Artículo de método

Un ensayo serológico multiplex para la detección de respuestas de anticuerpos a arbovirus

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DOI:

10.3791/69259

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4 de noviembre de 2025

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1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

En este artículo

Resumen

Los inmunoensayos de fluorescencia multiplex se están convirtiendo en una referencia para las pruebas serológicas. Sin embargo, su aplicación está limitada por la complejidad y los procesos de acoplamiento de perlas-analitos que requieren mucho tiempo. Este informe presenta un protocolo de acoplamiento de microesferas multiplex semiautomatizado y reproducible que es comparable al método estándar y reduce considerablemente el tiempo de obtención de resultados.

Resumen

Los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) son un grupo de patógenos transmitidos por mosquitos que se distribuyen globalmente. Desde el brote del virus del Zika (ZIKV) en 2016 en las Américas, que llevó estas infecciones a la opinión pública, los arbovirus continúan imponiendo una carga considerable para la salud pública. Su aparición en regiones previamente no endémicas es motivo de preocupación para la salud pública. La vigilancia y el control de las infecciones arbovirales es una prioridad actual para la Organización Mundial de la Salud (OMS), que lanzó un plan estratégico mundial para combatir las enfermedades arbovirales en 2024. La tecnología multiplex® ha revolucionado el campo de la vigilancia serológica, permitiendo la medición simultánea de múltiples anticuerpos y requiriendo un volumen mínimo de muestra. Sobre la base de la experiencia en el desarrollo de pruebas serológicas multiplex, se desarrolló un ensayo multiplex basado en perlas para la detección de anticuerpos contra antígenos de arbovirus. El ensayo comprende múltiples antígenos específicos de arbovirus comunes, incluidos los virus del dengue (DENV), la fiebre amarilla (YFV), el Zika y el chikungunya (CHIKV). Se utilizó un método semiautomático para unir covalentemente los antígenos a las microesferas. Este nuevo protocolo es altamente efectivo, ya que permite el acoplamiento de hasta 96 antígenos en un solo experimento al tiempo que garantiza resultados reproducibles. Los datos de la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) se adquirieron utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia fácil de usar. Cuando se aplica a muestras de suero humano de países endémicos, anticipamos que este ensayo constituirá una herramienta poderosa para los esfuerzos de serovigilancia.

Introducción

Los arbovirus representan colectivamente miles de muertes cada año. Estos virus se transmiten a los humanos a través de artrópodos infectados, principalmente mosquitos y garrapatas. La gravedad de las infecciones arbovirales es diversa y varía desde una infección asintomática hasta una enfermedad grave que puede provocar la muerte. En 2024, la Organización Mundial de la Salud (OMS) registró más de 10.000 muertes causadas solo por los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV)1. El mismo año, el virus infectó a más de 14 millones de personas, incluidos 50.000 casos graves1. Si bien el DENV es el arbovirus más prominente, el grupo incluye otros patógenos potencialmente mortales que han sido responsables de múltiples brotes en todo el mundo. Una revisión resumida reciente de las infecciones arbovirales en África encontró que estos virus, incluidos el DENV, el virus de la fiebre amarilla (YFV), el virus chikungunya (CHIKV), el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), el virus del Nilo Occidental (WNV) y el virus del Zika (ZIKV), causaron al menos 29 brotes en todo el continente en 20232. En 2022, un informe publicado por la Oficina Regional de la OMS para África destacó las limitaciones actuales en la vigilancia de arbovirus en toda la región, enfatizando la necesidad urgente de desarrollar métodos para la vigilancia y el control de arbovirus3.

El diagnóstico clínico de las infecciones arbovirales es un desafío debido a las similitudes en los síntomas, como fiebre, artralgia y malestar general, que son comunes a otros patógenos presentes en regiones endémicas4. Además, debido a la cocirculación y potencialmente coinfección de los virus, la distinción del patógeno etiológico es difícil5. La confirmación de laboratorio es crucial para el diagnóstico diferencial. Existen varios métodos para la detección de arborvirus en muestras humanas. Los métodos directos, incluidas las pruebas de diagnóstico molecular, la detección de antígenos virales y el aislamiento viral, detectan la presencia del patógeno, mientras que los métodos indirectos, como el diagnóstico serológico, miden la respuesta inmune a la infección viral6.

Se ha desarrollado una gran cantidad de métodos para la detección de respuestas de anticuerpos a arbovirus. Estos incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), fijación del complemento, inhibición de la hemaglutinación e inmunoensayos de microesferas 6,7. Este informe presenta un inmunoensayo basado en microesferas de fluorescencia múltiple (FMIA) para la detección de respuestas de anticuerpos a antígenos de arbovirus. Los ensayos basados en microesferas8 se utilizan ampliamente en serología y ofrecen varias ventajas, la más importante, la capacidad de detección de múltiples analitos en una sola reacción con un volumen de muestra mínimo. En un inmunoensayo serológico indirecto se utilizan microesferas codificadas ópticamente (perlas magnéticas de poliestireno) recubiertas con antígenos recombinantes de interés. A continuación, las perlas acopladas se incuban con muestras y se detectan anticuerpos específicos de antígeno utilizando un anticuerpo secundario IgG humano conjugado con un indicador de fluoróforo de ficoeritrina (PE). Hay varios analizadores disponibles para la detección de fluorescencia emitida, que se informa como MFI.

