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Artículo de método

Evaluación de la dinámica de fisión/fusión mitocondrial en células tubulares proximales renales

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DOI:

10.3791/69268

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14 de noviembre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe el uso de microscopía confocal e ImageJ para evaluar la dinámica de fisión/fusión mitocondrial a través de la fluorescencia de fotoconmutación Dendra2.

Resumen

Las mitocondrias son mejor reconocidas por su papel en la síntesis de ATP y sirven como reguladores clave del metabolismo celular. La dinámica mitocondrial comprende el movimiento intracelular e intercelular de las mitocondrias, así como los procesos de fisión/fusión. Estos eventos son fundamentales para mantener la función mitocondrial al mantener la homeostasis celular, la morfología, la bioenergética, el control de calidad y las respuestas al estrés. Por otro lado, la desregulación de la dinámica mitocondrial afecta la morfología y función celular. La medición precisa de los eventos de fisión/fusión de las mitocondrias puede ser indicativa de la salud celular. Las metodologías actuales para medir la dinámica de las mitocondrias emplean imágenes avanzadas como microscopía de superresolución, técnicas de fluorescencia (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) para la conectividad y herramientas optogenéticas para el control espaciotemporal. El análisis cuantitativo utiliza herramientas computacionales para medir parámetros como la longitud, el número y la ramificación, que indican el equilibrio de fisión/fusión. Sin embargo, estos métodos requieren habilidades e instrumentos sofisticados. En este artículo, describimos el uso de microscopía confocal combinada con herramientas de uso gratuito en ImageJ (Fiji) para estudiar eventos de fisión / fusión utilizando la propiedad de foto-cambio de la proteína dendra2, etiquetada con citocromo c mitocondrial.

Introducción

Las mitocondrias son un orgánulo dinámico que desempeña un papel vital en la producción de energía, la muerte celular y la transducción de señales1. La morfología mitocondrial se refiere al tamaño y la forma de los compartimentos mitocondriales, que responden en gran medida a las condiciones intracelulares y extracelulares y son cruciales para mantener la salud celular2. La morfología de las mitocondrias puede proporcionar información clave sobre su función, sin embargo, las alteraciones en la forma mitocondrial pueden afectar el metabolismo celular y la salud en general3. Las alteraciones de la morfología mitocondrial están asociadas con varias enfermedades, incluidos los trastornos neurodegenerativos, el cáncer y las enfermedades metabólicas4. La morfología mitocondrial está regulada dinámicamente por eventos de fusión y fisión/fusión, que son cruciales para mantener la homeostasis celular y responder a diversos requisitos metabólicos 5,6.

La dinámica mitocondrial ayuda al orgánulo a responder a diferentes factores estresantes y requisitos metabólicos7. Implica fisión/fusión continua y movimiento de mitocondrias dentro de las células o entre células. Las mitocondrias se adaptan a las demandas de energía celular a través de cambios en la morfología a través de eventos de fisión/fusión8. Estos procesos determinan la forma mitocondrial e influyen en las funciones mitocondriales, como la producción de energía, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el control de calidad mitocondrial 7,9,10. Además, la fisión/fusión mitocondrial son mecanismos de contrapeso que mantienen una red mitocondrial funcional11. La fusión permite el intercambio de contenidos mitocondriales, promoviendo la complementación y la amortiguación contra el daño local, mientras que la fisión permite la segregación y eliminación de mitocondrias dañadas a través de la mitofagia 7,12. Además, la fisión ayuda a segregar los componentes dañados de las mitocondrias, que luego son eliminados por la mitofagia, un proceso de autofagia selectiva13. La fusión, por otro lado, permite la complementación de los contenidos mitocondriales, diluyendo los componentes dañados14. Los actores clave en la fisión/fusión mitocondrial son las mitofusinas (MFN1/2), esenciales para la fusión de la membrana mitocondrial externa 15,16, (OPA1): esta GTPasa similar a la dinamina es responsable de la fusión de la membrana mitocondrial interna16. Las proteínas de fisión involucran la proteína 1 relacionada con la dinamina (Drp1), la proteína profisión 13,17. Proteína de fisión mitocondrial 1 (Fis1), factor de fisión mitocondrial (Mff) y regulador de fisión mitocondrial similar a 1 (MTFR1L). Se han utilizado varias técnicas, como la EM de superresolución, para estudiar la ultraestructura mitocondrial18. La hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) combinada con microscopía de superresolución STED y MINFLUX (nanoscopía) se ha utilizado para visualizar el ARNm mitocondrial individual y las proteínas asociadas18. Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) rastrean los cambios en el espaciado de la membrana19. La microscopía de superresolución de microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) permite el estudio de complejos de membranas internas mitocondriales20. Sin embargo, el uso de este equipo avanzado no es fácilmente accesible. La microscopía confocal es accesible y requiere menos experiencia. Además, el desarrollo de proteínas fluorescentes dirigidas a las mitocondrias ha avanzado significativamente en el estudio de la dinámica mitocondrial en células vivas21, ya que estamos utilizando proteína fluorescente verde (GFP) fotoactivable para visualizar y cuantificar la fusión mitocondrial22.

