Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

La endocitosis de receptores y otras proteínas transmembrana (TM) desde la membrana plasmática hasta varios compartimentos intracelulares es importante para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana ^1,2. Después de la internalización por endocitosis dependiente o independiente de clatrina, las cargas de proteínas primero pueblan los endosomas tempranos desde donde se clasifican a lo largo del sistema endolisosomal, se reciclan a la membrana plasmática o se envían retrógradamente a la red trans-Golgi (TGN)^3,4,5. El reciclaje de los endosomas y/o la superficie celular al TGN es parte del ciclo funcional de una serie de receptores de carga transmembrana, como los receptores de manosa-6-fosfato dependientes de cationes e independientes de cationes (CDMPR y CIMPR), que entregan hidrolasas lisosomales recién sintetizadas desde el TGN a endosomas y lisosomas tardíos ^6,7,8, Wntless (WLS) transporta ligandos Wnt a la superficie celular^9, 10,11,12 o TGN46 que escolta las proteínas de carga secretora solubles, incluido el factor pancreático regulado al alza (PAUF) y otra carga CARTS, del TGN 13,14,15,16. Mientras que todos estos receptores de carga viajan a través del TGN para la recolección de nuevas proteínas cliente, el receptor de transferrina (TfR) que internaliza la transferrina unida al hierro se excluye del retorno de Golgi 17,18,19,20,21.

Para investigar el tráfico endocítico y retrógrado, establecimos previamente un conjunto de herramientas basado en nanocuerpos diseñado para etiquetar y rastrear proteínas de carga desde la superficie celular hasta los compartimentos intracelulares¹⁷. Los nanocuerpos constituyen una nueva clase de aglutinantes proteicos derivados de anticuerpos homodiméricos de cadena pesada (hcAbs) que se encuentran naturalmente en camélidos y peces cartilaginosos ^22,23. Representan el dominio variable de cadena pesada (VHH) de los hcAbs y ofrecen numerosas ventajas sobre los anticuerpos convencionales (por ejemplo, IgG): son monoméricos, pequeños (~15 kDa), altamente solubles, carecen de enlaces disulfuro, pueden expresarse bacterianamente y son susceptibles de selección para una unión de alta afinidad²⁴. Para mejorar la versatilidad y la amplia aplicabilidad de este conjunto de herramientas de nanocuerpos, empleamos nanocuerpos anti-GFP funcionalizados para etiquetar la superficie y rastrear proteínas marcadas con etiquetas GFP en sus dominios extracelulares o lumenales. A través de la conjugación recombinante de nanocuerpos con mCherry, ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) o secuencias de sulfatación de tirosina, el tráfico retrógrado de proteínas de carga transmembrana de buena fe se puede analizar mediante microscopía de fluorescencia fija y de células vivas, microscopía electrónica o ensayos bioquímicos mediante autorradiografía. Dado que la sulfatación de tirosina, catalizada por las tirosilproteína sulfotransferasas TPST1 y TPST2, es una modificación postraduccional confinada al trans-Golgi / TGN, esta estrategia permite la evaluación directa de la dinámica y la cinética de transporte desde la superficie celular hasta el compartimento de Golgi 25,26,27. Más recientemente, hemos ampliado este repertorio de aglutinantes de proteínas funcionalizados para incluir nanocuerpos anti-mCherry derivatizados. Estos reactivos han demostrado ser fundamentales para diseccionar las vías de transporte dependientes de la maquinaria de los MPR, particularmente del CDMPR^17,28, al TGN a través de análisis bioquímicos.

Mientras que el estudio anterior se centró principalmente en la aplicación de nanocuerpos modificados con secuencias de sulfatación de tirosina para evaluar bioquímicamente la llegada de TGN por autorradiografía¹⁹, este artículo de métodos describe la generación de nanocuerpos funcionalizados marcados con fluorescencia (VHH-mCherry) y líneas celulares reporteras para la obtención de imágenes de células vivas del tráfico endocítico. En combinación con una proteína indicadora fluorescente residente de Golgi adicional, este protocolo se puede adaptar aún más para servir como un flujo de trabajo sólido para analizar cuantitativamente imágenes de células vivas del transporte de endosomas a TGN de proteínas de carga seleccionadas.

Antes de aplicar este protocolo, los investigadores deben asegurarse de que la proteína diana se exprese como una construcción de fusión marcada con GFP, generalmente generada por enfoques de clonación molecular estándar. Los nanocuerpos funcionalizados se pueden producir fácilmente en bacterias con rendimientos suficientes para experimentos de etiquetado de superficies, con concentraciones de trabajo en el rango nanomolar bajo que son adecuadas para la mayoría de los ensayos de imágenes de células vivas. Los usuarios también deben tener en cuenta que la cinética de transporte puede variar entre las proteínas de carga, lo que requiere un ajuste de la duración del etiquetado o la frecuencia de las imágenes para una visualización óptima del tráfico endocítico o endosómico a TGN.

1. Transformación bacteriana con VHH-mCherry

NOTA: Este protocolo se ha optimizado para la expresión, purificación y análisis de nanocuerpos anti-GFP funcionalizados como se describió anteriormente¹⁷. Los siguientes pasos están adaptados para VHH-mCherry y son consistentes con el informe metodológico anterior¹⁹.