El principio del ensayo se detalla en Angeloni et al.8. Brevemente, los antígenos de interés se unen químicamente a microesferas codificadas por colores. Para ello, las perlas se tratan inicialmente con 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) y N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), que activan el grupo carboxilo en la superficie de las perlas, creando un compuesto reactivo a las aminas. Este compuesto semiestable intermedio se mezcla luego con la proteína de interés, por lo que los restos de amina de la proteína se unen covalentemente a las perlas, generando microperlas estables recubiertas con la proteína de interés en la superficie. Las perlas unidas al antígeno se incuban con muestras, lo que permite que los anticuerpos se unan a antígenos específicos. Los anticuerpos unidos a antígenos se detectan utilizando un anticuerpo secundario antiinmunoglobulina conjugado con un tinte fluorescente. Utilizamos anticuerpos secundarios marcados con PE. Las IMF se miden utilizando un generador de imágenes de luz (los detalles del instrumento se proporcionan en la Tabla de materiales). El instrumento utiliza dos luces LED, un LED rojo y un LED verde, que excitan por separado los tintes internos de las perlas y una fluorescencia reportera en la superficie de las perlas9. Luego, los filtros se utilizan para clasificar las perlas según el color y cuantificar la fluorescencia emitida por los analitos.

Anteriormente aplicamos la tecnología para la detección de respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-210 y enfermedades preveniblespor vacunación 11 y demostramos que los ensayos multiplex constituyen una herramienta invaluable para los estudios de seroprevalencia y vigilancia. El objetivo de este proyecto es extender el uso del FMIA a la detección de respuestas de anticuerpos a múltiples antígenos pertenecientes a arbovirus con el objetivo de aplicar el ensayo para examinar muestras de la región africana.

Los ensayos multiplex de arbovirus que utilizan tecnología multiplex se han descrito en otros lugares utilizando diferentes dianas de antígenos, como la proteína no estructural 1 (NS1)12,13 o el dominio de la envoltura III (EDIII)14. Se presenta un ensayo de 50 plex, que incluye 26 antígenos de arbovirus (incluidos NS1, EDIII, partículas similares a virus (VLP) y muchos otros antígenos para detectar patógenos que circulan simultáneamente en la región. El ensayo permitirá evaluar la intensidad de transmisión de estos patógenos. En la Tabla 1 se proporciona un resumen de los antígenos recombinantes utilizados para el desarrollo del ensayo.El protocolo presentado en este informe se desarrolló como complemento de un extenso estudio de desarrollo de métodos enfocado en optimizar la detección de arbovirus.

Normalmente, el acoplamiento (o fijación) de antígenos a las microesferas se realiza en tubos individuales8 (acoplamiento manual). Este proceso requiere mucho tiempo, es engorroso y propenso a errores de reproducibilidad. Este artículo informa de un protocolo que utiliza un instrumento automatizado para realizar los pasos sucesivos involucrados en la unión química de antígenos a las perlas. En este manuscrito, informamos los pasos realizados para la validación del nuevo protocolo. La validación del nuevo protocolo se realizó comparando las respuestas de IgG medidas con un FMIA de 50 plex utilizando perlas acopladas a antígenos preparadas con el método manual o el protocolo automatizado. Se realizó una validación adicional del método mediante el análisis de muestras de suero humano de cohortes africanas y francesas.

El protocolo de acoplamiento automatizado de perlas es rápido, lo que permite el acoplamiento simultáneo de hasta 96 analitos en una sola ejecución. Más importante aún, los resultados son comparables a los obtenidos utilizando el protocolo manual establecido, con una variación reducida de lote a lote.

