidrio puede guiarse por la tasa diaria de reclutamiento; por ejemplo, si se reclutan 5 sujetos al día y el volumen de dosis es de 150 μL, el vial debe contener suficiente volumen para cubrir 5 dosis más las pérdidas por pipeteo: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Determinar la concentración de isótopos estables en triplicado. Reserva 200 μL de aceite vegetal puro (utilizado para la preparación de un blank espectrofotométrico) y 200 - 350 μL de la dosis isótopica estable en viales ámbar separados de 2 mL durante la preparación del trazador marcado con isótopos estables.
    1. Si la concentración de dosis es ≤ 0,5 mg de EM, reserva 350 μL del isótopo estable en un vial ámbar separado de 2 mL. Para concentraciones de dosis > 0,5 mg de EM, reservar 200 μL de la dosis isótopica estable en un vial ámbar separado de 2 mL.
  9. Cubre los viales con un gas inerte (Ar) para retrasar la oxidación potencial del trazador marcado con isótopos, cierra herméticamente y guarda en una criocaja etiquetada con concentración isótopica, volumen de dosis (determinada después), fecha de preparación y nombre del proyecto. Guarda la criocaja en un congelador de alimentos a -20 °C hasta el envío. En estas condiciones, la dosis de trazador es estable durante al menos 2 años.

5. Determinación de la concentración estable de trazadores de isótopos en laboratorio

  1. Diluir el trazador de isótopos estable en 3 frascos volumétricos con n-hexano. Llena los frascos volumétricos con n-hexano hasta 1 cm por debajo de la línea de calibración antes de añadir la dosis trazadora.
    1. Determinar la dilución del trazador isótopico estable por la dosis trazadora. Si la concentración de dosis del trazador de isótopos estables es ≤ 0,5 mg de EE, se diluyen 100 μL de la dosis de isótopo estable en un matraz volumétrico de 50 mL con n-hexano. Si la concentración de dosis está entre 0,5 y 2 mg de ER, entonces 50 μL de la dosis isótopica estable en un matraz volumétrico de 50 mL con n-hexano. Si la concentración de dosis es >2 mg de EE, entonces 50 μL de la dosis estable del isótopo en un matraz volumétrico de 100 mL con n-hexano.
    2. Dispensar directamente 50 o 100 μL de aceite en el hexano y el matraz se produce con un volumen de 50 o 100 mL con hexano adicional usando una pipeta Pasteur de vidrio. Invierte el matraz 10 veces para mezclar el aceite con el hexano.
      PRECAUCIÓN: El hexano debe manipularse en un armario de humeros, usando el EPI adecuado. El hexano de residuos se recoge en un contenedor dedicado para su disposición especializada por un contratista autorizado.
  2. Prepara el matraz espectrofotométrico pipeteando el mismo volumen de aceite vegetal que el trazador de isótopos estable (50 o 100 μL) y dispensándolo en hexano. Asegúrese de que la dilución aplicada (50 o 100 mL) sea la misma que para el trazador de isótopos estables. Invierte el matraz 10 veces para mezclar el aceite con el hexano.
    NOTA: Para pipetear ya sea un trazador isótopico estable o aceite puro, se utiliza una pipeta de desplazamiento positivo de 100 μL. Para asegurar que los volúmenes precisos se pipeteen, es fundamental que la punta se limpie hacia abajo usando papel sin pelusa para eliminar los residuos de trazante/aceite del exterior de la punta. Hay que tener cuidado al limpiar la punta de la pipeta de reemplazo directo para que el papel no entre en contacto con la abertura de la punta, ya que se extraerá aceite del interior de la punta.
  3. Mide las concentraciones estables de trazadores isótopos en una cuveta de cuarzo usando un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 325 nm, utilizando el aceite vegetal del hexano como blanco espectrofotométrico (véase la Tabla 3 como ejemplo).
    1. Comienza las mediciones usando el aceite vegetal del hexano como blanco espectrofotométrico. Limpia la cuveta UV de cuarzo entre cada medición enjuagándola 3 veces con n-hexano. Después de medir todas las muestras, limpia cuidadosamente la cubetas usando n-hexano puro.
  4. Determinar la concentración del trazador isótopico estable usando las lecturas medias de UA y aplicar el coeficiente de extinción molar específico del isótopo usando la ley de Beer-Lambert. A partir de esto, calcula el volumen del trazador de isótopos estables preparado necesario por dosis (véase el ejemplo en los resultados representativos más abajo y en la Tabla 3).

