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Artículo de método

Organoides intestinales humanos con semilla unicelular para investigación de organoides

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DOI:

10.3791/69265

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6 de febrero de 2026

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1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para generar organoides intestinales derivados de pacientes con semilla única, proporcionando cultivos estandarizados que reducen la heterogeneidad y mejoran la reproducibilidad para ensayos posteriores y aplicaciones de medicina de precisión.

Resumen

Los desarrollos recientes en tecnología organoide han permitido la creación de organoides intestinales derivados del paciente (PDIOs) que recapitulan las características estructurales, funcionales, genéticas y epigenéticas de sus tejidos originales. Sin embargo, los organoides convencionales derivados del pasaje inevitablemente producen poblaciones heterogéneas en tamaño y número, lo que conduce a resultados inconsistentes incluso bajo condiciones idénticas. Para abordar esto, se estableció un enfoque estandarizado, denominado aquí "PDIOs de semilla única". En este método, los PDIOs maduros se disociaron enzimáticamente en células individuales y se sembraron en un número definido en pozos individuales de una placa de 96 pozos. Esta siembra controlada normalizó el tamaño y el número de PDIOs. En comparación con los organoides derivados de pasajes, los PDIOs sembrados en células individuales mostraron una menor variabilidad entre pozos en el número de organoides y la variabilidad intra-pozo en tamaños organoides, lo que permite determinar la eficiencia de generación y mejora la reproducibilidad de los ensayos de viabilidad. Además, esta plataforma es compatible con análisis posteriores, incluyendo análisis transcriptómicos y perfilado de expresión proteica. En conjunto, este enfoque puede mejorar la consistencia experimental y proporcionar una base práctica para estudios reproducibles basados en PDIO.

Introducción

El intestino humano es un ecosistema altamente complejo definido por interacciones finamente ajustadas entre la microbiota intestinal, el epitelio intestinal y el sistemainmunitario 1. Estos componentes mantienen la homeostasis intestinal mediante redes de señalización estrechamente reguladas. Por ejemplo, la microbiota intestinal, que comprende más de diez billones de organismos microbianos, interactúa con las células inmunitarias para modular la actividad del sistema inmunitario y mantiene un entorno intestinalequilibrado 2. El epitelio intestinal es fundamental para mediar esta interacción entre microbiota y sistemainmunitario 3,4. Las células madre intestinales (ISCs), el principal motor de la renovación epitelial, se regeneran y diferencian continuamente en tipos celulares especializados, incluyendo linajes celulares secretores (células de Paneth, células calicis, enteroendocrinas y células Tuft), enterocitos absorbentes y microcélulasde pliegues 5,6. Juntas, estas células forman una barrera física vital y una interfaz funcional que protege al huésped frente a estímulos inflamatorios.

En los últimos años, las PDIO se han convertido en una plataforma poderosa en la investigacióntraslacional. Estos cultivos tridimensionales (3D) se crean a partir de ISCs aislados de tejidos de pacientes y mantenidos en una matriz extracelular como la matriz extracelular (ECM), junto con factores de crecimiento definidos que recapitulan el nichoISC 8,9. Cabe destacar que los PDIO conservan las características genéticas y epigenéticas del tejido donante, permitiendo una expansión sostenida y experimentación reproducible. Desde que Sato et al. desarrollaron por primera vez los DIOs a partir deISCs 10 del receptor acoplado a proteínas G ricos en leucina y que contienen repeticiones (Lgr5⁺), estudios posteriores han identificado factores esenciales de crecimiento para la generación y diferenciación de los PDIOs, lo que ha dado lugar a protocolos ampliamente adoptados en laboratorios 11,12,13. Sin embargo, los entornos experimentales utilizados para tratar los PDIO con fármacos candidatos varían considerablemente entre los estudios y a menudo no se describen de forma suficiente 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45, 46, 47. Además, los DIP suelen ser atravesados por interrupciones mecánicas, lo que resulta en heterogeneidad en el tamaño, morfología y disposición espacial de los organoides. Esta variabilidad complica la evaluación precisa de la respuesta a los fármacos y de los mecanismos moleculares subyacentes. Para abordar esta limitación, estudios recientes han desarrollado PDIOs derivados de células individuales en suspensión de célulasindividuales o separadas clasificadas 45,48,49,50,51,52,53,54.