Protocolo

Se obtuvo la aprobación ética adecuada para el uso de muestras humanas. Las muestras fueron residuos anónimos de estudios anteriores. El protocolo para el uso de muestras ORPAL de "grupo estándar" fue aprobado por el Consejo Nacional de Ética de Surinam (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Opinión Número VG 25-17). El uso de muestras de Madagascar fue aprobado como parte del proyecto PvSTATEM por el Comité de Ética de la London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) y el Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale de Madagascar (135MSANP/SG/AMM/CERBM), mientras que el uso de muestras senegalesas fue aprobado como parte del proyecto en curso Dielmo y Ndiop por el Comité Nacional de Ética de la Investigación en Salud de Senegal (CNERS Sénégal). La aprobación para medir anticuerpos contra defectos del tubo neural en estas muestras fue otorgada por CNERS Senegal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). Las muestras francesas no endémicas se derivaron de pruebas médicas de rutina dentro de los laboratorios de hospitales franceses y se procesaron de acuerdo con las regulaciones y pautas existentes de la Comisión Francesa de Protección de Datos (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés). Se obtuvieron muestras de suero humano de sujetos de regiones con alta prevalencia de arbovirus y de una población francesa ingenua. Las muestras de suero se inactivaron por calor antes de su uso mediante incubación a 56 °C durante 30 min. Si las muestras no están inactivadas, manipúlelas debajo de un gabinete de seguridad. La mayoría de los antígenos recombinantes se obtuvieron comercialmente, excepto las proteínas recombinantes EDIii, que se sintetizaron internamente. Se utilizó un instrumento analizador basado en imágenes9 para la adquisición de datos. Los reactivos y equipos utilizados se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Determinar las concentraciones óptimas de antígenos para el acoplamiento

NOTA: Para evitar el fotoblanqueo, minimice la exposición de las perlas de microesferas a la luz durante todo el procedimiento. Antes del acoplamiento a granel, optimice las concentraciones de acoplamiento para cada antígeno utilizando un protocolo de acoplamiento manual. El protocolo fue adaptado de Angeloni et al.8. Los tampones y las soluciones se detallan en la Tabla complementaria 1.

  1. Seleccione las regiones de cordón que se utilizarán para el acoplamiento. Completamente vórtice durante 20 s. Sonicar el tubo durante un mínimo de 60 s.
  2. Transfiera 200 μL (2,5 M de perlas) de perlas a un tubo de 1,5 mL.
  3. Lave las perlas con 200 μL 100 mM de fosfato de sodio monobásico / 0,125x Tritón.
    1. Coloque el tubo en un separador magnético de tubos durante 60 s. Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar las cuentas.
    2. Agregue tampón de fosfato de sodio monobásico. Dejar en la rejilla magnética durante 60 s. Retire el sobrenadante.
  4. Active las perlas con un tampón que contenga 80 μL de fosfato de sodio monobásico 100 mM, 0,125x Triton, 10 μL de sulfo-NHS y 10 μL de EDC.
    1. Agregue fosfato de sodio monobásico -sulfo-NHS -EDC a los tubos. Incubar en la oscuridad durante 20 min a temperatura ambiente en un rodillo.
    2. Lave las perlas en PBS de 250 μL (1x) y Tritón 0,125x. Repita el lavado tres veces.
  5. Unir los antígenos.
    1. Preparar las diferentes concentraciones (diluciones seriadas) de antígenos en un volumen total de 1 mL, 1x PBS y 0,125x Tritón. Pruebe al menos dos concentraciones de antígenos.
    2. Agregue soluciones de antígenos a las perlas activadas. Incubar en la oscuridad 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C en un rodillo.
  6. Lave las perlas acopladas en PBS-TBN de 500 μL y Tritón de 0,125x. Repita el lavado tres veces.
  7. Vuelva a suspender las perlas acopladas en 1 ml de PBS-TBN y 0,125x Triton.
    NOTA: Guarde las perlas acopladas a 4 °C durante al menos 24 h antes de usarlas. Las perlas acopladas mostraron variabilidad en las IMF cuando se probaron inmediatamente después del acoplamiento en comparación con las pruebas después de 24 h.
  8. Seleccione una concentración óptima para usar en acoplamientos posteriores a gran escala. Utilice diferentes perlas acopladas para el inmunoensayo en un grupo estándar. Seleccione la concentración más baja a la que se obtuvo una curva estándar lineal.
    NOTA: En la sección de resultados, Figura 1, se proporciona un ejemplo de linealidad de la respuesta de anticuerpos a un grupo estándar.