Resultados

Cálculo del tamaño total de la dosis trazadora de isótopos
Para un estudio de una muestra de 100 sujetos, se calculó la cantidad total de [13C10]acetato de retinilo para identificar la cantidad de [13C10]acetato de retinilo que debía sintetizarse (Tabla 2). La cantidad se basa en cálculos de potencia para el tamaño de muestra requerido (n = 100), la pérdida esperada (n=15; 15% de rotación), las pérdidas por pipeteo (20%) y la concentración de acetato de retinilo por dosis de [13C10]; según la sensibilidad del espectrómetro de masas aplicado, la duración del experimento y el grupo de edad de los sujetos). La cantidad total obtenida de RE necesaria (55,2 mg de RE) se convierte entonces en el peso requerido para [13C, 10] acetato de retinilo (63 mg).

Para calcular el volumen de aceite de girasol necesario para disolver [13C10]acetato de retinilo a la concentración deseada, primero establecimos el volumen de entrega de la dosis a 150 μL/dosis (0,15 mL/dosis). A continuación, se calcula la concentración de [13C10]acetato de retinilo en 1 mL de aceite de girasol (Tabla 2). Dividir el peso requerido para [13C10]acetato de retinilo (63 mg) por la dosis requerida da el volumen total de aceite de girasol necesario. Finalmente, el peso del aceite de girasol se determina utilizando la densidad relativa del aceite de girasol.

La concentración precisa de dosis objetivo de [13C10]acetato de retinilo en el aceite se confirmó midiendo las concentraciones estables de trazadores de isótopos utilizando un espectrofotómetro basado en la ley de Beer-Lambert (Tabla 3). Teniendo en cuenta la dilución del trazador isótopico estable durante la medición (factor de dilución de 500) se obtiene una concentración de 2,58 μmol/μL [13C10]acetato de retinilo en aceite. Por tanto, se determinó que el volumen final del trazador isótopico estable preparado necesario para una dosis de 0,4 mg de RE, era de 155 μL (Tabla 3).

Comprobación de la posible isomerización de la dosis trazadora
La pureza isomérica de la dosis trazadora obtenida se determinó comprobando la isomerización cis mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC; Figura 2). Para ello, se secó una muestra de la solución trazadora diluida del paso 5.1.2 bajo gas nitrógeno y el residuo se disolvió de nuevo en etanol al 100% para su inyección. El análisis HPLC de 3 muestras repetidas se realizó utilizando el método de Liu et al.34 para comprobar la presencia de alguna isomerización cis (véase la Figura 2). La pureza de la dosis trazadora debe monitorizarse durante todo el estudio para asegurarse de que la dosis no se está degradando.

Efecto de las concentraciones de la dosis trazadora sobre la fracción de la dosis a lo largo del tiempo
La aplicación de diferentes niveles de dosis conducirá a una fracción variable de la dosis ingerida con el tiempo, lo que podría afectar la capacidad de la plataforma analítica para detectar [13C10]retinol en todos los sujetos en los momentos requeridos. La aplicación de una dosis de 1 mg o 0,4 mg de acetato de retinilo [13C 10] en aceite en adultos (Figura 3A) o niños (Figura 3B) indicó una fracción mayor de la dosis tras administrar 1 mg en comparación con 0,4 mg de acetato de retinilo [13C10] y confirmó la capacidad del LC-MS/MS aplicado para detectar [13C10Retinol en sujetos hasta 28 días después de la dosis. Esto corrobora que la información sobre la fracción de dosis en distintos momentos es fundamental para decidir si el nivel de dosis aplicada es lo suficientemente alto como para obtener una señal superior al nivel de detección para la plataforma analítica aplicada, y que esta información debería obtenerse idealmente durante un estudio piloto con muestras representativas.

