Regulación mediada por miR-22 de la señalización de Wnt/β-catenina por curcumina en retinoblastoma

Resumen

Este estudio presenta un protocolo para evaluar los efectos de la curcumina en el comportamiento celular del retinoblastoma a través de la modulación de la vía Wnt/β-catenina y la expresión de miR-22.

Resumen

El retinoblastoma (RB) es un tumor maligno intraocular común que afecta a bebés y niños, pero su etiología y patogénesis precisas aún no se comprenden por completo. La curcumina, un polifenol bioactivo, inhibe la progresión tumoral a través de la modulación mediada por microARN de la cascada de señalización Wnt / β-catenina. Este estudio tuvo como objetivo aclarar cómo la curcumina media sus efectos antitumorales en RB investigando su regulación de la expresión de miRNA-22 (miR-22) y explorando los mecanismos moleculares subyacentes. Dos modelos validados de retinoblastoma (SO-RB50/WERI-Rb-1) se trataron con curcumina a concentraciones variables. Para delinear la regulación de miR-22 de la señalización de Wnt / β-catenina, las células diana se transdujeron con un lentivirus imitador de miR-22 o un lentivirus de control no funcional. Se establecieron modelos tumorales de xenoinjerto en ratones utilizando células RB humanas para observar los efectos in vivo de la curcumina sobre el tamaño del tumor, la expresión de miR-22 y los niveles de proteína Wnt / β-catenina. La proliferación celular, la invasión y la apoptosis se evaluaron mediante el ensayo de tinción dual CCK-8, Transwell y Annexin V-APC-PI, respectivamente. Los niveles de miR-22 se cuantificaron mediante RT-PCR, y los perfiles de expresión de Wnt1 y β-catenina se determinaron mediante análisis de Western blot. El tratamiento con curcumina resultó en una disminución de la proliferación e invasividad en las células RB, al tiempo que mejoró la apoptosis y elevó la expresión de miR-22. La inhibición de miR-22 disminuyó los efectos de la curcumina sobre la vía de señalización Wnt / β-catenina. En estudios de xenoinjertos, la curcumina redujo significativamente el tamaño del tumor y mejoró la expresión de miR-22 dentro de los tumores, suprimiendo eficazmente la señalización de Wnt / β-catenina. Estos hallazgos demuestran que la curcumina inhibe la proliferación e invasividad de las células RB al tiempo que promueve la apoptosis, mediada principalmente por la regulación positiva de miR-22 y la posterior inhibición de la vía Wnt / β-catenina.

Introducción

El retinoblastoma (RB), una neoplasia maligna pediátrica con alta agresividad que surge en los tejidos de la retina, representa una amenaza sustancial para la salud, especialmente para los niños menores de cinco años. Las mutaciones genéticas, particularmente las que afectan al gen RB1, están estrechamente asociadas con el desarrollo de esta enfermedad¹. Teniendo en cuenta la prevalencia significativa de retinoblastoma (RB) entre bebés y niños, junto con el hecho de que se informan aproximadamente 9000 casos nuevos anualmente, predominantemente en países de bajos ingresos y en desarrollo, es imperativo una comp....

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal (AEWC) del Hospital Oftalmológico de Tianjin (Aprobación No. NKYY-DWLL-2023-054). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular

Las células de las líneas de retinoblastoma humano WERI-Rb-1 y SO-RB50 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se sembraron a una densidad adecuada en matraces ....

Resultados

Efectos antiproliferativos y antiinvasivos dependientes de la dosis de la curcumina en las células de retinoblastoma humano, acompañados de la desactivación de la vía Wnt/β-catenina
Las células RB humanas se trataron con dosis variables de curcumina durante un período de 24 h. Los hallazgos revelaron una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular y la invasión, junto con un aumento de la apoptosis. Específicamente, a medida que la concentración de curcumina aumentó de 10 a 50 μM, la .......