2. Acoplamiento de cordón automatizado a gran escala

  1. Prepara las cuentas Pro Magnetic COOH.
    1. Calcule las perlas requeridas: Usando 500 perlas / muestra, 2.5 millones de perlas son suficientes para 5000 muestras.
    2. Prepare las regiones de cordón para usar para el acoplamiento como se describió anteriormente.
    3. Transfiera el volumen deseado de perlas a los pocillos asignados. Para 2,5 millones, se utilizaron 200 μL de perlas (la concentración estándar de Luminex es de 1,25e7 perlas/ml).
  2. Prepara los antígenos. Este es un paso crítico para garantizar cantidades precisas de antígenos.
    1. Calcule las cantidades de antígeno requeridas, después de la optimización. Las concentraciones utilizadas para cada antígeno se detallan en la Tabla 1.
    2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle bien un volumen adecuado de antígenos de interés con 1x PBS / 0,125x Triton hasta un total de 1 ml.
  3. Prepare platos con reactivos. Prepare placas de pocillos de 96 profundidades de la siguiente manera. Los volúmenes son por pocillo y se calculan para un acoplamiento de 2,5 millones de cuentas.
    1. Placa 1 (Peines de punta): peines de punta de carga.
    2. Placa 2 (Perlas): Agregue 8 μL de Tritón 0.125x y 200 μL de las regiones de perlas de interés.
    3. Placa 3 (Wash1): Agregue 200 μL de fosfato de sodio monobásico 100 mM / 0,125x Triton.
    4. Placa 4 (Activación): Agregue 80 μL de fosfato de sodio monobásico 100 mM / 0,125x Tritón + 10 μL sulfo-NHS + 10 μL EDC.
    5. Placa 5 (Wash2): Añadir 250 μL de 1x PBS /0,125x Triton.
    6. Placa 6 (Acoplamiento): Transfiera 1 ml de solución de antígeno al pocillo asignado.
    7. Placa 7 (Wash3): Agregue 500 μL de PBS-TBN / 0.125x Triton.
    8. Placa 8 (placa final, contiene perlas acopladas): Agregue 1 ml de PBS-TBN + 0,125x Triton.
  4. Configure la ejecución del ciclo de acoplamiento en el procesador automatizado.
    1. Siga las instrucciones del fabricante para encender la máquina y configurar el protocolo. El software necesario se puede descargar en el PC15. Los parámetros específicos de la ejecución se detallan en la Tabla complementaria 2.
    2. Cargue las placas en la ranura asignada en la máquina. Seleccione el protocolo. Inicie el ciclo. El tiempo estimado para completar el programa es de 2:50 h.
  5. Fin de ciclo
    1. Siga las instrucciones del fabricante para apagar la máquina. Descargue las placas según las instrucciones. Verifique visualmente que la placa 8 contenga las cuentas (gránulo marrón). Además, se exporta un informe de ejecución desde los instrumentos.
    2. Transfiera las perlas acopladas de la placa 8 a tubos individuales de 1,5 ml para su almacenamiento. Almacene las perlas acopladas a 4 °C hasta su uso.
  6. Cuenta las cuentas.
    NOTA: Se utilizó un contador de células. Para el recuento manual con un hemacocitómetro, consulte el manual del libro de cocina Luminex8.
    1. Perlas completamente acopladas al vórtice. Transfiera 10 μL a una cámara de recuento de células. Siga las instrucciones del fabricante para leer el recuento de perlas por ml.
    2. Compruebe la agregación visualizando la imagen en el contador de celdas. Consulte la Figura complementaria 1 para obtener una imagen representativa de las cuentas no agregadas.
    3. Si hay agregados presentes, agite completamente el vórtice y sonique durante al menos 5 min. Recuento repetido
      NOTA: Después del recuento de perlas, la eficiencia del acoplamiento se evaluó realizando un inmunoensayo de perlas acopladas en un grupo estándar para evaluar la linealidad de la respuesta de anticuerpos.

Tabla 1: Panel de antígenos incluidos en el 50-plex. El ensayo incluye múltiples antígenos para la detección de infecciones arbovirales y patógenos cocirculantes. Se proporcionan cantidades de antígenos utilizados para el acoplamiento de 1,25 millones de perlas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Inmunoensayo multiplex

NOTA: Los pasos detallados del protocolo para la medición de MFI se proporcionan en el manual respectivo9. Para minimizar la exposición de las perlas a la luz y el riesgo de fotoblanqueo, todas las soluciones y muestras se preparan antes de sacar las perlas del refrigerador.