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Figura 1: Diagrama de flujo para la preparación de dosis trazadoras de vitamina A. Pasos clave para llevar a cabo la preparación de la dosis de isótopos estables, incluyendo la determinación de las cantidades requeridas, la concentración de la dosis trazadora obtenida y la confirmación de la pureza de la dosis. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Cromatografía HPLC de la dosis trazadora para investigar la isomerización del acetato de retinilo. La posible isomerización de [13C10] acetato de retinilo tras (A) sonicación y (B) calentamiento a 50 °C durante 30 minutos cada uno se evaluó mediante análisis HPLC de la dosis de isótopos tras cada paso. El análisis se realizó en un HPLC con detección de matriz de diodos utilizando el método de Liu et al.34. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Media observada de la fracción plasmática de retinol de dosis a lo largo del tiempo tras la ingestión de acetato de retinilo [13C 10]. Fracción de la dosis de (A) 45 adultos del Reino Unido16 y (B) 112 niñosfilipinos 1 a quien se le administró una dosis de 1 mg o 0,4 mg [13C, 10] acetato de retinilo, respectivamente. Fracción de la dosis = {concentración plasmática [13C]retinol (μmol/L) X volumen plasmático estimado (L) / [13C]dosis (μmol). Los datos se muestran como media geométrica ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Isótopo estableProveedor/Fabricante
[D4]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge
[D6]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge
[D8]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge
[13C3]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge
[13C8]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge
[13C10]-acetato de retiniloBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratorio de Isótopos de Cambridge

Tabla 1: Trazadores de isótopos estables de vitamina A disponibles comercialmente. Lista de trazadores de acetato de retinilo etiquetados con 13C y 2H de diferentes proveedores.

Parámetros
Tamaño de muestra [n]:100
Desgaste [n] (%):15 (15%)
Pérdidas por pipetos:20%
MW [13C10]acetato de retinilo:338,5 μg/μmol
MW [13C10]retinol:296,46 μg/μmol
Tamaño de la dosis:0,4 mg de RE de [13C10]acetato de retinilo por voluntario
Cálculo
Cantidad total de RE requerida:= tamaño de la dosis en mg RE x tamaño de muestra x pérdida por pérdida por pipeteo
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Cantidad total de [13C10]acetato de retinilo requerida:= mg RE x MW [13C10]acetato de retinilo / MW [13C10] retinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10] acetato de retinilo
Concentración dosificada de [13C10]acetato de retinilo en aceite:[13C10]acetato de retinilo [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]acetato de retinilo / MW [13C10]retinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Volumen total de aceite de girasol necesario:= Peso total de [13 C 10] en la concentración de acetato de retinilo en el aceite
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml de aceite
Peso de aceite de girasol necesario:= Volumen total de aceite de girasol x densidad relativa de aceite de girasol
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g de aceite de girasol

Tabla 2: Ejemplo de cálculos de tamaño de dosis trazadores de isótopos estables. Indicación de parámetros y cálculos para determinar la dosis del trazador y las cantidades de aceite vegetal.

Parámetros
Coeficiente de extinción molar (E1%1 cm) de [13C10]acetato de retinilo en hexano:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Factor de dilución:500 (100μL de preparación de aceite en 50 mL de hexano)
Absorbancia media medida:0.917
MW [13C10]retinol:296,46 μg/μmol
Cálculo
Concentración (mol/L) de [13C10]acetato de retinilo en hexano:Concentración (mol/L) = Absorción /E 1%1cm x Longitud de la cubetas (1cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Convirtiendo la concentración en μmol/μL:Concentración (mol/L) = Concentración (μmol/μL)
1,739 x 10-5 mol/L equivale a 1,739 x 10-5 μmol/μL
Corregir por dilución:1,739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10-3 μmol/μL en aceite
Peso por μL (μg/μL):= [13C10] acetato de retinilo μmol/μL en aceite x MW [13C10] retinol
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volumen por dosis:= Volumen (μL/ dosis de 400 μg) = 400 μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tabla 3: Determinación de la concentración estable de dosis trazadora de isótopos. Parámetros y cálculos necesarios para determinar las concentraciones de dosis trazadoras y los volúmenes requeridos para la dosificación oral.