En este artículo, como uno de los métodos complementarios y prácticos, se introducen los "PDIOs con semilla única" para generar PDIs estandarizados a partir de una suspensión de célula única utilizando ECM y medios convencionales, permitiendo ensayos precisos y reproducibles. En resumen, las células individuales aisladas de los PDIOs maduros se incrustaron en ECM a densidades celulares definidas, y los cultivos resultantes se monitorizaron durante 2 semanas mientras se cuantificaban número, tamaño y morfología. Dado que cada cúpula de ECM está embebida con una entrada celular conocida, el recuento de organoides por pozo es consistente, lo que permite calcular la eficiencia de generación como una lectura de la capacidad regenerativa en cada líneaorganoide 49,54. Aunque el Matrigel en forma de cúpula produce heterogeneidad de tamaño debido al gradiente espacial de concentración de Wnt3a derivado de su inestabilidad inherente y su difusión limitada55, la variabilidad de tamaño entre pozos en los PDIOs semillados por célula única es notablemente menor que en organoides derivados depasajes 49,54. Sin embargo, este enfoque sigue teniendo limitaciones prácticas. Sin la clasificación celular activada por fluorescencia, algunos organoides pueden generarse a partir de dobletes o tripletes, lo que resulta en una heterogeneidad biológica intrínseca dentro de los PDIOs. Además, el número óptimo de células individuales debe determinarse empíricamente para cada línea organoide debido a las variadas eficiencias de generación. Finalmente, se sometieron a análisis posteriores de PDIO totalmente diferenciados con semilla unicelular que incluyeron PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR), Western blot e inmunohistoquímica.

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Protocolo

Todos los materiales y reactivos necesarios para el experimento están listados en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos y materiales

  1. Precalentar la placa de cultivo organoide en una incubadora a 37 °C durante más de 90 minutos.
    NOTA: Precalentar la placa de cultivo ayudará a solidificar el ECM y mantener la forma de la cúpula. 90 min es el tiempo mínimo requerido para la polimerización de ECM. Se recomienda encarecidamente precalentar la placa durante más de 12 horas.
  2. Utilice medio de cultivo organoide (EXP) suplementado con penicilina-estreptomicina (PS) al 0,5% como medio de cultivo organoide.
  3. Para la diferenciación de PDIOs semilladas en células individuales, se utiliza un medio de diferenciación (DIF) compuesto por un medio basal suplementado con factores de crecimiento (Tabla 1). El medio basal consiste en DMEM/F12 avanzado suplementado con 0,5 % de PS, 0,25 % sulfato de gentamicina y 1 % de glutamina, junto con los siguientes factores de crecimiento: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), factor de crecimiento epidérmico (EGF; 50 ng/mL), N-acetil-L-cisteína (1 mM), [Leu15]-gastrina I humana (10 nM), A 83-01 (500 nM), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-I; 200 ng/mL), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF; 100 ng/mL) y suplemento de B-27 (1x) (Tabla 1).
    NOTA: La PS y la gentamicina son biopeligrosas y deben tratarse con guantes y protección ocular.
  4. Prepara con calma la solución de recuperación celular (CRS), el tampón de lavado (DMEM con glucosa alta al 1% de BSA), 1 mM Y-27632, EXP y DIF, y déjalo en hielo hasta el uso.
    NOTA: Deja que EXP y DIF se equilibren a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos antes de añadirlos a placas de cultivo precalentadas.
  5. Descongela el ECM en hielo y asegúrate de que siempre se mantenga frío.
    NOTA: La ECM requiere descongelarse sobre hielo y debe mantenerse siempre fría para evitar la polimerización prematura.
  6. Equilibra el reactivo enzimático de disociación a temperatura ambiente. Precalienta el reactivo en un baño maria a 37 °C antes de aplicarlo.
    NOTA: El reactivo enzimático de disociación es un irritante y debe tratarse con el equipo de protección personal adecuado.