Discusión

La curcumina, un polifenol derivado de los rizomas de Curcuma longa, es conocida por sus propiedades antiinflamatorias, antiangiogénicas, antiproliferativas y antioxidantes^23,24. Además, tiene propiedades antitumorales, particularmente su capacidad para inducir la apoptosis en células malignas²⁵. Aunque investigaciones anteriores han enfatizado los efectos supresores del crecimiento de la curcumina en las .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de tinción dual Annexin V-APC/PI	Solarbio	CA1020	evaluar cuantitativamente la apoptosis en células RB mediante citometría de flujo
Kit de ensayo CCK-8	Tiempo de beyo.	C0038	Medir la absorbancia a 490 nm para evaluar la capacidad proliferativa celular
Incubadora de CO2	Eppendorf		mantener condiciones óptimas de cultivo (37° C, 5% CO2 y humedad saturada) para la propagación de células RB
Curcumina	Sigma	C1386	Investigación de los efectos antitumorales de la curcumina en el retinoblastoma (RB)
Sustrato quimioluminiscente ECL	BIOSS	C05-07004	visualizar bandas de proteínas en el análisis de Western blot
Suero fetal bovino (FBS)	VivaCell	C04001-500 C04002-500	Cultivo celular
Citometría de flujo	Beckman Coulter	Galios	Analizar cuantitativamente la tasa de apoptosis de las células
ImageJ Software	Institutos Nacionales de Salud	Versión 6	Análisis de banda Western blot, evaluar los niveles de expresión de proteínas
Microscopio invertido	Olimpo	CKX53	observar y contar células invasoras a 400 veces; aumento en el ensayo Transwell
Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000015	Transfección celular
Lector de microplacas	Termo	K3	Cuantificación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
miR-22 imita al lentivirus	Biotecnología Hanheng	has-miR-22	establecer una línea celular transfectada de forma estable para experimentos con animales
Sistema de PCR multiplex en tiempo real	Bio-Rad	CFX384	realizar RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para un análisis preciso de la expresión génica
Penicilina-Estreptomicina (PS)	Abbkine	BMC1030	Añadido a los medios de cultivo celular para evitar la contaminación bacteriana
Kit de extracción de proteínas	Solarbio	BC3640-50T	Aislamiento de proteínas a partir de muestras celulares y tisulares
Vector psiCHECK-2	promega	JR20110328	construir plásmidos reporteros Wnt1-WT (tipo salvaje) y Wnt1-MUT (mutante) para investigar la interacción entre miR-22 y Wnt1 3'UTR
Membrana de PVDF	Merck	ISEQ00010	transferencia de proteínas
Anticuerpo secundario IgG de conejo	Tecnologías de señalización celular	14708	Detección de Western blot mediante la unión al anticuerpo primario
Software estadístico SPSS	IBM	SPSS 20.0	realizar análisis estadísticos de los datos experimentales
Kit SuperScript III Síntesis de primera hebra SuperMix	Invitrogen	11752-050	transcripción inversa de ARN en ADNc para su posterior análisis por RT-PCR
SYBR Premix Ex Taq II Kit	Biografía de TaKaRa	RR820A	Para que la RT-PCR detecte cuantitativamente la expresión de Wnt1, β-actina y otros genes diana
Reactivo TRIzol	Invitrogen	12183-555	Extracción de ARN de muestras celulares y de tejidos
Espectrofotómetro UV	Beckman	DU800	determinar la concentración y pureza de las muestras de ARN
Anticuerpo Wnt1	Abcam	AB15251	Análisis de Western blot para detectar la expresión de la proteína Wnt1
Anticuerpo β-actina	Abcam	ab8227	utilizado como referencia interna para normalizar la carga de proteínas en el análisis de Western blot
Anticuerpo β-catenina	Tecnologías de señalización celular	37447	Análisis de Western blot para detectar la expresión de la proteína β-catenina