Discusión

Los trazadores isótopos estables utilizados en estudios humanos se consideran generalmente seguros, sin efectos biológicos o fisiológicos adversos reportados en las concentracionesaplicadas 25,35. Sin embargo, dado que el trazador de isótopos estable debe administrarse por vía oral, es esencial que la dosis del trazador cumpla con las normas de seguridad alimentaria. Esto puede lograrse exigiendo a los proveedores y fabricantes de vitamina A marcada con isótopos estables a realizar pruebas de seguridad alimentaria sobre los isótopossuministrados 7,20,24. Asimismo, es imprescindible que la preparación y almacenamiento de isótopos solo se realice en áreas dedicadas a la preparación de alimentos. Además, todo el equipo utilizado para preparar isótopos estables debe dedicarse únicamente a la preparación de isótopos y mantenerse en áreas para la preparación de alimentos.

Los isótopos marcados con acetato de retinilo se han disuelto previamente utilizando etanol, luego se han secado bajo gas nitrógeno antes de disolverse en aceitevegetal 36. Aquí presentamos un método que permite disolver el trazador marcado con isótopos en aceite vegetal mediante una combinación de sonicación y calor. Aunque este método es más fácil de realizar en una zona de preparación de alimentos, hay que tener cuidado al aplicar calor para disolver el trazador en aceite vegetal. El all-trans-retinol se isomeriza a 13-cis-retinol durante el tratamiento térmico, que se acelera con temperaturasmás altas 37. La isomerización del retinol aumenta aún más mediante la exposición a la luz32. Además, la estabilidad del retinol está influida por la propiedad de oxidación lipídica del aceite vegetal32,38. Dado que el contenido de α-tocoferol en el aceite vegetal tiene un impacto positivo en la retención de vitaminaA 32, y el aceite de girasol tiene uno de los contenidos más altos de α-tocoferol33, optamos por usar aceite de girasol para preparar las dosis trazadoras. La decisión de aplicar hasta 50°C para disolver el trazador se basó en la aplicación de calor para disolver cristales de retinol en productos cosméticos sin pérdidassignificativas 39. Aunque no hemos observado una degradación significativa del acetato de retinilo bajo el protocolo descrito, es vital comprobar la isomerización cis de la dosis trazadora justo después del tratamiento térmico (Figura 2). Además, recomendamos que se controle la estabilidad de la dosis trazadora durante todo el estudio para confirmar la concentración aplicada de la dosis trazadora.

El trazador debe prepararse a una concentración dentro de los límites volumétricos del sistema de administración utilizado para administrar la dosis requerida. Dado que el DI depende de la entrega precisa de trazadores estables marcados con isótopos, se recomienda usar una pipeta de desplazamiento positivo para la aplicación de la dosis. Aunque en el pasado se han aplicado dosis de hasta 1 mL aadultos 16, 20 y 40, es más fácil aplicar volúmenes entre 100 y 250 μL, ya que se ha demostrado que estos volúmenes son bien tolerados por lactantes yniños 1. Alternativamente, las dosis también pueden administrarse en cápsula17, pero es esencial seleccionar cápsulas diseñadas específicamente para prevenir fugas de aceite y asegurar su aceptación dentro de la población estudiada. Finalmente, los niveles de dosis aplicados dependen del grupo de edad de la poblaciónobjetivo: 29, la capacidad de la plataforma analítica aplicada para detectar nivelesbajos 3 y las reservas corporales totales de la población objetivo, con una fracción plasmática menor de dosis en reservas corporales totales másaltas 1.