1. Descongele las bacterias quimiocompetentes (50-100 μL) adecuadas para la expresión de proteínas (por ejemplo, células de Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) colocándolas en hielo.
   NOTA: Prepare células bacterianas quimiocompetentes siguiendo los protocolos estándar de laboratorio. Para ello se pueden emplear células BL21 (DE3) disponibles en el mercado de NEB.
2. Agregue 50 ng de un plásmido que codifique la construcción VHH-mCherry funcionalizada (Addgene # 109421). Para garantizar una biotinilación eficiente específica del sitio del reportero de nanocuerpo durante la expresión bacteriana, co-transforme con un exceso de tres veces (150 ng) de un plásmido que codifica la biotina ligasa bacteriana BirA (Addgene # 109424). Mueva suavemente el tubo 4x-5x para mezclar células y ADN plasmídico.
   NOTA: La cotransformación con el plásmido que codifica BirA no es necesaria si no se requiere biotinilación por el péptido aceptor de biotina (BAP).
3. Incuba la mezcla en hielo durante 30 min. Evite la agitación durante este paso.
4. Aplique un choque térmico a las células bacterianas colocándolas durante exactamente 20 s a 42 °C en un baño de agua o en un bloque calefactor.
5. Agregue 1 ml de medio de caldo Luria (LB) a temperatura ambiente (RT) e incube las bacterias transformadas en un termoagitador (250-500 rpm) durante 1 h a 37 ° C para permitir la expresión fenotípica de genes de resistencia a los antibióticos.
   NOTA: Para preparar 1 L LB medio, añadir 5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 10 g de NaCl y completar el volumen con agua, y esterilizar en autoclave.
6. Granular las bacterias por centrifugación a 11.000 x g durante 1 min y volver a suspender el pellet en 100 μL de medio LB fresco. Mezclar bien pipeteando.
7. Coloque las bacterias suspendidas en placas LB precalentadas que contengan los antibióticos apropiados (p. ej., con 50 μg/ml de kanamicina; si se transforma conjuntamente con BirA, incluya también 50 μg/ml de carbenicilina, consulte el paso 1.2).
8. Incubar las placas LB suplementadas con antibióticos boca abajo a 37 °C durante 13-15 h.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las placas con colonias cultivadas se pueden almacenar a 4 °C y sellar con una película permeable para evitar que se sequen.

2. Cultivo líquido bacteriano e inducción de la expresión de VHH-mCherry

1. Seleccione una sola colonia bacteriana de la placa de transformación e inocularla en un matraz Erlenmeyer que contenga 20 ml de medio LB suplementado con antibióticos. Incubar el cultivo en una incubadora agitadora durante 13-15 h a 37 °C (ver también el paso 1.7 sobre antibióticos de selección).
2. Al día siguiente, diluir el cultivo bacteriano de 20 ml durante la noche en un matraz nuevo que contenga 1 L de medio LB con los antibióticos de selección correspondientes.
3. Continuar incubando a 37 °C hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,6-0,7.
   NOTA: Deje que el cultivo se enfríe a RT o a 16 °C antes de la inducción de la expresión de proteínas.
4. Induzca la expresión de VHH-mCherry (y BirA, si se coexpresa) agregando 1 ml de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido 1 M (IPTG) para lograr una concentración final de 1 mM del inductor (dilución 1: 1000). Si se realizó una cotransformación con el plásmido de expresión de BirA, también se complementó el cultivo con 10 mL de una solución madre de D-biotina de 20 mM, lo que arrojó una concentración final de 200 μM de D-biotina en el medio de crecimiento. Esto facilita la biotinilación in vivo del epítopo aceptor de biotina (BAP) presente en la construcción VHH-mCherry.
   NOTA: Preparar el stock de D-biotina en ddH₂O y solubilizarlo mediante la adición gradual de 500 mM NaH₂PO₄.
5. Incube el cultivo de 1 L inducido por IPTG durante 13-15 h a 16 °C para promover un plegamiento y rendimiento óptimos de proteínas.
   NOTA: Las condiciones de expresión para construcciones de nanocuerpos de nuevo diseño con otras etiquetas fluorescentes pueden requerir una optimización empírica por parte del investigador.
6. Transfiera el cultivo a una botella de centrifugación de 1 L y coseche las células por centrifugación a 5.000 x g a 4 °C durante 45 min. Deseche el sobrenadante en el biorresiduo líquido apropiado y continúe con los pasos de purificación.
   NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto almacenando el pellet bacteriano a -80 °C. El gránulo VHH-mCherry generalmente aparece de color rosa, lo que indica un plegamiento adecuado de la proteína de fusión fluorescente.