  1. Configure el diseño de la placa. Se utilizaron placas de 96 pocillos que incluyeron diluciones en serie de un grupo estándar, así como un espacio en blanco (solo tampón) en la primera fila.
  2. Diluya las muestras y el patrón en tampón PBT en una placa no vinculante separada. Se utilizó una dilución 1:200 (concentración final de 1:400) para las muestras. Para la curva estándar, se utilizó una dilución de 1:50 del conjunto de suero estándar (lo que resultó en una concentración final de 1:100) y diez diluciones en serie de 2 veces.
  3. Determine la cantidad de perlas acopladas que se utilizarán en un volumen total de 50 μL/pocillo. Se utilizaron 500 perlas de cada perla por pocillo y se ajustaron al volumen con tampón PBT.
  4. Mezcle completamente las perlas acopladas durante 30 s. Sonicar durante al menos 60 s.
  5. Calcule el volumen de cada perla acoplada para agregar a la premezcla multiplex para garantizar perlas iguales para cada analito. Los volúmenes de perlas se calcularon de la siguiente manera: Volumen de perlas por pocillo = número de perlas por pocillo / recuento de perlas.
    NOTA: En la Tabla complementaria 3 se ilustra un ejemplo para el cálculo de las perlas y los volúmenes de tampón necesarios para la premezcla.
  6. Transfiera volúmenes adecuados de antígeno de perlas a un tubo de centrífuga.
  7. Ajusta el volumen con PBT.
  8. Mezcle bien la premezcla.
  9. Distribuya 50 μL de la premezcla a la microplaca de imagen (por ejemplo, ps, placas de fondo f).
  10. Agregue 50 μL de las muestras diluidas a las perlas.
  11. Mezclar en una coctelera de platos durante 30 min a temperatura ambiente, 700 rpm.
  12. Lave las placas tres veces de la siguiente manera (lavado manual).
    1. Coloque la placa en una rejilla magnética durante 60 s a temperatura ambiente. Sostenga el plato firmemente en la rejilla y deseche el sobrenadante.
    2. Agregue 100 μL de tampón PBT. Dejar en la rejilla magnética durante 60 s. Repite los lavados
      NOTA: Alternativamente, se puede utilizar una lavadora de placas16 . La lavadora se configuró de la siguiente manera: 1 ciclo de remojo, seguido de 3 ciclos (aspiración, dispensación y remojo) y un ciclo final de aspiración.
  13. Deseche el sobrenadante y agregue 50 μL de anticuerpo secundario diluido.
    1. Siga las instrucciones del proveedor para preparar una solución madre del anticuerpo secundario. Se utilizó una solución de dilución 1/120 de anticuerpo secundario. Los volúmenes de anticuerpos secundarios se calcularon de la siguiente manera: volumen de anticuerpos secundarios = volumen total/factor de dilución.
    2. Mezcle el anticuerpo secundario con un volumen adecuado de tampón PBT. Mezclar bien. Agregue 50 μL de anticuerpo secundario diluido a las perlas lavadas.
  14. Incubar en una coctelera durante 15 min a temperatura ambiente, 700 rpm.
  15. Realice tres lavados como se describió anteriormente.
  16. Vuelva a suspender las perlas en tampón PBT de 150 μl.
  17. Incubar en una coctelera durante 5 min a temperatura ambiente, 700 rpm. Siga las instrucciones del fabricante para configurar los instrumentos9.
    NOTA: Se utilizó el software xPONENT17 suministrado con el instrumento generador de imágenes. Los ajustes para la lectura de fluorescencia se establecieron de la siguiente manera: el volumen de recolección se estableció en 50 μL, con una medida mínima de 50 perlas, sin calentador XY, y el tipo de análisis como ninguno.

4. Análisis de datos

  1. Ejecutar validación
    1. Compruebe que se ha alcanzado el número mínimo de cuentas. Se recomiendan al menos 35 perlas por pocillo para obtener un MFI8 estadísticamente válido.
    2. Compruebe que los valores de MFI de la muestra de control negativo y en blanco son mínimos.
    3. Compruebe los valores de MFI para estándares trazando una curva estándar. Estos son más altos que la muestra en blanco y/o de control negativo.
  2. Análisis de datos de muestra
    1. Exporte los datos como archivos CSV y analice externamente con el software R.

Resultados

Para ilustrar el proceso seguido para la validación del protocolo, hemos seleccionado tres antígenos que representan tres familias de arbovirus: Flavivirus (proteína DENV1 NS1), Alphavirus (proteína CHIKV VLP) y Bunyavirus (RVFV NP). Los antígenos se probaron en un grupo estándar de una población preexpuesta (ORPAL), sueros de población francesa (no expuestos) y dos cohortes de África (Senegal y Madagascar).

Linealidad de dilución de la respuesta de anticuerpos
La concentración de antígenos a utilizar para el acoplamiento de perlas se determinó utilizando diluciones seriadas del pool ORPAL. La concentración óptima se seleccionó como la concentración más baja a la que se obtuvo una curva estándar lineal (datos no mostrados). La Figura 1 muestra la linealidad de los antígenos de arbovirus seleccionados a concentración óptima para cada antígeno. Para el control de calidad del acoplamiento, cada lote de perlas acopladas se probó para determinar la linealidad de la dilución en el grupo estándar ORPAL utilizando la concentración preseleccionada.

Comparabilidad con el ensayo de acoplamiento manual estándar
Para evaluar la comparabilidad de los datos obtenidos utilizando el nuevo protocolo automatizado con el acoplamiento manual bien establecido, comparamos las curvas estándar generadas a partir de los resultados obtenidos con el acoplamiento manual versus el acoplamiento automatizado. La Figura 2 muestra la linealidad paralela para ambos ensayos. Los valores de MFI varían según el antígeno.

Variación del lote de acoplamiento de cordones
La variación del lote de acoplamiento, ya que se evaluó la reproducibilidad de las pruebas del mismo lote de acoplamiento, se evaluó utilizando la tabla de Levey-Jennings18. Los antígenos representativos y las perlas de control acopladas a BSA se utilizaron y probaron en el grupo estándar ORPAL. La Figura 3 muestra IMF de 19 placas diferentes, probadas en diferentes días para cada antígeno. Los IMF resultantes caen dentro del rango de la media ± 3 DE para los tres antígenos y el control.