Como se indica en el ejemplo anterior, [13C10]acetato de retinilo a una concentración de 2,58 μg/μL en aceite de girasol proporcionará una dosis de trazador de 0,4 mg de RE en 155 μL de aceite de girasol, que puede administrarse con precisión usando una pipeta de desplazamiento positivo de 250 μL. Para obtener concentraciones dentro de los límites volumétricos del sistema de administración, es fundamental que el aceite vegetal elegido para solubilizar el trazador se pese con precisión usando una balanza analítica (con precisión de 0,1 g) en el frasco que contiene el trazador de isótopos estable. Por ejemplo, si se prepara un total de 63 mg [13C10] acetato de retinilo a una concentración de 3,04 mg/mL en aceite de girasol, y la densidad específica del aceite de girasol es de 0,92 g/mL a 25 ◦C, entonces hay que pesar 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) de aceite en el frasco que contiene el trazador. Aunque la concentración final del trazador de isótopos estable se confirmará mediante una lectura de espectrofotómetro, un pesaje preciso del trazador de isótopos y del aceite aplicado garantizará que las concentraciones obtenidas estén cerca del volumen de entrega elegido para cada dosis.

Se recomienda alicuotar las preparaciones de aceite según la necesidad diaria prevista para asegurarse de que todas las dosis del vial se usen en un plazo de 2 semanas tras abrir el vial. Es mejor mantener las preparaciones de aceite en bolsas de hielo en el campo durante el uso y volver a congelarlas lo antes posible tras completar la dosificación. Aunque las preparaciones de aceite no se ven afectadas por ciclos repetidos de congelación y descongelación, siempre deben protegerse de la luz y congelarse cuando no se usan.

En resumen, este protocolo detalla la preparación precisa y el control de calidad de las dosis trazadoras para el método de DRI, garantizando una dosificación precisa, estabilidad y seguridad. El método calcula los requisitos de trazadores, optimiza la solubilización en aceite vegetal y verifica la pureza y concentración mediante espectrofotometría y HPLC. Directrices rigurosas de manipulación y almacenamiento garantizan una integridad fiable del trazador para evaluaciones basadas en isótopos precisos.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

El apoyo a este trabajo fue proporcionado por la Fundación Bill & Melinda Gates (Número de Proyecto: OPP1115464) y el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) en Viena (Número de Proyecto E4.30.30).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Frascos de vidrio ámbar de 2 ml para alicuar dosisFisher11573690Dependiendo del tamaño de la muestra del estudio y de la cantidad de voluntarios que se administren diariamente, puede ser más eficiente utilizar viales ámbar más grandes, por ejemplo, de 4 ml,
Matrazas volumétricas de 100 mlFisher11323644Matraz volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Clase A
Frascos volumétricos de 50 mlFisher11313644Matraz volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Clase A
Balanzas analíticas  Fisher13592970
Pistones capilares (puntas de pipeta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistones capilares CP1000ST 2x91GilsonF148180
Pistones capilares CP250ST 6x96GilsonF148714
Criocaja de cartónStarlabA9623-8181
Cuvette Hellma cuvette cuarzo UVSLSCEL1600
Hexano 95% N-Hexano para HPLC Certificado HPLCFisherH/0406/17
Tapas para viales de vidrio ámbar de 2 mlFisher11573542
Microman E M1000E Pipeta (desplazamiento positivo)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipeta (desplazamiento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipeta (desplazamiento positivo)GilsonFD10005
MicroscopioNikonEclipse E400
Portaobjetos de vidrio para microscopio  Sigma41122601
Baños de agua sónicosVWRUSC100T
EspectrofotómetroThermo Fisher ScientificA51119600C
Trazador estable marcado con acetato de retinilo marcado por isótoposBuchem BVN/ASe puede utilizar una variedad de isótopos estables para el método de DRI. Una lista de diferentes isótopos disponibles comercialmente se presenta en la Tabla 1.  
Baño de agua sin removerSLSSLS1176
Aceite vegetalCualquier supermercadoN/AEs importante utilizar aceite vegetal fresco con una vida útil suficiente para preparar dosis de isótopos.
Pipeta pasteur de vidrio desconectado Volac 150mmSLSPIP4150

Referencias

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