3. Purificación basada en IMAC de VHH-mCherry

1. Si es necesario, descongele el gránulo bacteriano congelado en hielo (consulte también el paso 2.6).
2. Agregue 30 ml de tampón de unión helada (20 mM de imidazol en 1x PBS) al gránulo de células bacterianas y vuelva a suspender completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 50 ml etiquetado.
3. Complemente las células resuspendidas con 200 μg/ml de lisozima, 20 μg/ml de ADNasa I, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Incubar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente, seguida de 1 h a 4 °C en un rotador de extremo a extremo.
   NOTA: El PMSF es tóxico. Prepare y manipule soluciones madre en una campana extractora de productos químicos con guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos; deseche los residuos que contengan PMSF en contenedores de residuos orgánicos halogenados. Para los experimentos, se utilizó una solución madre de 0,1 M y se diluyó aún más.
4. Altere mecánicamente las células bacterianas utilizando un sonicador de punta insertado directamente en la suspensión. Aplique tres pulsos de sonicación constantes de 1 min, permitiendo un intervalo de enfriamiento de 1 min entre cada pulso con los ajustes especificados del sonicador (Tamaño de la punta de la sonda: 6 mm, punta sólida; Amplitud 40%; Ciclo de trabajo (modo de pulso): 1 s ON/1 s OFF)
5. Clarificar el lisado por centrifugación a 15.000 x g a 4 °C durante 45 min para granular los restos de células bacterianas y las bacterias intactas.
   NOTA: El lisado se puede transferir a una botella de centrífuga o alícuota en tubos de 5 ml para centrifugación de sobremesa.
6. Transfiera con cuidado el sobrenadante resultante a un nuevo tubo de 50 ml y deseche el gránulo en el biorresiduo apropiado.
7. Mantenga el lisado aclarado en hielo mientras se prepara para la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Para el aislamiento de nanocuerpos marcados con histidina, utilice columnas de purificación de etiquetas His preempaquetadas y de un solo uso optimizadas para la operación de flujo por gravedad.
8. Asegure las columnas de Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) en un soporte de metal o en un soporte de columna apropiado.
   1. Drene el tampón de almacenamiento de las columnas y equilibre con 10 ml de tampón de unión (20 mM de imidazol en 1x PBS).
   2. Deje que el amortiguador pase por gravedad; Deseche el flujo como biorresiduos.
9. Aplique gradualmente el lisado bacteriano aclarado (~ 30 ml) a la columna. Déjelo fluir por gravedad y deseche el flujo.
10. Lave la columna con dos volúmenes consecutivos de 10 ml de tampón de unión (20 mM de imidazol en 1x PBS).
11. Eluya los nanocuerpos unidos con 2 ml de tampón de elución (500 mM de imidazol en 1x PBS) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
12. Realice un intercambio de búferes.
    1. Equilibre una columna de desalinización colocada en un adaptador de tubo de 50 ml enjuagando 5 veces con 5 ml de 1 PBS.
    2. Deje que el tampón entre completamente en la resina empaquetada; Deseche el flujo. Después del lavado final de PBS, centrifugar la columna a 1.000 x g durante 2 min.
    3. Deseche el flujo continuo. Coloque la columna con el adaptador en un nuevo tubo de 50 ml. Cargue 2 ml de nanocuerpo funcionalizado eluido (del paso 3.11) en la columna de desalinización equilibrada con PBS y centrifugue a 1.000 x g durante 2 min y recoja el eluido.
       NOTA: La diálisis se puede utilizar alternativamente para el intercambio de tampones.
13. Cuantifique la concentración de la proteína VHH-mCherry purificada utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) o Bradford de acuerdo con los protocolos del fabricante.
    NOTA: Para una absorción eficiente de nanocuerpos en aplicaciones de imágenes de células vivas, se recomienda una concentración final de 5-10 mg / ml.

4. Validación de la expresión y pureza de VHH-mCherry (tinción de Coomassie)

1. Prepare un gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio al 10% (SDS-PAGE) de acuerdo con los protocolos de laboratorio establecidos.
   NOTA: Como alternativa, se pueden emplear geles degradados prefabricados disponibles comercialmente de Bio-Rad para mayor comodidad y reproducibilidad.
2. Alícuota 20 μg de VHH-mCherry purificado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y desnaturalización hirviendo en tampón de muestra a 95 °C durante 5 min.
3. Cargue la muestra de nanocuerpo desnaturalizado en el gel de poliacrilamida SDS y realice la electroforesis siguiendo los procedimientos estándar de PAGE hasta que el colorante de seguimiento (por ejemplo, azul de bromofenol) llegue al fondo del gel de resolución.
4. Proceda con la tinción de Coomassie y la decoloración del gel.
   1. Retire con cuidado el gel del casete y sumérjalo en la solución de tinción Coomassie (5% de un caldo Coomassie Brilliant Blue de 10 g/L en ácido acético al 10% y metanol al 45% en ddH₂O) durante 20-30 min a temperatura ambiente en una plataforma de agitación suave. Asegúrese de que el gel esté completamente sumergido en la solución de tinción.
   2. Eliminar el gel utilizando una solución decolorante (ácido acético al 7,5% y metanol al 15% en ddH₂O), realizando 2-3 lavados secuenciales de 1 h cada uno a temperatura ambiente. Para una reducción óptima del fondo, deje el gel durante 13-15 h en una solución decolorante fresca.
      NOTA: El exceso de tinte se puede absorber de manera efectiva colocando toallas de papel domésticas alrededor del gel durante el proceso de decoloración. Las soluciones de tinción/decoloración contienen metanol inflamable y ácido acético irritante. Úselo en una campana extractora, use guantes y gafas protectoras, y recoja las soluciones gastadas en contenedores designados para desechos de líquidos inflamables.
5. Visualice el gel utilizando un sistema de documentación de gel o una cámara de su elección.
   NOTA: Para una confirmación adicional de la expresión de nanocuerpos, se puede realizar inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos de epítopo (ver también Figura 1C).

5. Generación de líneas celulares HeLa reporteras marcadas con GFP mediante transducción retroviral

NOTA: Varias líneas celulares de reportero de GFP HeLa α Kyoto (aquí simplemente llamadas HeLa o HeLa α) se han generado previamente¹⁷. Con el fin de demostrar el ensayo de imágenes de células vivas, se emplean CDMPR o TfR marcados con GFP, como proteínas de carga representativas. Mientras que las proteínas TM con topología de tipo I están marcadas con GFP en el extremo N-terminal, las proteínas TM con topología de tipo II requieren fusión de GFP C-terminal.