2. Descongelación y recuperación de PDIOs criopreservados

  1. Recupera el tubo criovial que contiene organoides del tanque de nitrógeno líquido. Afloja un poco la tapa del tubo y descongélalo en un baño de maria a 37 °C durante 60-90 segundos.
    NOTA: Transfiere inmediatamente el tubo al hielo tras descongelarlo.
  2. Prehumedece una punta de pipeta de ánima ancha con buffer de lavado y transfiere los organoides desde el tubo criovial a un tubo de 50 mL.
  3. Enjuaga el cryovial con 1 mL de tampón de lavado y transfiere el resto al tubo de 50 mL. Repite este paso de enjuague dos veces.
  4. Centrifugar a 290 × g durante 7 minutos a 4 °C. Asegúrate de que se forme un pellet visible en la parte inferior del tubo.
  5. Aspira el sobrenadante.
  6. Resuspende en ECM usando una punta de pipeta pre-humedecida de gran diámetro.
  7. Pone el ECM en una placa de 24 pozos precalentada e incuba a 37 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Utiliza 30 μL de ECM por pozo.
  8. Añade EXP y rodea los pozos con solución fisiológica estéril 1x tamponada con fosfato (PBS) o agua destilada.
    NOTA: Utiliza 500 μL de EXP por pozo. El cultivo en EXP se complementó con 10 μM Y-27632 durante los primeros 3 días, luego cambió a EXP sin Y-27632.

3. Paso de PDIOs

  1. Aspira la EXP gastada.
  2. Prehumedece una punta de pipeta de gran diámetro con un tampón de lavado, añade 1 mL de reactivo de disociación celular para desprender la ECM y transfiere el contenido a un tubo de 15 mL.
  3. Incuba el tubo en una balancín durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar a 300 × g durante 7 minutos a 4 °C.
  5. Decanta el sobrenadante y añade 1 mL de buffer de lavado. Vuelve a suspender 20 veces.
  6. Añade otro 1 mL de tampón de lavado, vuelve a suspender 20 veces y transfiere a un tubo de 50 mL.
  7. Centrifugar a 300 × g durante 7 minutos a 4 °C.
  8. Aspira el sobrenadante.
  9. Resuspende en ECM usando una punta de pipeta pre-humedecida de gran diámetro.
  10. Pone el ECM en una placa de 24 pozos precalentada e incuba a 37 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Utiliza 30 μL de ECM por pozo.
  11. Añade EXP y rodea los pozos con agua estéril de PBS 1x o destilada.
    NOTA: Utiliza 500 μL de EXP por pozo. El cultivo en EXP se complementó con 10 μM Y-27632 durante los primeros 3 días, luego cambió a EXP sin Y-27632.

4. Cultivo PDIO con semilla única

  1. Aspira la EXP gastada.
    NOTA: Los residuos que contienen antibióticos (por ejemplo, medios usados con PS o gentamicina) deben ser autoclavados antes de su eliminación.
  2. Lava con 1 mL de PBS estéril 1x.
  3. Prehumedece una punta de pipeta de gran calibre con buffer de lavado, añade 300 μL de CRS para desacoplar la ECM y transfiere el contenido a un tubo de 50 mL.
  4. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C (Figura 1A).
  5. Aspira el sobrenadante, añade 3 mL de buffer de lavado y vuelve a suspender 20 veces.
    NOTA: Este paso interrumpe mecánicamente los organoides.
  6. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C (Figura 1B).
  7. Aspira el sobrenadante y añade 5 mL de reactivo enzimático de disociación precalentado que contenga 10 μM Y-27632. Haz un giro 2-3 veces y incuba en baño maria a 37 °C durante 20 minutos, agitando el tubo cada 5 minutos.
    NOTA: Los agregados de restos suelen aparecer en un plazo de 10 minutos tras la incubación. Limita el tratamiento total del reactivo enzimático de disociación a menos de 20 minutos. No excedas los 25 minutos, ya que la sobredigestión compromete notablemente el rendimiento y la viabilidad de las células individuales.
  8. Añade 10 mL de glucosa alta DMEM.
  9. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C (Figura 1C).
  10. Aspira el sobrenadante y añade 1 mL de tampón de lavado. Vuelve a suspender 20 veces.
    NOTA: Los residuos que contienen reactivos enzimáticos de disociación deben recogerse por separado e inactivarse con lejía al 0,5-1% durante al menos 30 minutos antes de su eliminación según las directrices de bioseguridad institucional.
  11. Filtra a través de un colador de celda de 40 μm hasta un nuevo tubo de 50 mL (Figura 1D).
    NOTA: Este paso es fundamental para aislar células individuales de los organoides maduros. Se debe usar un colador de celda de 40 μm para aislar células individuales.
  12. Cuenta las células usando el azul de tripán. Transfiere el volumen calculado a un tubo de 1,5 mL.
    NOTA: Placar 3.000-4.000 celdas por pozo en una placa precalentada de 96 pozos.
  13. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C (Figura 1E).
  14. Quita el sobrenadante usando una pipeta.
  15. Resuspende las células en ECM (100-500 celdas/μL) usando una punta de pipeta prehumedecida de gran diámetro.
  16. Ponle puntos de ECM en una placa precalentada de 96 pozos e incuba a 37 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Utiliza 10 μL de ECM por pozo.
  17. Añade DIF a los pozos. Rodead los pozos con agua estéril 1x PBS o destilada.
    NOTA: Utiliza 150 μL de DIF por pozo. El cultivo en DIF se complementó con 10 μM Y-27632 durante 3 días, luego cambió a DIF sin Y-27632. Cambia el medio cada 3 días y mantén el mantenimiento durante un total de 10 días.

