Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Summary

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Abstract

Los ARN potenciadores (eARN) son transcritos no codificantes producidos a partir de regiones potenciadoras activas en la transcripción y cada vez se reconocen más como reguladores clave de la expresión génica. A pesar de su importancia funcional, la estabilidad y la dinámica de degradación del ARNe siguen siendo poco caracterizadas, especialmente en células madre embrionarias (ESC), donde los programas transcripcionales son altamente dinámicos y dependientes del contexto. Este protocolo presenta un método cuantitativo para evaluar la cinética de decaimiento y la vida media de ARNe-eRNA intergénicos e intragénicos en CECs de ratón. La transcripción se inhibe usando Actinomicina D y el ARN total se recoge en múltiples puntos temporales definidos. El ADNcDNA se sintetiza utilizando tanto hexámeros aleatorios como cebadores de oligo(dT) para permitir la detección tanto de transcritos poliadenilados como no poliadenilados. Para los ARNe intergénicos, la normalización se realiza utilizando un gen de mantenimiento o el valor de Ct en el tiempo 0 min. Para los eARNs intragénicos, se emplea un enfoque de doble normalización para minimizar la interferencia de pre-ARNm superpuesto. Las curvas de decaimiento se analizan utilizando un modelo de desintegración exponencial monofásica, lo que permite una estimación precisa de la vida media. El protocolo revela que los eARN en los mESC presentan una rápida renovación, con una vida media de aproximadamente 2-3 minutos. Esta metodología proporciona un marco robusto y reproducible para estudiar la estabilidad del ARNe, ofreciendo información sobre la actividad potenciadora y la dinámica del ARN en contextos de células madre pluripotentes.

Introduction

Los potenciadores son elementos cis-reguladores (CRE) que regulan la expresión génica específica de tejidos y estímulos, sirviendo como plataformas de unión para factores de transcripción y^{co-reguladores} 1,2,3,4,5,6. Aunque los potenciadores pueden localizarse alejados de sus genes objetivo a nivel genómico lineal, los mecanismos de bucle de cromatina permiten la proximidad espacial a los promotores, facilitando la regulación transcripcional. Los potenciadores activos son transcritos bidireccionalmente por la ARN polimerasa II (Pol II), produciendo ARN largos no codificantes conocidos como ARN potenciadores (eRNAs), que normalmente tienen una longitud mediana de aproximadamente 1 kb 1,2,7,8,9. La expresión de los eRNAs está fuertemente correlacionada con la activación de los genes objetivo^cercanos 10,11,12, y los estudios funcionales han demostrado de forma consistente que la disminución de los eRNAs reduce la transcripción de sus genes objetivo, lo que sugiere que los eRNAs actúan como reguladores funcionales más que como subproductos transcripcionales 13,14,15,16,17. A pesar de su importancia funcional, los protocolos experimentales para detectar y cuantificar de forma fiable los eRNAs siguen siendo limitados.

En las células madre, la actividad potenciadora desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la pluripotencia y en la promoción de transiciones del^{desarrollo 18,19}. Los potenciadores pueden residir en regiones intergénicas (potenciadores intergénicos o extragénicos) o estar incrustados en cuerpos génicos como potenciadores^{intragénicos 8}. Aunque los potenciadores intergénicos han sido estudiados extensamente en varios tipos celulares, los potenciadores intragénicos siguen siendo relativamente poco explorados debido a desafíos técnicos, como la superposición transcripcional con los pre-ARNm del gen del huésped y la presencia de modificaciones de histonas asociadas con la elongación transcripcional^20,21. No obstante, estudios recientes han demostrado que tanto los potenciadores intergénicos como los intragénicos contribuyen a las redes reguladoras génicas implicadas en la pluripotencia^22,23 y la diferenciación^{temprana 24} en los ESC. Cabe destacar que casi la mitad de todos los potenciadores anotados son^{intragénicos 20,25}, y su actividad varía según las etapas del desarrollo, aumentando a menudo en tejidos^{diferenciados} 8,26,27,28. Sin embargo, la prevalencia y el papel funcional de los potenciadores intragénicos en los ESCs siguen siendo incompletamente comprendidos. En particular, mientras que los eARN intergénicos se transcriben entre genes, los eARN intragénicos se transcriben dentro de los cuerpos génicos y pueden solaparse con los transcritos pre-ARNm. Esta diferencia posicional requiere enfoques analíticos distintos a la hora de interpretar y cuantificar ARNeRNs intergénicos e intragénicos.