1. Los genes que codifican para EGFP-CDMPR (Addgene #182642) o TfR-EGFP (#243763) han sido previamente subclonados en el vector retroviral pQCXIP utilizando técnicas estándar de clonación de enzimas de restricción¹⁷. Después de la transformación en E. coli quimiocompetente, prepare ADN plasmídico de alta pureza utilizando kits de preparación midi (por ejemplo, de Macherey-Nagel).
   NOTA: Las células bacterianas quimiocompetentes deben prepararse siguiendo los protocolos estándar de laboratorio. NEB 5-alfa Competente E . coli de NEB se puede utilizar para clonación y purificación de plásmidos.
2. Para generar líneas celulares HeLa reporteras de GFP estables, se producen partículas retrovirales mediante la transfección de la línea celular de envasado Phoenix ampho. Todo el trabajo de cultivo celular se lleva a cabo en condiciones de flujo laminar BSL2.
   1. El día anterior a la transfección, siembre 2.0-3.0 x 10⁶ anfocélulas Phoenix en un plato de 10 cm en 10 ml de medio para lograr una confluencia del 60% al 80% al día siguiente. Phoenix ampho se mantiene en DMEM GlutaMAX-I con alto contenido de glucosa con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 1 mM de piruvato de sodio.
   2. El día de la transfección, reemplace el medio con 10 ml de medio completo fresco.
   3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine 1 ml de GlutaMAX-I con alto contenido de glucosa DMEM sin suero ni suplementos con 10 μg de pQCXIP-EGFP-CDMPR o pQCXIP-TfR-EGFP y 30 μl de reactivo de transfección FuGENE HD. Mezclar bien pipeteando.
   4. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min para permitir la formación de complejos de reactivos de ADN.
   5. Agregue toda la mezcla de transfección gota a gota a la cultura de anfo Phoenix. Gire la placa suavemente para distribuir los complejos de manera uniforme.
   6. Incubar células anfogénicas Phoenix transfectadas durante 13-15 h a 37 °C con un 5% de CO₂.
      NOTA: Se pueden usar líneas celulares de empaque alternativas, siempre que sean compatibles con el sistema vectorial Retro-X Q.
3. Al día siguiente, deseche el medio de transfección y reemplácelo con 7 ml de medio completo fresco para mejorar la producción viral.
4. A las 48 h y, opcionalmente, a las 72 h después de la transfección, recoja el sobrenadante de cultivo (~7 ml) que contiene partículas virales utilizando una pipeta. Monitorizar la expresión de GFP en células anfo Phoenix transfectadas utilizando un microscopio de fluorescencia o un sistema de imágenes (por ejemplo, Bio-Rad ZOE).
   NOTA: Una vez más, las manipulaciones retrovirales requieren contención de BSL-2. Realice todo el trabajo en un gabinete de bioseguridad certificado, use guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos, y descontamine las superficies con hexacuarto al 1% seguido de etanol al 70% antes de eliminar los desechos en autoclave.
5. Filtre el sobrenadante viral recolectado a través de un filtro de 0,45 μm. El sobrenadante filtrado puede utilizarse inmediatamente (véase el paso 5.7) o almacenarse a 4 °C para un uso a corto plazo o a -80 °C para un almacenamiento a largo plazo. Tenga en cuenta que los títulos virales pueden disminuir al congelarse.
6. Para establecer células HeLa reporteras de GFP estables, proceda con la transducción retroviral utilizando el sobrenadante viral filtrado. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo bajo condiciones BSL2.
   1. Un día antes de la transducción, siembre aproximadamente 2.0-3.0 x 10⁶ células HeLa α en un plato de 10 cm con 10 mL de medio para alcanzar una confluencia del 60% al 80% al día siguiente. Cultivo Las células HeLa α se cultivan en DMEM GlutaMAX-I con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina.
   2. Mezcle sobrenadante viral filtrado con 15 μg/ml de polibreno (bromuro de hexadimetrina) para mejorar la eficacia de la infección.
      NOTA: Polybrene es un irritante: durante la preparación del stock, manipule con guantes y protección para los ojos, evite la formación de aerosoles y deseche las soluciones que contienen Polybrene como desechos químicos peligrosos.
   3. Al día siguiente, reemplace el medio de crecimiento estándar con sobrenadante viral sin diluir que contenga Polybrene, asegurándose de que toda la superficie del plato esté cubierta.
   4. Incubar células HeLa α bajo transducción durante 13-15 h a 37 °C con 5% de CO₂.
      NOTA: Para determinar el título viral, se pueden realizar ensayos de dilución e infección en serie en células α HeLa. La titulación en este caso es opcional, ya que los retrovirus infectan solo las células en división.
7. El día después de la transducción, deseche el medio viral en los desechos BSL2 y reemplácelo con 10 ml de medio α HeLa completo fresco. Incubar durante 13-15 h a 37 °C con un 5% de CO₂.
8. Al día siguiente, inicie la selección reemplazando el medio con medio completo que contenga 1,5 μg/ml de puromicina.
9. Mantenga la presión de selección durante 2-3 semanas, pasando las células según sea necesario. Antes de transferir células modificadas genéticamente a un entorno BSL1, asegúrese de que estén libres de partículas virales competentes para la replicación.
10. Para obtener una población homogénea, utilice el aislamiento clonal mediante anillos o cilindros de clonación, o la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). FACS se puede realizar en células α HeLa transducidas utilizando FACSAria III o Fusion (BD Biosciences) para enriquecer una población con expresión uniforme de GFP basada en la intensidad de fluorescencia.
    NOTA: La expresión del indicador de GFP en células HeLa α puede validarse aún más mediante microscopía de fluorescencia de células fijas o inmunotransferencia con anticuerpos anti-GFP (véase también la Figura 2C).

6. Captación de VHH-mCherry por células cultivadas para la obtención de imágenes de células vivas

NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular se llevan a cabo en condiciones estériles dentro de una campana de flujo laminar antes de la microscopía de células vivas.