Efecto de la multiplexación en MFI
Para evaluar aún más el rendimiento del ensayo, probamos si la multiplexación de varios antígenos afectaba la respuesta de anticuerpos medida. La respuesta se comparó con un solo antígeno (o perla de un solo plex) utilizando el grupo estándar ORPAL. La Figura 4 muestra una fuerte correlación (R = 0,99, p < 2,2e-16) entre los resultados obtenidos cuando se midieron los IMF en antígenos individuales o en una premezcla que contenía 50 antígenos.

Respuestas de anticuerpos de muestras de suero humano en poblaciones africanas
Para evaluar la aplicabilidad del ensayo a muestras de diversas cohortes, comparamos las respuestas de anticuerpos en muestras de suero humano de poblaciones africanas, que tienen una alta probabilidad de exposición a arbovirus, con las de una cohorte francesa que presumiblemente tiene una menor exposición a estos virus. En total, se analizaron 1.596 muestras para Madagascar, 1.428 para Senegal y 84 de la cohorte francesa. La Figura 5 presenta gráficos de densidad para las diferentes cohortes. Para la cohorte de Senegal, se observa una clara distribución bimodal de los datos para las respuestas a CHIKV VLP, lo que sugiere dos respuestas distintas a CHIKV en la población. También se observa una cola bimodal sutil para DENV1 NS1 y RVFV NP en la cohorte de Senegal, mientras que no hay diferencia entre las cohortes francesa y de Madagascar.

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Figura 1: Linealidad de la respuesta de anticuerpos probada en el grupo estándar ORPAL. Los antígenos de arbovirus seleccionados se muestran como ejemplo. Las intensidades de fluorescencia medianas (MFI) se muestran en el eje y (escala logarítmica) y la dilución en serie del grupo estándar en el eje x. Todos los antígenos del panel se probaron previamente en el grupo estándar antes de realizar pruebas masivas en las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Linealidad paralela de la respuesta de anticuerpos por métodos de acoplamiento. Logaritmo de MFI (eje y) de antígenos representativos (faceta) probados en diluciones seriadas del grupo estándar ORPAL (eje x). Los colores representan diferentes métodos de acoplamiento: automatización (rojo, verde, azul) y manual (morado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Variación de placa a placa. Levey_Jennings gráficos para el cordón acoplado BSA (control), DENV1 NS1, CHIKV VLP y RVFV se muestran para el grupo estándar ORPAL a una concentración de 1:400. Los resultados representan 19 placas ejecutadas en días diferentes. Las IMF se presentan en el eje y, el número de pruebas está en el eje x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Correlación de la respuesta de anticuerpos al ensayo mono y múltiple. El grupo estándar se diluyó a una concentración final de 1:400 y se probó en una premezcla que contenía los antígenos de 50 plex en paralelo con perlas recubiertas de antígeno único. Para el análisis se utilizó la correlación de Pearson. Se muestran tres antígenos representativos como ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Aplicación del ensayo en la cohorte endémica y no endémica de muestras. El ensayo se probó en muestras de Madagascar (verde), Senegal (azul) y Francia (rojo). Las muestras se diluyeron a una concentración final de 1:400. El eje X representa IMF normalizadas (nMFI), calculadas como una relación entre MFI de muestra y MFI de grupo estándar a la misma concentración (1:400). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Ejemplo de imagen representativa de agregación de cuentas. El panel (A) muestra cuentas no agregadas y el panel (B) muestra agregados de cuentas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Tabla de búferes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Configuración del protocolo de acoplamiento de perlas KingFisher Apex. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Ejemplo de cálculo de volúmenes de perlas para premezcla. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El uso de FMIA ha cambiado el panorama de las pruebas serológicas. La fortaleza de los ensayos radica en la capacidad de evaluar las respuestas de anticuerpos a múltiples antígenos en una sola reacción, lo que reduce el tiempo de obtención de resultados y disminuye el costo de las pruebas. Esto es particularmente importante en la vigilancia serológica. Sin embargo, el uso rutinario de los ensayos FMIA se ve obstaculizado por el paso de acoplamiento manual de perlas, que requiere mucho tiempo y laboriosidad, que requiere el manejo de antígenos individuales por reacción. Este informe presenta un método automatizado para el acoplamiento químico de antígenos a perlas. La automatización permite el acoplamiento simultáneo de hasta 96 antígenos en una sola ejecución, lo que reduce considerablemente el tiempo necesario para el acoplamiento de antígenos de alto rendimiento.