A diferencia de los ARNm, los ARNeM suelen carecer de cola poli(A) de 3′, lo que resulta en baja estabilidad y rápida^{degradación 1,2,7,8,9}. Esta inestabilidad intrínseca dificulta el análisis de la expresión de eRNA, especialmente en experimentos de curso temporal. En las neuronas, se ha informado que los eRNAs presentan una vida media tan corta como 7,5 min¹⁷. Sin embargo, sigue sin estar claro si esta inestabilidad es consistente entre diferentes tipos celulares, especialmente en las ESCs, donde tanto la actividad potenciadora como la transcripción de ARNeE son altamente específicas de cada^{tipo celular} 7,17,29,30. Los ESCs dependen de programas dinámicos de regulación génica para mantener la pluripotencia o iniciar la diferenciación, lo que los convierte en un sistema único para examinar la renovación de^ARNe. Dadas las rápidas variaciones transcripcionales en las ESCs, comprender la desintegración del ARNeM en este contexto puede revelar cómo la actividad potenciadora está regulada^{temporalmente 17}. Además, las diferencias entre los ARNe intergénicos e intragénicos, como la superposición con los transcritos génicos del huésped, requieren enfoques analíticos^{distintos 20}. A pesar de la importancia de estas cuestiones, existen pocos métodos estandarizados para medir la vida media del eRNA en los ECs o para comparar la dinámica de desintegración de diferentes tipos de eRNA.

Este estudio presenta un protocolo cuantitativo para evaluar la estabilidad y la vida media de los ARNe transcritos a partir de potenciadores intergénicos e intragénicos en los mESC. La inhibición transcripcional se logra utilizando actinomicina D (ActD) en intervalos de tiempo definidos, seguido de análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) y regresión no lineal para cuantificar la desintegración del eRNA. Para abordar las diferencias posicionales entre potenciadores intergénicos e intragénicos, el método incorpora estrategias de normalización distintas, lo que permite una comparación sistemática y precisa de la dinámica de degradación del ARNe. Este marco analítico estructurado proporciona valiosas perspectivas sobre la renovación del ARNe en células madre pluripotentes.

Protocol

Todos los experimentos de este estudio se realizaron utilizando células madre embrionarias de ratón (mESC; E14Tg2A) que no se generaron directamente en nuestro laboratorio pero se obtuvieron de una línea celular establecida, que también está disponible comercialmente a través del ATCC (CRL-1821). Por lo tanto, el trabajo descrito en este artículo no requiere revisión del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) en la Universidad Nacional de Chungnam. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular de mESCs

1. Pre-recubre placas de cultivo celular de 6 pozos con gelatina al 0,1% (2 mL por pozo). Incuba las placas a 37 °C durante 10 minutos.
2. Aspira la gelatina y lava cada pozo una vez con 1 mL de PBS. Esteriliza las placas con irradiación UV durante al menos 15 minutos.
3. Semilla los mESCs sobre las placas recubiertas de gelatina utilizando 2 mL completos de medio de cultivo celular (Tabla 1).
   NOTA: Añadir LIF fresco al medio de cultivo a la concentración requerida justo antes de su uso, en función del volumen total del medio necesario para el experimento.