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Resultados

Para generar PDIO con semilla unicelular, se recogieron biopsias por pinzado mucoso del íleon terminal y del colon ascendente de sujetos sanos consentidores durante una colonoscopia de vigilancia utilizando pinzas estándar de biopsia de 2,8 mm, bajo la Junta de Revisión Institucional de la Escuela de Medicina Grossman de NYU (Perfil Inmunitario Mucosal en Pacientes con Enfermedad Inflamatoria Intestinal; S12-01137). Luego, se generaron PDIOs semilladas en una sola célula disociando 6.000...

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Discusión

Las PDIO tienen un enorme potencial para la modelización precisa de enfermedades, el cribado de fármacos y la medicina regenerativa, ya que preservan fielmente el paisaje genético y epigenético de cada paciente. Sin embargo, sus aplicaciones prácticas suelen verse obstaculizadas por dificultades en la estandarización de la generación y caracterización de organoides. Para superar estos desafíos, se ha introducido en estudios recientes un enfoque utilizando PDIOs derivados de suspensión un...

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Divulgaciones

Jordan E. Axelrad ha recibido becas de investigación de BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen y Takeda; honorarios de consultoría, honorarios o honorarios del consejo asesor de AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda y Vedanta. K.C. es inventor de la patente estadounidense 10.722.600 y de las patentes provisionales 62/935.035 y 63/157.225.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970 y RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang); una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI) financiada por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang); DK093668 de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (Ken Cadwell); K23DK124570 (Jordan E. Axelrad); Fundación Crohn y Colitis (Jordan E. Axelrad). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[Leu15]-Gastrin I humanoSigma-AldrichG91450-0,1 mg
Tubo cónico de 15 mLSPL50015
PBS 20X, pH 7,4BiosesangP2007-7.4
Tubo cónico de 50 mLSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
DMEM/F-12 avanzadoGibco12634010
Axygen 1000 y micro; Puntas de la corneta en L, de ánima ancha, transparente, no estérilesAxygenT-1005-WB-C
Axygen 200 y micro; Puntas de la corneta en L, de ánima ancha, transparente, no estérilesAxygenT-205-WB-C
Suplemento de B-27 (50X) sin sueroGibco17504044
Albúmina sérica bovinaRoche10735078001
Microplacas de poliestireno transparente de 96 pozos de CorningCorning3599
Solución de recuperación de células de CorningCorning354253
Matriz ECM de Corning (Matriz de Corning) & nbsp;Corning356231
Placas múltiples de pozo Costar transparente de 24 pozos tratados con TCCorning3526
DMEM con glucosa alta con glutamina estable y piruvato de sodioBiowestL0103-500
GentamicinaGibco15750060
Reactivo de disociación celular suaveStemcell100-0485
Proteína recombinante humana FGF-básica (FGF-2/bFGF) (154 aa)Gibco100-18B-100UG
IGF-I humano, proteína recombinante libre de animalesGibcoAF-100-11-500UG
Proteína de Noggin HumanaAcrobiosistemaNO H5219-1mg
Proteína humana R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146)AcrobiosistemaRS6-H4220-1mg
Medio de crecimiento organoide IntestiCult (Humano)Stemcell6010
L-glutamina 100XBiowestX0550-100
Proteína recombinante EGF de ratónGibco315-09-100UG
N-acetil-L-cisteínaSigma-AldrichA9165-5 g
Solución de penicilina-estreptomicina 100XBiowestl0022-100
Sustituto humano recombinante Wnt3aAcrobiosistemaWNE-W5253-50ug
TriplLE (reactivo enzimático de disociación) expresa enzima (1X), sin fenol rojo y nbsp;Gibco12604013
Y-27632 dihidrocloruroTocris1254-10MG

Referencias

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