La Figura 1 muestra que los antígenos se unieron con éxito a las perlas. Los resultados también muestran un fuerte paralelismo entre el nuevo protocolo automatizado y el protocolo manual bien establecido (Figura 2), lo que indica una precisión no inferior en la detección de respuestas de IgG a los antígenos evaluados. Los resultados de la variación del lote de acoplamiento de placa a placa (Figura 3) y del cordón (Figura 2) muestran la comparabilidad de los datos cuando se utiliza el método automatizado para el acoplamiento. La alta correlación entre las IMF multiplex y singleplex (Figura 4) muestra que la multiplexación de un alto número de antígenos no afecta la respuesta de anticuerpos al conjunto de antígenos individuales utilizados en este ensayo.

Para la validación del ensayo, se probaron muestras de cohortes endémicas y no endémicas (Figura 5). Si bien los estudios de seroprevalencia de arbovirus aún son escasos en África, los datos disponibles 19,20,21,22 sugieren una imagen matizada con seroprevalencias variables de IgG entre y dentro de los países individuales. En particular, los datos existentes sugieren mayores prevalencias de los tres virus (chikungunya, dengue y Valle del Rift) en Senegal en comparación con Madagascar, por ejemplo19. Estas prevalencias son consistentes con la observación de este informe, que mostró una respuesta clara y distinta a los diferentes antígenos en Senegal en comparación con las otras cohortes. Esto respalda la capacidad del ensayo para distinguir los perfiles de anticuerpos en el contexto de una seroprevalencia relativamente alta. Los datos observados para la cohorte de Madagascar pueden explicarse por la baja prevalencia de los virus en el sitio de recolección de muestras22, mientras que la comparabilidad de los datos con la cohorte no endémica puede explicarse parcialmente por el pequeño tamaño de la muestra de la cohorte francesa. Además, la variabilidad informada entre regiones podría explicar las diferencias observadas en los conjuntos de datos. Es necesario un estudio extenso para evaluar la seroprevalencia de IgG; sin embargo, los datos presentados en este informe muestran que el ensayo desarrollado es específico para detectar respuestas de IgG a los antígenos de arbovirus evaluados, distinguiendo datos de regiones endémicas, así como respuestas matizadas y distintas dentro de la misma población.

Los desafíos técnicos clave incluyeron lograr soluciones de antígenos homogéneas a pesar de su uso en cantidades muy pequeñas, garantizar la representación equimolar de las regiones de las perlas en la premezcla y minimizar la agregación de perlas. Para superar la dificultad de lograr una solución homogénea en la placa de 96 pocillos, se implementó un paso en el que todas las soluciones antigénicas se premezclaron completamente en un tubo de 1,5 ml antes de distribuirse en la placa. Además, se agregó un paso para contar las perlas acopladas y ajustar los volúmenes para garantizar que se agregue un número igual de regiones de perlas a la premezcla. También se incluyó un paso de sonicación para facilitar la mezcla de perlas y minimizar la agregación en la premezcla.