1. 6.1Bajo flujo laminar estéril, siembre aproximadamente de 50,000 a 110,000 células HeLa que expresan construcciones reporteras CDMPR o TfR marcadas de manera estable con GFP en cada pocillo de un portaobjetos de cámara ibiTreat de 4 pocillos de μ portaobjetos. Use 700 μL de medio de cultivo completo que contenga antibióticos (DMEM alto contenido de glucosa, sin rojo de fenol), suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM de l-glutamina y 1,5 μg/mL de puromicina.
2. Incubar las células durante 13-15 h a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 para permitir una adhesión y proliferación adecuadas. Las células deberían alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia al día siguiente.
3. El día de la obtención de imágenes, justo antes del experimento, reemplace suavemente el medio en cada pocillo con 350 μL de medio completo fresco sin rojo de fenol.
4. Paralelamente, prepare una solución de trabajo VHH-mCherry a una concentración final de 2,5 μg/ml (aproximadamente 50 nM) en medio precalentado sin rojo de fenol. Mantener la solución a 37 °C hasta su uso.
5. Después de inicializar el sistema automatizado de imágenes de células vivas (por ejemplo, FEI MORE o Nikon Ti2 X-Light V3), precaliente la cámara de incubación del microscopio a 37 °C con un 5% de CO₂ antes de transferir la cámara de microscopía ibidi al microscopio y configurar los ajustes de adquisición de la siguiente manera.
   1. Elija el U PlanS Apo 100x NA 1.4 y añada la cámara de microscopía ibidi en la platina del microscopio.
   2. Configure dos canales con la longitud de onda de excitación adecuada y filtros de emisión de paso de banda única para EGFP (por ejemplo: 470/20 nm, em: 517/20 nm) y mCherry (por ejemplo: 550/15 nm, em: 590/20 nm).
   3. Elija un tiempo de exposición corto y una intensidad de iluminación baja para evitar el fotoblanqueo (por ejemplo, 50 ms y 5% de potencia para EGFP, 160 ms y 25% para mCherry). Es importante que los valores elegidos se mantengan constantes para todos los experimentos.
   4. Por condición (=pozo), almacene las coordenadas de 10 campos de visión diferentes con 3-4 celdas enfocadas en una lista de puntos.
   5. Imagen de cada posición en esta lista de puntos una vez con una sola instantánea. Estas son las imágenes de referencia antes de la adición de VHH-mCherry.
   6. Para iniciar la absorción endocítica, agregue suavemente 350 μL de la solución VHH-mCherry precalentada a cada pocillo, asegurando una alteración mínima de la monocapa celular. Continuar la incubación a 37 °C con un 5% de CO₂.
   7. Imagen de cada punto de la lista de puntos repetidamente en un experimento de lapso de tiempo durante 100 fotogramas con un retraso de 36 s entre fotogramas a 37 °C con un 5% de CO₂.
   8. Para disminuir el fotoblanqueo, ordene la adquisición de los canales para obtener imágenes primero de mCherry y luego de EGFP.
   9. Para aumentar el rendimiento, ordene a la adquisición que primero adquiera todas las posiciones secuencialmente y repita esto para cada punto de tiempo.

7. Análisis de imágenes de la captación endocítica de VHH-mCherry

1. Preprocesamiento de imágenes posterior a la adquisición y extracción de datos en Fiji.
   1. Cargue la imagen de lapso de tiempo usando el complemento de importación de Bio-Formatos con la opción de dividir canales activada.
   2. Corrija la deriva lateral usando el complemento MultiStackReg. Utilice el canal EGFP como referencia y aplique también la transformación al canal mCherry.
   3. Por celda, dibuje una región de interés (ROI) con la herramienta de polígono (por ejemplo, alrededor de la región perinuclear) y agréguela al administrador de ROI.
   4. Para ambos canales, mida la intensidad media en todos los ROI y puntos de tiempo utilizando la función Multi measure del administrador de ROI y guarde la tabla resultante como archivo de texto.
   5. Abra la imagen de referencia correspondiente y repita la medición para cada ROI.
2. Análisis de datos para determinar curvas de captación endocítica
   1. Abra el archivo de texto y reste cada número de fotograma por 1 para que comiencen en 0, luego multiplique cada número de fotograma por el retraso entre fotogramas en s (es decir, 36).
   2. Para cada ROI, reste la intensidad media en el canal VHH-mCherry de la imagen de referencia de cada fotograma de la imagen de lapso de tiempo correspondiente en el canal VHH-mCherry para eliminar la autofluorescencia y el fondo.
   3. Para cada fotograma y ROI, divida la intensidad VHH-mCherry sustraída por el fondo por la intensidad media de los canales EGFP para tener en cuenta las fluctuaciones de intensidad dentro del ROI que no sean VHH-mCherry, por ejemplo, por movimiento de Golgi, contracción celular, deriva z o inestabilidades de iluminación.
   4. Normalice la curva resultante a su propio máximo.
   5. Seleccione un rango de fotogramas para excluir cualquier artefacto al principio (es decir, adición de medios) o al final (es decir, deriva, blanqueo) del lapso de tiempo.
   6. Ajuste los datos de la curva con una única función de decaimiento exponencial que modele un proceso cinético de primer orden:
      
      donde I(t) es la intensidad normalizada en el tiempo t, y t₀ representa el retardo de tiempo entre la adición de VHH-mCherry y el inicio de la grabación. A partir de la constante de velocidad k, calcule la vida media τ_1/2 del proceso como:
      
      NOTA: Cuando se realiza un experimento con múltiples campos de visión (FOV) obtenidos posteriormente por punto de tiempo, cada t0 correspondiente podría ser ligeramente diferente, pero debería incrementarse a valores más altos de un campo de visión al siguiente.
   7. Repita el procedimiento para todos los conjuntos de datos e informe los valores de vida media en diagramas de caja.

