La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.
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Artículo de método
Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo
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Resumen
Resumen
La ubiquitinación, una modificación pos-traduccional, es un regulador crítico de la función intracelular de las proteínas. La ubiquitinación modula las funciones de las proteínas promoviendo la degradación proteasómica o alterando la localización subcelular mediante señalización dependiente de la cadena de ubiquitina. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de SMAD2 en HEK293T células y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación de proteínas. La sobreexpresión de proteínas en las células se indujo mediante transfección transitoria. Los plásmidos (HA-Ub, FLAG-SMAD2 y MYC-SMURF2) y los reactivos de transfección se añadieron por separado al medio basal, se mezclaron y la mezcla se añadió a las células. Antes de la cosecha, se añadió MG132 para inhibir la degradación proteasómica y mejorar la acumulación ubiquitinizada de proteínas. La principal divergencia entre los dos enfoques experimentales son sus métodos de lisis celular: el método del baño de hielo (realizado a 4 °C) y el método de tratamiento térmico (que implica incubación a 95 °C), que afecta sustancialmente a la eficiencia de la lisis proteica. Tras completar la lisis celular, el lisado celular, las perlas de agarosa y el anticuerpo FLAG se mezclaron e incubaron a 4 °C durante la noche. Las proteínas ubiquitinadas fueron detectadas posteriormente mediante análisis de western blot. Antes de detectar proteínas ubiquitinadas, se utilizaba un anticuerpo de cadena ligera para la incubación secundaria de anticuerpos. Después, se detectaron bandas de ubiquitinación. Los resultados muestran que tanto el método del baño de hielo como el método de tratamiento térmico pueden utilizarse para detectar niveles de ubiquitinación, mientras que el método de tratamiento térmico puede facilitar la detección de la ubiquitinación de SMAD2. Este estudio delimita y compara dos métodos de lisis celular para medir los niveles de ubiquitinación en células de mamíferos, utilizando SMURF2/SMAD2 como modelo, para ayudar a los investigadores a seleccionar métodos más adecuados para detectar los niveles de ubiquitinación de las proteínas del sustrato.
Introducción
La ubiquitinación, una modificación posttraduccional indispensable, es un regulador crítico de las funciones intracelularesde las proteicas. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que media la degradación de más del 80% de las proteínas en los eucariotas, está compuesto por ubiquitina (Ub), enzimas activadoras de E1, enzimas conjugadoras de E2, ligasas E3, enzimas deubiquitilantes (DUBs) y el proteasomo26S 2. Este sistema regula la renovación proteica con alta especificidad, controlando así procesos celulares esenciales como la progresión del ciclocelular 3, la transducción de señales 4,5 y las respuestas alestrés 6,7. La ubiquitinación es un proceso enzimático de varios pasos. E1 hidroliza ATP para adenilar el extremo C de Ub, formando un intermedio Ub-AMP. Luego, el Ub activado se transfiere de E1 a la cisteína en el sitio activo de una enzima conjugante de E2, formando un enlace tioéster. Finalmente, una ligasa E3 recluta tanto el complejo E2-Ub como una proteína objetivo, catalizando la transferencia de Ub de E2 a un residuo de lisina en elsustrato 8.
La ubiquitina puede formar diversas cadenas de poliubiquitina mediante enlace en siete residuos de lisina (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) o Met1(M1)4. Cada tipo de enlace determina resultados biológicos distintos: las cadenas K48 se dirigen principalmente a proteínas para la degradaciónproteasómica 9, las cadenas K63 regulan la señalización y la reparación delADN 10,11, y las cadenas vinculadas a M1 son críticas para las respuestas inmunitariasinnatas 12. La ubiquitinación y la deubicquitinación son procesos clave de modificación postraduccional que gobiernan diversos eventos celulares, que van desde la degradación de proteínas hasta la transducción de señales. Por ejemplo, en el cáncer colorrectal, la activación aberrante de la ubiquitinación mediada por MDM2 por p53 conduce a una degradación excesiva de p53, lo que afecta su capacidad para inducir paro del ciclo celular y apoptosis, impulsando así la progresión tumoral y la quimioresistencia13,14. En la lesión por isquemia-reperfusión hepática, OTUD1 estabiliza NRF2 al eliminar su poliubiquitinación ligada a K48, mejorando así los niveles de estrés oxidativointracelular 15,16. Una variedad de inhibidores del proteasoma, como bortezomib, carfilzomib e ixazomib, han entrado progresivamente en la práctica clínica para enfermedades como el mielomamúltiple 17,18,19.