En este estudio limitado, no se evaluó la estabilidad de las perlas acopladas y su impacto en el rendimiento del ensayo, ya que todas las muestras se probaron dentro de un mes del acoplamiento de las perlas. Esta evaluación estaba más allá del alcance de este informe y se evaluará en estudios futuros. A pesar de estas limitaciones, este informe presenta un método rápido y confiable para detectar respuestas de anticuerpos a una variedad de patógenos, incluidos los arbovirus. La vigilancia serológica de las infecciones arbovirales es crucial para controlar las enfermedades, y la disponibilidad de un método rápido y reproducible para detectar las respuestas de anticuerpos a estos virus representa un avance significativo en los esfuerzos mundiales para evaluar las heterogeneidades en la transmisión y orientar las intervenciones para mitigar la carga de estas infecciones. Además, aunque el enfoque de este informe está en los arbovirus, este protocolo es ampliamente aplicable a una amplia gama de antígenos y representa un avance significativo en el campo.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen sinceramente a los participantes del estudio y a los trabajadores de salud comunitarios en cada uno de los sitios del estudio. También agradecemos a todo el personal de laboratorio y de campo por sus esfuerzos dedicados en la recolección de muestras, la adquisición de datos y los análisis de laboratorio. Este trabajo fue apoyado por la subvención Reconstruyendo la intensidad de transmisión de arbovirus en África y el impacto de las intervenciones en un clima cambiante (xSTAR) del Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. Con el propósito de acceso abierto, los autores han aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión de manuscrito aceptado por el autor que surja de esta presentación. También agradecemos a los siguientes por el permiso para usar muestras: Rob Van Der Pluijm (Epidemiología y Análisis de Enfermedades Infecciosas, Institut Pasteur, París) y Maylis Douine y Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayena).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL -Consumibles generales de laboratorio
Unidades de filtro de 1000 mL 0,2 umThermo fisher Scientific567-0020
Depósitos de 25 mL y p...Termociencia95128095
Tubos de 50 mLFalcon-Consumibles generales de laboratorio
96 placas de pozo profundo - KingFisher DWTermociencia10373480
Lavadora automática de platos (opcional)TECANArandela de microplacas HydroFlex Plus
FHA de la tos ferina BAntígeno nativo  BP-FHA-50
Equilibrio-Equipo general de laboratorio
Centrífuga de banco   - Equipo general de laboratorio
Cuentas magnéticas de COOH BioPlex Pro LuminexMC10xxx  (x=región de cuentas)
Albúmina sérica bovina, BSASigmaA7906
Branson Ultrasonics Ultrasonic Limpiador Ultrasónico Bransonic Modelo B200Fisher Scientific15-337-22
BSASigma AldrichA7906
CCHF GPAntígeno nativoREC31639-100
Contador celular/HemacitómetroBiorad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2Antígeno nativoREC31617-100
CHIKV VLPAntígeno nativoCHIKV-VLP-100
Placas inmunológicas no estériles de fondo plano transparentes de 96 pozosTermociencia3455
CMV-partículasAntígeno nativoCMV-HP-100
Contadores de portaobjetos, doble cámara para contador de celdas y nbsp;BioradL003662 A
CP23Antígeno nativoProductor
CT694Antígeno nativoProductor
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPProducción interna-
DENV1 NS1Antígeno nativoDENV1-NS1-100
DENV1 VLPAntígeno nativoDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPProducción interna-
DENV2 NS1Antígeno nativoDENV2-NS1-100
DENV2 VLPAntígeno nativoDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPProducción interna-
DENV3 NS1Antígeno nativoDENV3-NS1-100
DENV3 VLPAntígeno nativoDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + CHASQUIDOProducción interna-
DENV4 NS1Antígeno nativoDENV4-NS1-100
DENV4 VLPAntígeno nativoDENVX4-VLP-100
Tóxica de difteriaAntígeno nativo  DIP-TNL-100
EBV-GP125Antígeno nativoREC31601-100
EDC Sigma03449
Etanol al 100% -Laboratorio general y
Sellado de película de aluminio no estéril -General
Instrumento de imagen por fluorescencia - Sistema MAGPIXLuminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
Imán de mano para placas - Separador magnético de 96 pozosLuminexCN-0269-01
HEV-ORF2Antígeno nativo  REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH -
Peine de punta de 96 pozos Kingfisher DeepWellTermociencia17170069
Leishmania K28ClinicienciasMBS3040095
Kit de calibración Luminex MAGPIXLuminexMPX-CAL-K25
Kit de verificación Luminex MAGPIXLuminexMPX-PVER-K25
Separador de tubos magnéticosInvitrogenDynaMag
MAGPIX Drive Fluid PlusLuminex40-50030
Parque Nacional de SarampiónAntígeno nativoREC31796
Agitador de microplacas  Randox
MICROPLACA, POZO 96, PS, F-FONDO (POZO CHIMENEA)Una de Greiner-Bio655096
MiliQ H20 -Laboratorio general y
Pipetas multicanal 10, 300SARTORIUS
NIEAntígeno nativoProductor
Ogawa OSPBoston_MGH -
ONNV E2ClinicienciasIT-022-006Ep
Instrumento procesador de partículasTermocienciaThermo Scientific KingFisher Flex
PBS 10x PH~7.0EUROMEDEXET330
Anticuerpo secundario IgG Fc antihumano conjugado con PEInvestigación de Jackson Immuno709-116-098
PfAMA1Producción interna-
PfMSP1Antígeno nativoREC32013-100
PGP3Antígeno nativoProductor
Puntas de pipeta (proveedor) 10 y micro; L, 200 & micro; L, 1000 y micro; L -Consumibles generales de laboratorio
Pm MSP1ClinicienciasCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1ClinicienciasCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1Antígeno nativoREC31724-100
R software R4.4.1--
Parque Nacional RVFVAntígeno nativoREC31640-100
Pipetas de canal único 10p, 20p, 200p, 1000pEppendorf
SNAPProducción interna-
S-NHS Sigma56485
Azida de sodioSigmaS2002
Solución de hipoclorito de sodio (lejía) -Lejía doméstica general
Toxina tétanicaAntígeno nativoREC31801-100
Software Thermo Scientific BindIx versión 1.1ThermoFisher Scientific-
TRITÓNTermo CientíficaA16046
Rodillo de tubos y nbsp;IKARodillo 6D -100219627
Preadolescente-20SigmaP7949
USUV EDIII + SNAPProducción interna-
USUV NS1Antígeno nativoUSUV-NS1-100
Vórtice  -Equipo general de laboratorio
VSP3Antígeno nativoProductor
VSP5Antígeno nativoProductor
WNV EDIII + SNAPProducción interna-
WNV NS1Antígeno nativoWNV-NS1-100
Software xPONENTLuminex89-30000-00-759 Rev A mayo-19
YFV EDIII + SNAPProducción interna-
YFV NS1Antígeno nativoYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPProducción interna-
ZIKV NS1Antígeno nativoZIKV-NS1-100
ZIKV VLPAntígeno nativoZIKV-VLP-100

Referencias

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