Para estudiar la fisión y fusión mitocondrial, las células se estresan o se exponen a fármacos como el cisplatino, que se une al ADN e induce daño en el ADN, culminando en la apoptosis mediada por mitocondrias23. En este estudio, hemos utilizado mitocondrias Dendra2 marcadas con fotoconmutables de ratones mitocondriales fotoactivables para estudiar los eventos de fisión y fusión en células tubulares renales tratadas con cisplatino, ya que son ricas en mitocondrias y tienen una alta capacidad de regeneración. Sin embargo, este protocolo se puede utilizar en cualquier tipo de célula que tenga mitocondrias Dendra2 marcadas con fotoconmutables (Figura 1A-C).

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Protocolo

Todo el trabajo con animales se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple, Universidad de Temple (Protocolo Animal-5183). Se compraron los ratones Pham, que tienen mitocondrias que expresan la proteína Dendra2.

1. Preparación del medio de cultivo celular

  1. Aísle las células tubulares proximales renales de acuerdo con el protocolo después de separarlas de las células endoteliales glomerulares usando perlas24 (Figura 1A). Bouchareb et al., desarrollaron un método para aislar y cultivar células endoteliales glomerulares (GEC) de los riñones de ratones transgénicos que expresan mitocondrias fluorescentes (mito-Dendra2) utilizando perlas magnéticas. Después del aislamiento de GEC, los túbulos que quedan en el pellet se aíslan y cultivan.
  2. Cultivar células tubulares proximales renales en una placa de 10 cm con 10 ml de DMF-12 suplementado con 5% de FBS (inactivado por calor), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Cultive túbulos durante 2-3 días hasta que migren fuera de los túbulos.
  3. Seleccione las células tubulares por morfología después de morir de hambre (con DMF-12 sin FBS) durante 2 días.
    NOTA: Para los experimentos, use un disco con 50-70% de células confluentes. Cuente las células con un hemocitómetro antes de sembrar.
  4. Células de siembra para experimentos: Sembrar las células en placas de cultivo con fondo de vidrio a una densidad de 1-5 × 105 células por pocillo, dependiendo de los requisitos experimentales. Deje que las células se adhieran y crezcan durante la noche antes de la adición de cisplatino.
    NOTA: El cisplatino es un medicamento de quimioterapia peligroso, es crucial seguir los protocolos de seguridad para proteger al personal y al medio ambiente. Para este propósito, siga las instrucciones de la cabina de seguridad biológica de clase II, el equipo de protección personal (EPP), la descontaminación, el control de derrames y la eliminación de desechos (desechos de medicamentos peligrosos-quimioterapia): use guantes dobles, gafas, descontamine la superficie de trabajo y mantenga el kit contra derrames cerca de la estación de trabajo, etiquete claramente el contenedor de desechos. Para DMSO, use EPP, trabaje en una campana extractora y siga los procedimientos de descontaminación y eliminación de derrames.

2. Inducción del estrés con cisplatino

  1. Preparación del medio cisplatino
    1. Prepare una solución madre de 50 mM de cisplatino disolviéndola en DMSO.
    2. Coloque1-5 x 10 6 células tubulares proximales en la placa de cultivo con fondo de vidrio, agregue 2 ml de medio DMF-12.
      NOTA: Se puede utilizar cualquier disco de cultivo con fondo de vidrio.
    3. Agregue cisplatino a una concentración final de 2 μM a la placa experimental, para tener 0.004% como concentración final de DMSO.
      NOTA: Prepare 2 μL de cisplatino 50 mM diluido en 1.998 μL de medio DMF-12 libre de FBS y agregue 80 μL a la placa experimental.
    4. Incubar las células durante 24 h.