Actualmente, existen numerosos métodos para detectar proteínas ubiquitinadas, incluyendo western bloting, ensayos basados en radiactividad y ensayosde fluorescencia 20. Sin embargo, en la investigación científica, la western blot sigue siendo el método preferido para la detección de la ubiquitinación de proteínas debido a su protocolo relativamente rápido y sencillo. Los métodos tradicionales para detectar proteínas ubiquitinadas son similares a la tecnología de co-inmunoprecipitación (co-IP): utilizan un tampón de lisis para incubar y lisar pellets celulares a baja temperatura para liberar proteínas, y luego emplean anticuerpos para detectar la ubiquitinación de proteínas delsustrato 21,22. Sin embargo, este protocolo experimental suele requerir un gran número de células. Además, dado que el método de lisis relativamente suave a baja temperatura no puede interrumpir completamente las interacciones proteicas, esto aumenta la probabilidad de falsos positivos en la ubiquitinación detectada. El calentamiento y el uso de SDS pueden alterar significativamente la estructura de las proteínas, induciendo su desnaturalización completa y reduciendo así de forma efectiva los falsos positivos causados por las interaccionesproteína-proteína 23,24,25. De manera similar, las células sufren suficiente lisis tras el calentamiento y el tratamiento SDS, liberando más proteínas y, en consecuencia, reduciendo la cantidad de células necesarias para el experimento. En resumen, tanto el método del baño de hielo como el método de tratamiento térmico lisan células y detectan los niveles de ubiquitinación de las proteínas del sustrato mediante incubación de anticuerpos. Sin embargo, el método de calentamiento resulta en una mayor lisis celular y una desnaturalización de proteínas más fuerte.
El TGF-β desempeña un papel dual en los procesos fisiopatológicos de diversas enfermedades26,27. SMAD2 es un factor crítico de transcripción aguas abajo del TGF-β. La ubiquitinación mediada por SMURF2 de SMURF2 la dirige para su degradación proteasomal, ajustando así la intensidad de señalización del TGF-β28. Este estudio delimita y compara dos métodos de lisis celular para medir los niveles de ubiquitinación en células de mamíferos, utilizando SMURF2/SMAD2 como modelo. Aquí, la sobreexpresión de proteínas en células HEK293T se indujo mediante transfección transitoria con plásmidos HA-Ub, FLAG-SMAD2 y MYC-SMURF2. Las células se lisaron utilizando el método del baño de hielo y el método de tratamiento térmico, respectivamente. Las proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis por Western blot. Descubrimos que tanto el método del baño de hielo como el método de tratamiento térmico pueden utilizarse para detectar niveles de ubiquitinación, y que el método de tratamiento térmico podría facilitar la detección de la ubiquitinación de SMAD2. Este protocolo ofrece una nueva alternativa para detectar proteínas ubiquitinadas. Además, para ciertas proteínas del sustrato fuertemente asociadas con la ubiquitinación, el método de tratamiento térmico logra una mejor eficiencia en la lisis de proteínas, facilitando así la detección de la ubiquitinación.
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Protocolo
1. Preparación del tampón de lisis y los reactivos
NOTA: Prepara todos los tampones en las concentraciones indicadas. Sigue las instrucciones del fabricante para los polvos reactivos y así evitar discrepancias de concentración.
- Preparar un tampón de lisis que contenga 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0) y 1% de Triton X-100. Ajusta la concentración de NaCl entre 50-150 mM si es necesario. Prepara todos los tampones usando H₂O doble destilado.
- Prepara la solución operativa suplementando el tampón de lisis con un cóctel inhibidor de proteasas al 1% (sin EDTA). Mezcla bien y déjalo en hielo hasta que lo uses.
- Prepare SDS al 10% disolviendo 1 g de polvo SDS en 10 mL de PBS. Mezcla hasta que esté completamente disuelto. Guárdalo a temperatura ambiente.
- Preparar 5× tampón de carga proteica que contenga 250 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% de glicerol, 0,5% azul de bromofenol y 5% de β-mercaptoetanol. Disuelva los componentes en H2Odestilado doblemente. Mezcle bien antes de usar.