Para investigar el tráfico retrógrado de proteínas a varios compartimentos intracelulares, hemos establecido recientemente una herramienta basada en nanocuerpos anti-GFP para etiquetar y rastrear proteínas de fusión recombinantes de la superficie celular17. Aquí, describimos la producción bacteriana de dichos nanocuerpos derivados y demostramos su utilidad en el monitoreo de la captación endocítica mediante imágenes de células vivas. En combinación con un reportero fluorescente residente en Golgi, este protocolo ofrece una plataforma robusta para estudiar cuantitativamente el transporte retrógrado de proteínas de carga seleccionadas a la red trans-Golgi (TGN) en tiempo real.

Hemos generado una colección de nanocuerpos anti-GFP funcionalizados distintos que comparten una arquitectura modular común, utilizando técnicas estándar de clonación molecular17. Aunque el estudio actual se centra en la variante fluorescente VHH-mCherry, también incluimos nanocuerpos derivatizados adicionales para ilustrar la versatilidad de este conjunto de herramientas y resaltar su potencial para aplicaciones futuras. Nuestra construcción más básica, VHH-std (std para estándar), comprende el dominio VHH, los epítopos T7 y HA para la detección basada en anticuerpos, una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) para la purificación y una secuencia de péptido aceptor de biotina (BAP) para permitir la biotinilación enzimática y los ensayos de pulldown basados en estreptavidina de alta afinidad (Figura 1A). A partir de este diseño central, se desarrollaron varios derivados de nanocuerpos para facilitar el estudio del tráfico endocítico y retrógrado a través del análisis bioquímico, la obtención de imágenes fijas y de células vivas y la microscopía electrónica.

Para la obtención de imágenes de células vivas del transporte endocítico, diseñamos un nanocuerpo fluorescente anti-GFP que incorpora un fluoróforo con espectros de excitación y emisión distintos de los de GFP, lo que garantiza una separación espectral óptima durante la microscopía de fluorescencia. Con base en sus propiedades de plegamiento superiores en E. coli inducida por IPTG y sus propiedades fotofísicas bien caracterizadas, seleccionamos mCherry como la etiqueta fluorescente de elección. Otros fluoróforos desplazados al rojo, como la proteína fluorescente roja monomérica (mRFP), también serían alternativas adecuadas en principio, pero mCherry demostró ser particularmente robusta y efectiva en este sistema.

¿Cuál es el potencial de otros nanocuerpos funcionalizados además de VHH-mCherry? Para investigar el tráfico de proteínas desde la membrana plasmática a la red trans-Golgi (TGN), aprovechamos la localización específica del compartimento de los TPST, que residen exclusivamente en las cisternas TGN y trans-Golgi. Con este fin, modificamos VHH-std con un motivo de sulfatación de tirosina en tándem (2xTS) derivado de la procolecistoquinina29 de rata, lo que permite una lectura bioquímica de la llegada de la carga a estos compartimentos. Mientras que la fusión de VHH-std a mCherry permite la visualización directa del transporte retrógrado mediante imágenes fijas o de células vivas, la funcionalización con peroxidasas como APEX230 permite la localización ultraestructural mediante microscopía electrónica, ablación citoquímica dirigida o ensayos de biotinilación basados en proximidad. Además, la incorporación de un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) en el andamio de nanocuerpos proporciona un medio bioquímico para distinguir entre nanocuerpos internalizados y unidos a la superficie (Figura 1A). Anteriormente empleamos la construcción VHH-tev para monitorear la cinética de reciclaje de EGFP-CDMPR y TfR-EGFP17 unidos a nanocuerpos. La reaparición de receptores marcados con nanocuerpos en la superficie celular podría detectarse fácilmente aplicando proteasa TEV recombinante extracelularmente, lo que resulta en una pérdida específica del casete del epítopo C-terminal del nanocuerpo. De manera análoga, la inclusión de un sitio de escisión de TEV dentro del nanocuerpo VHH-mCherry funcionalizado con mCherry que se presenta aquí permite la evaluación dinámica del reciclaje del reportero EGFP mediante imágenes de células vivas. La funcionalización con dominios de proteínas alternativos, como fluoróforos adicionales, etiquetas enzimáticas o motivos de secuencia para la modificación postraduccional, se puede lograr fácilmente subclonando las inserciones deseadas en la columna vertebral VHH-std por los sitios de restricción SpeI y EcoRI. Todas las construcciones de nanocuerpos anti-GFP funcionalizadas utilizadas en el estudio original17 se han depositado en Addgene para su distribución pública.

Usando el protocolo descrito anteriormente, todas las variantes de nanocuerpos ilustradas aquí se purificaron a un alto rendimiento y pureza (Figura 1B). Solo la fusión de mCherry exhibió un recorte proteolítico menor de los dominios de proteínas después de la purificación (Figura 1B, carril 5). Los dos productos de degradación observados probablemente corresponden a los dominios individuales VHH y mCherry, según se infiere de sus pesos moleculares aparentes y se verifica mediante la detección de inmunotransferencia específica de epítopos (Figura 1C). En ausencia de BirA coexpresado, VHH-mCherry generalmente se recuperó con rendimientos de aproximadamente 20 mg por preparación. Según nuestra experiencia, la coexpresión de BirA reduce constantemente el rendimiento de los nanocuerpos en aproximadamente 1/3a 1/2. La biotinilación fue bastante completa porque los nanocuerpos de una mezcla 1:1 con BSA fueron completamente recuperados por estreptavidina-agarosa (Figura 1D).

