Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Summary

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Abstract

Los ARN potenciadores (eARN) son transcritos no codificantes producidos a partir de regiones potenciadoras activas en la transcripción y cada vez se reconocen más como reguladores clave de la expresión génica. A pesar de su importancia funcional, la estabilidad y la dinámica de degradación del ARNe siguen siendo poco caracterizadas, especialmente en células madre embrionarias (ESC), donde los programas transcripcionales son altamente dinámicos y dependientes del contexto. Este protocolo presenta un método cuantitativo para evaluar la cinética de decaimiento y la vida media de ARNe-eRNA intergénicos e intragénicos en CECs de ratón. La transcripción se inhibe usando Actinomicina D y el ARN total se recoge en múltiples puntos temporales definidos. El ADNcDNA se sintetiza utilizando tanto hexámeros aleatorios como cebadores de oligo(dT) para permitir la detección tanto de transcritos poliadenilados como no poliadenilados. Para los ARNe intergénicos, la normalización se realiza utilizando un gen de mantenimiento o el valor de Ct en el tiempo 0 min. Para los eARNs intragénicos, se emplea un enfoque de doble normalización para minimizar la interferencia de pre-ARNm superpuesto. Las curvas de decaimiento se analizan utilizando un modelo de desintegración exponencial monofásica, lo que permite una estimación precisa de la vida media. El protocolo revela que los eARN en los mESC presentan una rápida renovación, con una vida media de aproximadamente 2-3 minutos. Esta metodología proporciona un marco robusto y reproducible para estudiar la estabilidad del ARNe, ofreciendo información sobre la actividad potenciadora y la dinámica del ARN en contextos de células madre pluripotentes.

Introduction

Los potenciadores son elementos cis-reguladores (CRE) que regulan la expresión génica específica de tejidos y estímulos, sirviendo como plataformas de unión para factores de transcripción y^{co-reguladores} 1,2,3,4,5,6. Aunque los potenciadores pueden localizarse alejados de sus genes objetivo a nivel genómico lineal, los mecanismos de bucle de cromatina permiten la proximidad espacial a los promotores, facilitando la regulación tran....

Protocol

Todos los experimentos de este estudio se realizaron utilizando células madre embrionarias de ratón (mESC; E14Tg2A) que no se generaron directamente en nuestro laboratorio pero se obtuvieron de una línea celular establecida, que también está disponible comercialmente a través del ATCC (CRL-1821). Por lo tanto, el trabajo descrito en este artículo no requiere revisión del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) en la Universidad Nacional de Chungnam. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular de mESCs

1. Pre-recubr....

Results

Para evaluar la estabilidad del ARN tras la parada transcripcional, se trataron a los mESCs con actD y se recogió ARN total en momentos definidos (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min y 30 min). Tras la síntesis de ADNc, se realizó RT-qPCR para cuantificar el eRNA intragénico de Nsun2 y Sox2, el eRNA intergénico de Pou5f1 y sus respectivos ARNm. Estos datos se utilizaron para generar curvas de degradación dependientes del tiempo.......

Discussion

Este protocolo describe un método fiable y reproducible para medir la estabilidad del ARNe-e-e-en en los mESC. Pasos experimentales críticos, incluyendo cultivo celular, tratamiento con actinomicina D, extracción de ARN y cuantificación RT-qPCR, están claramente ilustrados en las figuras y archivos complementarios para guiar a los usuarios durante el flujo de trabajo. Además, se proporcionan procedimientos analíticos detallados como el modelado de regresión no lineal e interpretación de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanol	Gibco	21985023
Actinomicina D	Sigma-Aldrich	A9415
cloroformo	Productos químicos de Daejung	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow' s Medio Esencial Mínimo (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (versión 9)	GraphPad Software
Isopropanol	Productos químicos de Daejung	5035-4105
Reemplazo del suero KnockOut (KOSR)	Gibco,	10828028
Factor inhibidor de la leucemia (LIF)	Merck	ESG1106
Solución de aminoácidos no esenciales (MnEA) de MEM	Welgene	LS005
Kit de síntesis de ADNcDNA M-MLV	Enzimomática	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Penicilina-estreptomicina	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix	Biosistemas Aplicados	4368708
Sistema de PCR en tiempo real QuanStudio1	Biosistemas Aplicados	A40425
Piruvato de sodio	Welgene	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018