3. Imágenes

  1. Uso del microscopio confocal
    1. Configure los láseres a 405 nm (fotoconversión Dendra2), 488 nm (excitación Dendra2 no convertida) y 561 nm (Dendra2 fotoconvertido, Alexa 594).
    2. Encienda los láseres y deje tiempo para la estabilización (~ 10 min)
  2. Estudio de eventos de fisión y fusión
    1. Configure los láseres a 405 nm (fotoconversión Dendra2), 488 nm (excitación Dendra2 no convertida) y 561 nm (Dendra2 fotoconvertido, Alexa 594).
    2. Coloque el disco de cultivo en la cámara de incubación.
    3. Agregue agua alrededor de la cámara y ajuste la temperatura a 37 ° C. El suministro deCO2 debe mantenerse.
    4. Deje que la cámara de incubación se equilibre. El cambio de temperatura estresará las células.
    5. Visualice las células utilizando un mayor aumento y resolución para imágenes mitocondriales.
    6. Abra el menú desplegable en la esquina superior izquierda y seleccione las opciones de FRAP (Figura 2A-D).
    7. Defina la región de interés (ROI) utilizando el software LAS X, donde se realizará el fotoblanqueo.
      NOTA: La región de interés se puede dibujar en cualquier tamaño, lo que no afecta los resultados, ya que se analizan las mitocondrias individuales.
    8. Adquiera una serie de imágenes previas a la decoloración a baja intensidad láser para establecer la intensidad de fluorescencia de referencia. Setlasersto405nmlongitud de onda para fotoconmutación (0.00), 48 nm (0.20) y 56 nm (0.20), asegurando que las celdas estén enfocadas.
      NOTA: Los valores entre paréntesis que siguen a las longitudes de onda del láser indican intensidades de láser que se pueden establecer en cualquier valor, ya que esto no afecta al fotoblanqueo.
    9. Para fotoblanquear las células, aplique un pulso láser de alta intensidad para blanquear en el ROI. Ajuste los láseres FRAP a 405 nm (4,00), 488 nm (0,00) y 561 nm (0,00). Establezca el preblanqueo en 5.140 s durante 59 iteraciones y el postblanqueo en el momento deseado (Figura 2B) (la intensidad del láser previo y posterior al blanqueo se menciona entre paréntesis).
    10. Para obtener imágenes posteriores a la lejía, continúe adquiriendo imágenes a baja intensidad láser para observar la recuperación de la fluorescencia durante 10 minutos. Mantenga los láseres FRAP a 405 nm (0,00), 488 nm (0,50) y 561 nm (0,50).
      NOTA: El tiempo de blanqueamiento puede diferir según los tipos de células, en nuestras manos, se utilizaron tiempos de blanqueo similares para las mitocondrias en las células tubulares y las células intersticiales de la válvula (VIC). Una vez concluido el FRAP, se pueden realizar las imágenes o imágenes de células vivas (Figura 3 y Video Complementario 1), además de adquirir las imágenes post-blanqueo.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Dado que las mitocondrias están marcadas con la proteína Dendra2, al someterse a fotoblanqueo, un cambio conformacional irreversible en la proteína dendra2 conduce a un aumento en la fluorescencia roja detectada a través del láser de 561 nm. Cuando las mitocondrias rojas se fusionan con las mitocondrias verdes sin blanquear, la combinación da un color amarillo. Aprovechando este fenómeno, se pueden medir los eventos dinámicos de fisión/fusión.

  1. Perfilar las mitocondrias rojas y verdes fusionadas
    1. Instale el complemento RGB profiler para perfilar la señal roja y verde en toda la selección.
      NOTA: Siga las instrucciones del sitio web para agregar el complemento a la sección Fiji.
    2. Abra ImageJ (Figura 4A).
    3. En el menú Archivo , busque y abra el archivo que desea analizar (Figura 4B).
    4. Seleccione la composición del modo de color, marque la opción de escala automática y abra el video para analizar (Figura 4C).
    5. Seleccione un área rectangular para analizar (Figura 4D).
    6. Pase el cursor cerca del área del rectángulo seleccionada, haga clic con el botón derecho y seleccione duplicar (Figura 4E).
    7. Seleccione la opción de hiperpila duplicada , que duplica todas las pilas de imágenes (Figura 4F).
    8. Para convertir la pila duplicada a formato RGB, seleccione la imagen y seleccione la opción RGB en el menú desplegable de imágenes (Figura 4G-H).
    9. La imagen RGB se duplica, seleccionando solo un fotograma (Figura 4I).
    10. Si las mitocondrias de la imagen son curvas, dibuje una línea a lo largo de su longitud. Luego, vaya al menú Editar , elija Selección y haga clic en Enderezar (Figura 5A).
    11. Elija un título para la imagen y establezca el ancho de línea en 20 píxeles (Figura 5B).
    12. Después de enderezar las mitocondrias, dibuje una línea a lo largo de las mitocondrias de interés para asegurarse de que esté alineada con una línea recta (Figura 5C).
    13. Abra el complemento RGB Profiler (Figura 5D).
    14. Una vez activado, el complemento generará un gráfico que muestra las intensidades de fluorescencia roja y verde a lo largo de la línea dibujada. La altura de cada pico es directamente proporcional a la intensidad de la fluorescencia (Figura 5E).
      NOTA: La morfología mitocondrial también se puede calcular utilizando el complemento del analizador de mitocondrias25. Seleccione las regiones utilizadas para la exposición, analice el umbral en las regiones seleccionadas y, a continuación, mida la morfología de las mitocondrias y el análisis 2D. Se puede seleccionar el perímetro del área y otros parámetros.