NOTA: Manejar SDS y β-mercaptoetanol en una campana extractora mientras se lleva el equipo de protección adecuado. Eliminar materiales contaminados según las directrices institucionales sobre residuos químicos.
2. Preparación de las células
- Mantener HEK293T células en DMEM de alta glucosa suplementadas con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ en condiciones estériles. Las células del pasaje están aproximadamente en un 90% de confluencia.
- Células semilla en placas de 6 pozos a 5 × 10⁵ celdas por pozo. Agrupar celdas de dos pozos para generar una muestra.
- Prepara mezclas de transfección para representar el 10% del volumen total del cultivo y utiliza la ubiquitinación SMAD2 como modelo experimental. Combinar 1 μg de plásmido HA-Ub, 1 μg de plásmido FLAG-SMAD2 y 0,5 μg de plásmido vector vacío o MYC-SMURF2 en 100 μL de DMEM sin suero. En un tubo separado, diluir 3,75 μL de reactivo de transfección en 100 μL de DMEM sin suero. Añade la mezcla de reactivos gota a gota a la solución de plásmido, incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y distribuye uniformemente sobre las células.
- Sustituye el medio de transfección tras 6-8 horas por 2 mL de DMEM completo y fresco por pozo. Incubar células durante 48 horas.
- Trata las células con 5 μM de MG132 durante 12 horas antes de la extracción.
NOTA: Manipula MG132 en un armario de bioseguridad usando guantes. Eliminar los materiales contaminados según los procedimientos de seguridad institucionales.
3. Recogida de celdas
- Cosechar células con una confluencia del 90-100% (~3 × 10⁶ células). Aspira el medio y lava cada pozo con 1 mL de PBS preenfriado. Elimina PBS por completo.
- Añade 1 mL de PBS a cada pozo y resuspende suavemente las células. Transfiere la suspensión a un tubo de 1,5 mL y colócala sobre hielo.
- Centrifuga a 380 × g durante 5 minutos a 4 °C. Retira el sobrenadante y conserva el pellet.
4. Preparación de cuentas de agarosa
- Transfiere 50 μL de perlas de agarosa de proteína A/G por muestra a un nuevo tubo. Lava las perlas 3 veces con 1 mL de tampón para lisis. Centrifugar a 100 × g durante 1 minuto a 4 °C entre lavados.
- Elimina el tampón residual sin alterar el perdigón. Añade 100 μL de solución activa y 5 μL de anticuerpo anti-FLAG. Incuba durante 6 horas a 4 °C con una rotación suave.
5. Lisis celular
- Método del baño de hielo
- Añade 500 μL de solución de trabajo preenfriada al pellet. Incuba sobre hielo durante 30 minutos.
- Sonica a 2 W usando ciclos de 4 s encendido/4 s apagado para cinco repeticiones. Mantén las muestras en hielo durante la sonicación. Devolver las muestras al hielo durante el resto de la incubación.
NOTA: Para interacciones proteicas débiles, reduce la concentración de NaCl a 50-75 mM y omite la sonicación.
- Método de tratamiento térmico
- Añade 45 μL de solución de trabajo al pellet. Añade 5 μL de SDS al 10% mientras mezclas de forma continua.
- Avísame brevemente y calienta a 95 °C hasta que la suspensión se vuelve transparente y completamente licuada. Invierte intermitentemente para asegurar una desnaturalización uniforme.
- Añade 450 μL de solución de trabajo. Sonica a 2 W usando ciclos de 4 s encendido/4 s apagado durante cinco repeticiones mientras mantienes las muestras en hielo.
NOTA: Asegúrese de que la concentración final de SDS se mantenga <0,1%. Confirmar la lisis completa verificando la desaparición del pellet visible y la claridad uniforme de la solución.
6. Inmunoprecipitación y detección de ubiquitinación
- La centrifugadora lisa a 13.680 × g durante 15 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Reserva 60 μL de lisato y añade 15 μL de buffer de carga de 5×. Calienta a 95 °C durante 15 minutos y etiqueta como entrada.
- Añadir 100 μL de perlas acopladas a anticuerpos al lisado restante (volumen final 540 μL). Incubar a 4 °C durante 8-12 horas con rotación.