Para evaluar la idoneidad de este conjunto de herramientas de nanocuerpos para estudiar el transporte endocítico, generamos líneas celulares HeLa estables que expresan proteínas receptoras de superficie marcadas con EGFP con distintas rutas de tráfico intracelular. Estos incluyeron TfR, que circula entre la membrana plasmática y los endosomas tempranos (clasificación y reciclaje); TGN46, que se mueve entre la membrana plasmática y el TGN por endosomas tempranos; y ambos MPR, que se desplazan entre el TGN, la membrana plasmática y los endosomas tempranos y tardíos17. EGFP se fusionó con el dominio extracelular de cada receptor, específicamente, insertado entre el péptido señal y la secuencia del receptor para CDMPR, CIMPR y TGN46, y con el extremo C de TfR. Este diseño preservó los dominios citoplasmáticos nativos, asegurando que todas las señales de clasificación conocidas permanecieran intactas y que la etiqueta EGFP fuera accesible para la unión por parte de nanocuerpos anti-GFP extracelulares (Figura 1E). Para CIMPR, cuyo dominio extracelular es inusualmente grande, se utilizó una versión truncada, consistente con estudios previos que demuestran que dicho truncamiento preserva el comportamiento normal de tráfico31,32.

Las líneas celulares estables se establecieron mediante transducción retroviral, seguida de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar poblaciones celulares homogéneas con niveles de expresión moderados y comparables. Cabe destacar que EGFP-CDMPR apareció consistentemente como una banda doble en inmunomanchas, similar a su contraparte endógena33, indicativa de glicosilación heterogénea. Para evaluar si las proteínas de fusión EGFP recapitulan los patrones de localización y expresión en estado estacionario de las proteínas endógenas, las células de expresión estable se cocultivaron con células HeLa parentales y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal (Figura 2B). La señal EGFP reflejó fielmente la distribución de las proteínas endógenas correspondientes. Como se esperaba, CDMPR, CIMPR y sus versiones marcadas con EGFP se localizaron predominantemente en la región perinuclear, lo que refleja TGN y compartimentos endosomales tardíos, con etiquetado adicional en endosomas periféricos. Tanto el TGN46 endógeno como el marcado con EGFP se encontraron casi exclusivamente en el TGN perinuclear, mientras que TfR y TfR-EGFP mostraron la característica distribución endosómica temprana, con endosomas prominentes de clasificación periférica y reciclaje perinuclear. Aunque los anticuerpos utilizados detectaron tanto las formas endógenas como las marcadas con EGFP (excepto CIMPR), la intensidad general de la tinción no aumentó notablemente en las células que expresan las proteínas de fusión, lo que sugiere que las construcciones de EGFP no se sobreexpresaron sustancialmente. Incluimos EGFP-TGN46 y EGFP-CIMPR en la Figura 2B para la comparación directa con EGFP-CDMPR y TfR-EGFP. Los protocolos utilizados para la fijación celular y la microscopía de fluorescencia se describen en estudios previos17,19.

Usando VHH-mCherry, el transporte endocítico de proteínas reporteras marcadas con EGFP se puede monitorear mediante imágenes de células vivas. Para ello, utilizamos como ejemplos células que expresan EGFP-CDMPR y TfR-EGFP. Las células se visualizaron a lo largo del tiempo con un microscopio fluorescente de campo amplio invertido al agregar VHH-mCherry al medio (Video 1 y Video 2). En la Figura 3 se muestran imágenes fijas en varios puntos de tiempo. La captación se cuantificó midiendo la señal en el canal mCherry, restando el fondo de autofluorescencia y normalizando a la señal EGFP para eliminar las fluctuaciones debidas al movimiento de los compartimentos marcados o posibles pequeños cambios en el plano focal. La fluorescencia de VHH-mCherry en el medio a 25 nM fue insignificante y no interfirió con las mediciones. El análisis del transporte de los reporteros desde la superficie celular a sus compartimentos intracelulares, hasta la distribución en estado estacionario, arrojó los mismos resultados cinéticos que los experimentos bioquímicos mostrados en la Figura 2 de la publicación anterior17, con vidas medias aparentes de captación de ~ 9 min para EGFP-CDMPR y ~ 4 min para TfR-EGFP, y saturación después de ~ 43 min y ~ 20 min, respectivamente. Estos valores fueron comparables con los valores obtenidos de experimentos de captación bioquímica utilizando ensayos de inmunotransferencia17. En principio, también se puede analizar la cinética del transporte retrógrado hacia regiones subcelulares de interés, como la región perinuclear de mayor concentración de MPR. Sin embargo, la región perinuclear no solo contiene Golgi / TGN, sino que también está enriquecida en endosomas tardíos y endosomas reciclados. La cinética de la captación de nanocuerpos en la región perinuclear no es lo suficientemente específica como para analizar el transporte retrógrado a un orgánulo definido. Para evaluar de manera más confiable el transporte de membrana plasmática a TGN, otra proteína fluorescente, una proteína transmembrana residente en TGN, debe coexpresarse de manera estable junto con la proteína reportera de GFP, de manera que no haya superposición espectral de las propiedades de los fluoróforos. El uso de este marcador adicional permite la detección de VHH-mCherry importado por reportero, análogo a la sulfatación de tirosina mediada por TPST, como se documentó anteriormente19.