5. Analizar eventos de fusión

  1. Establecer la línea de base previa a la fusión: Antes de la fusión mitocondrial, confirme que la fluorescencia roja (561 nm) se localiza en una mitocondria y la fluorescencia verde (488 nm) en una adyacente. El gráfico de intensidad correspondiente debe mostrar dos picos distintos, uno rojo y otro verde, con una superposición mínima.
  2. Confirmar evento posterior a la fusión: después de la fusión, la señal roja (que representa el contenido de la matriz Dendra2) debería extenderse a la mitocondria verde adyacente, lo que indica la mezcla de contenido. El gráfico de intensidad ahora mostrará picos rojos y verdes superpuestos, lo que confirma un evento de fusión.
  3. La evaluación de los eventos de fusión se puede determinar seleccionando cuidadosamente las mitocondrias sanas y las mitocondrias fotoblanqueadas para la fusión en las imágenes de células vivas. Un cambio en la proporción de rojo / verde a lo largo del tiempo indicaría el evento de fusión.

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Resultados

Las células epiteliales tubulares primarias se aislaron del riñón de ratón mediante digestión enzimática y se cultivaron en DMF-12 suplementado con 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C bajo 5% de CO2. Al alcanzar el 80% de confluencia, las células se tripsinizaron (tripsina-EDTA al 0,25%) y se sembraron a una densidad de 5 × 104 células por pocillo en placas de cultivo con fondo de vidrio, previamente recubiertas con colágeno.

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Discusión

La fisión/fusión mitocondrial son procesos dinámicos cruciales que mantienen la homeostasis mitocondrial y la viabilidad celular26. La evaluación adecuada de estos procesos requiere técnicas avanzadas de imagen para visualizar y cuantificar la morfología, la dinámica y la función mitocondrial27,28. Se han utilizado varias técnicas para medir la fisión/fusión mitocondrial. Algunas de las herramientas sofist...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de investigación del Instituto Nacional de Salud número de subvención 5R01DK135470-03, subvención ISAC-NIH 5U24DK128851-03 y beca postdoctoral de la Asociación Estadounidense del Corazón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cultivo celular 
DMEM/F12 Medio basal  (Gibco/Cat. Nº 11320033 ) Cultivo celular tubular proximal  
Suero fetal bovino (FBS) y nbsp;5-10% de suplementación y nbsp;(Biowest/Cat. Nº S181B) y nbsp;Enriquecimiento de medios culturales  
Penicilina-Estreptomicina 100X (Gibco/Cat. Nº 15140122) y nbsp;Protección antibiótica y nbsp;
Colágeno IV recubrimiento (Sigma-C5533-5M) Recubrimiento de placas Ibidi & nbsp;
Tripsina-EDTA 0,25% solución  (Gibco/Cat. Nº 25200056) y nbsp;Destacamento de celdas 
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) y nbsp;(Gibco/Cat. Nº 10010023 y nbsp;Lavado de celdas 
Tratamientos 
Cisplatino 2 & micro; M concentración de trabajo  (Selleck Chemicals/Cat. Nº S1166) y nbsp;Inducción de estrés   
Dimetil Sulfóxido (DMSO) Control de vehículos  (Fisher Scientific/Cat. Nº D1391) y nbsp;Control de disolventes de cisplatino  
Imagens 
Medio rojo libre de fenol  Imágenes en directo  (Gibco/Cat. Nº 21041025) y nbsp;Fluorescencia de fondo reducida  
Biología Molecular  
TRIzol®  Extracción de ARN y nbsp;(Gibco/Cat. Nº 15596018) y nbsp;Aislamiento total de ARN y nbsp;
SYBR Green Master Mix  qPCR química  (Thermo Scientific/Cat. Nº K0221) y nbsp;Expresión génica de dinámica mitocondrial (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) y nbsp;
Herramientas fluorescentes y nbsp;
Dendra2 Etiqueta de matriz mitocondrial  Laboratorio Jacson (PhAMeliminado) Reportero fotoconmutable (conversión de 405 nm, imagen de 488/561 nm) y nbsp;
microscopios 
Microscopio Confocal  Leica DMi8 Imagen de células vivas y FRAP láseres de 405nm/488nm/561nm 
Imagen J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
Plugin de perfilador RGB https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. Análisis de eventos de fusión (solapamiento de señales rojas/verdes) & nbsp;

Referencias

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