- Centrifuga las perlas a 100 × g durante 1 minuto a 4 °C y descarta el sobrenadante. Lava las cuentas 3 veces con tampón de lisis. Añade 75 μL de buffer de carga de SDS 1× y calienta a 95 °C durante 15 minutos para eluir proteínas. Etiquétalo como IP.
- Detectar proteínas ubiquitinadas mediante western blot según un protocolo estándar JoVE.
NOTA: Consulte el protocolode western blot 29 para procedimientos detallados de transferencia y detección. Las manchas sin recortar de longitud completa con marcadores de peso molecular se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
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Resultados
Como "mensajero molecular" en la vía de señalización TGF-β, SMAD2, tras ser fosforilado por los receptores TGF-β, forma un complejo con SMAD3 y SMAD4, se transloca al núcleo e inicia la transcripción de los genes diana30 posteriores. Por tanto, es una molécula clave que vincula las señales extracelulares con la expresión génica intracelular. Su degradación está mediada por SMURF2, una ligasa E3 de ubiquitina que cataliza la poliubiquitinación de la proteína objeti...
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Discusión
Este estudio presenta y compara dos protocolos detallados de lisis proteica específicamente optimizados para detectar la ubiquitinación del sustrato mediada por ligasa E3. Para garantizar la detectabilidad, utilizamos sobreexpresión basada en plásmidos (por ejemplo, etiquetada como SMAD2, SMURF2 o Ub) en células, lo que proporcionó niveles suficientes de proteínas para visualizar señales específicas de ubiquitinación, críticas para validar las interacciones ligasa-sustrato E3 en este est...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, números 82370647 (W.H.), números 82170642 (J-X. Z), nº 81801923 (X-F. Z), nºs 81670575 (J-X. Z), Núms.81570570 (W.H.) y Núms. 81070355 (J-X. Z), y el Programa del Equipo Juvenil Académico de la Frontera de HUST, Universidad de Ciencia y Tecnología Huazhong (2018QYTD02). La Fundación Abierta de Hubei: Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa e Investigación Traslacional Multidisciplinar (2022zsyx003). Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2024YFA1107601).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microtubo de 1,5 mL | Servicebio | EP-150-M | |
| Plato cultivado tratado con TC de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| Disco de 6 pozos | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticuerpos anti-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | dilución usada 1:200 para IP, 1:10000 para WB |
| Anticuerpos anti-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | Dilución usada 1:10000 |
| Anticuerpos anti-HA | Proteintech | 51064-2-AP | Dilución usada 1:10000 |
| Anticuerpos anti-IgG | CST | #3900 | dilución usada 1:200 para IP |
| Anticuerpos anti-MYC | Proteintech | 60003-2-IG | Dilución usada 1:10000 |
| Anticuerpos anti-SMAD2 | CST | #5339 | dilución usada 1:200 para IP 1:2000 para WB |
| Azul de bromofenol | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glicerol | Sinopharm | 10010618 | |
| Baño seco de calefacción/refrigeración | Guocheng | ||
| HEK293T Células | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM de glucosa alta | Servicebio | G4515-500ML | |
| Cadena ligera IgG anti-ratón conjugada con HRP y nbsp; | Abclonal | AS062 | Dilución usada 1:5000 |
| Cadena ligera IgG anti-Conejo conjugada con HRP y nbsp; | Abclonal | AS061 | Dilución usada 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdín | M421264 | |
| Microcentrífuga | Labgic | CF1524R | |
| Polvo de NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Para la expresión en mamíferos | ||
| pCMV-HA-Ub | Para la expresión en mamíferos | ||
| pCMV-MYC | Para la expresión en mamíferos | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Para la expresión en mamíferos | ||
| Penicilina-estreptomicina | Servicebio | G4003-100ML | |
| Cóctel inhibidor de proteasas sin EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Cuentas de agarosa de proteína A/G | Beyotime | P2017 | |
| Membrana PVDF | Vayzme | E801 | |
| Polvo SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Sistema SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Celda de Uibra | ||
| Polvo Tris-HCl | Biotopado | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100 ml | |
| Tripsina | Servicebio | G4021-100ML | |
| Mezclador de vórtice | Donado amablemente por Vayzme | ||
| β-mercaptoetanol | Aladdín | M301573 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