Figura 1: Diseño y producción de nanocuerpos derivatizados para el seguimiento de proteínas de la superficie celular marcadas con EGFP. (A) Descripción esquemática de los nanocuerpos derivatizados. La construcción estándar de nanocuerpos comprende un dominio VHH específico de GFP, etiquetas de epítopo T7 y HA, un péptido aceptor de biotina (BAP) y una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) para la purificación. Las variantes adicionales de nanocuerpos incluyen modificaciones con sitios de sulfatación de tirosina en tándem (2xTS), la peroxidasa diseñada APEX2 o la proteína fluorescente mCherry. La barra de escala indica la longitud del aminoácido (aa). (B) Los nanocuerpos expresados por bacterias y purificados por afinidad (20-50 μg) se analizaron mediante gradiente SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción de Coomassie. Los patrones de peso molecular (en kDa) se indican a la izquierda. Se observó un recorte proteolítico menor solo para VHH-mCherry, probablemente entre los dominios VHH y mCherry. (C) Análisis de inmunotransferencia de preparaciones de nanocuerpos (10 ng) utilizando anticuerpos dirigidos contra los epítopos T7, HA o His6 , o detectados por estreptavidina-HRP (SA-HRP) para la evaluación de la biotinilación. (D) El grado de biotinilación de los nanocuerpos se evaluó incubando nanocuerpos en una proporción de 1:1 con BSA, seguido de la extracción de estreptavidina-agarosa, la granulación y el lavado de las perlas. Volúmenes iguales del sobrenadante (S) y del material unido a perlas (B) se analizaron posteriormente mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie. La recuperación cuantitativa del nanocuerpo en la fracción unida a las perlas indica una biotinilación completa. La presencia de fragmentos de VHH y mCherry en la fracción unida sugiere una degradación parcial, que probablemente ocurra durante la preparación de la muestra para el análisis SDS-PAGE. La línea blanca entre los carriles 2 y 3 indica la eliminación de dos carriles no relacionados. Esta cifra ha sido modificada de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Expresión y localización intracelular de receptores de carga marcados con EGFP marcados con fluorescencia. (A) Representación esquemática de las construcciones de fusión de EGFP. Las secuencias derivadas de las proteínas transmembrana secretoras se representan en negro, con péptidos señal N-terminales y dominios transmembrana internos resaltados en amarillo. La fracción EGFP se ilustra en verde. Se generaron construcciones completas para CDMPR, TfR y TGN46, mientras que se utilizó una variante truncada bien caracterizada para CIMPR para preservar el comportamiento normal de tráfico. La barra de escala indica la longitud del aminoácido (aa). EGFP-CDMPR y TfR-EGFP se han descrito previamente17. (B) Para evaluar la localización subcelular, las células HeLa que expresan de manera estable las proteínas de fusión EGFP se cocultivaron con células HeLa parentales y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. La barra de escala representa 10 μm. (C) Las células HeLa que expresan de manera estable las proteínas reporteras marcadas con EGFP se lisaron y los extractos de proteínas se sometieron a SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia utilizando anticuerpos contra GFP y actina. Los marcadores de peso molecular (en kDa) se indican a la derecha. Esta cifra ha sido modificada de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de células vivas de la cinética de captación endocítica de nanocuerpos mediada por EGFP-CDMPR y TfR-EGFP. Las imágenes de células vivas se realizaron después de la adición de VHH-mCherry de 25 nM a células HeLa que expresan de manera estable (A) EGFP-CDMPR o (B) TfR-EGFP en medio completo sin rojo de fenol a 37 ° C. Se obtuvieron imágenes de las células en los canales GFP y mCherry utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio semiautomatizado a intervalos de 36 s. Se muestran imágenes fijas combinadas representativas, acompañadas de vistas ampliadas de la región perinuclear (aumento: 2,2x) en canales individuales a continuación. (Barras de escala, 10 μm.) Véase también el vídeo 1 y el vídeo 2. El análisis cuantitativo de la cinética de captación de nanocuerpos en (C) EGFP-CDMPR y (D) TfR-EGFP se realizó utilizando datos de tres experimentos independientes, cada uno capturando aproximadamente 40 células individuales. Para tener en cuenta el movimiento de los orgánulos y la variabilidad del plano focal, la intensidad de fluorescencia de mCherry se normalizó (norma) a la señal GFP y se graficó como la media ± SD en todas las células de los tres experimentos. La señal de captación máxima promedio se normalizó a 1. La cinética de captación para cada célula se ajustó individualmente utilizando un modelo cinético de primer orden. Las líneas trazadas representan las curvas promediadas derivadas de la media de las constantes de velocidad correspondientes. Esta cifra ha sido modificada de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Imágenes de células vivas de la captación de nanocuerpos de mCherry por EGFP-CDMPR. Las células HeLa que expresan EGFP-CDMPR de manera estable se incubaron a 37 ° C en un medio completo que contenía 25 nM de VHH-mCherry y se obtuvieron imágenes en los canales de fluorescencia EGFP y mCherry a intervalos de 36 s. La película se renderizó a una velocidad de reproducción de 5 fotogramas/s, lo que corresponde a una compresión en tiempo real de 3 min/s. Esta película ha sido modificada de17. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Imágenes de células vivas de la captación de nanocuerpos de mCherry por TfR-EGFP. Las células HeLa que expresan TfR-EGFP de manera estable se incubaron a 37 ° C en medio completo suplementado con VHH-mCherry de 25 nM y se obtuvieron imágenes de fluorescencia de EGFP y mCherry a intervalos de 36 s. La película se renderizó a 5 fotogramas / s, lo que representa una velocidad de lapso de tiempo de 3 min / s. Esta película ha sido modificada de17. Haga clic aquí para descargar este video.

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