Componentes	Concentración final	Volumen utilizado
El Medio Esencial Mínimo (GMEM) de Glasgow	-	500 mL
Reemplazo del suero KnockOut™ (KOSR)	10%	50 mL
Penicilina-estreptomicina	0.50%	2,5 mL
Suero fetal bovino (FBS)	1%	5 mL
Piruvato de sodio	0,1 mM / 1 %	5 mL
Solución de aminoácidos no esenciales (MnEA) de MEM	0,1 mM/ 1 %	5 mL
2-mercaptoetanol	0,1 mM	910 uL
Factor inhibidor de la leucemia (LIF)	1000 U/mL	-

Tabla 1: Composición del medio de cultivo mESC. Componentes y sus concentraciones finales utilizados para preparar el medio de cultivo mESC. Los volúmenes típicos se indican por cada 500 mL de medio total.

4. Mantener las células bajo condiciones estándar de cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de_CO2 (Figura 1A).

Figura 1: Diseño experimental para el análisis de estabilidad de eRNA. (A) Esquema del experimento de arresto transcripcional. Las células se emplacaron en placas de 6 pozos recubiertas al 0,1% de gelatina y trataron con actD (concentración final: 5 μg/mL) en los momentos indicados (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min y 30 min) después de la cosecha. (B) Disposición del ensayo RT-qPCR. El ARN total se transcribía inversamente utilizando cebadores hexameros aleatorios o de oligo(dT). Se analizaron muestras de cDNA de cada punto temporal usando RT-qPCR para los objetivos indicados: Tbp_mRNA, eRNA intergénico y eRNA intragénico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Tratamiento con Actinomicina D (ActD)

1. Disolver actD en DMSO para preparar una solución de reserva a una concentración de 1 mg/mL³³.
   NOTA: Aunque la Actinomicina D se utiliza aquí para la inhibición transcripcional a corto plazo, también pueden emplearse inhibidores alternativos como el triptolido para bloquear la iniciación de la transcripción en futuros estudios. Como tanto la Actinomicina D como la DMSO son fotosensibles, prepara la solución original en microtubos ámbar, protégela de la luz y guárdala a -20 °C hasta su uso.
2. Dos días después de la siembra de las células (o el día de la cosecha), añadir la solución de stock actD al medio de cultivo hasta una concentración final de 5 μg/mL³³. Recoge muestras a 0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 y 30 min después del tratamiento (Figura 1A).
   NOTA: Aunque la mayoría de los eRNAs presentan una rápida desintegración en el rango de 0 a 30 minutos, algunos eARN pueden mostrar vidas medias más largas. Dependiendo de las características del locus objetivo, se puede incluir muestreo adicional en puntos de tiempo extendidos (por ejemplo, 1 h, 3 h o 6 h) para capturar con mayor precisión la cinética de desintegración. En este estudio, se utilizó Actinomicina D a una concentración de 5 μg/mL para un bloqueo transcripcional a corto plazo (≤30 min); sin embargo, para incubaciones más largas (>1 h), se recomienda reducir la concentración a 1-2 μg/mL para minimizar las respuestas al estrés celular. Dado que el propio DMSO puede afectar la actividad transcripcional, también debe incluirse un control solo para DMSO.

3. Extracción de ARN y síntesis de ADNc

1. Retira el medio de cultivo celular por succión y añade 1 mL de reactivo de trizol a cada pozo. Incuba las placas en un agitador durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT)^34,35, luego transfiere el lisado a un nuevo tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Tras el tratamiento con TriZol, las muestras pueden almacenarse a -80 °C hasta una semana antes de la extracción de ARN. Como el reactivo de TRIzol contiene fenol e isotiocianato de guanidinio, que son altamente tóxicos y corrosivos, maneja la prueba con mucho cuidado. Todos los residuos de Trizol deben recogerse en un recipiente designado para residuos orgánicos para su correcta eliminación.
2. Añade 500 μL de cloroformo a cada muestra. Sacude vigorosamente los tubos e incuba a temperatura respiratoria durante 3 minutos.
3. Centrifugar las muestras a 13.500 × g durante 10 minutos a 4 °C.
4. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 mL que contenga un volumen igual de isopropanol. Incuba la mezcla en RT durante 10 minutos para potenciar la precipitación de ARN.
   NOTA: Transfiera cuidadosamente solo la fase acuosa superior clara para evitar la contaminación con la interfase. Para aumentar el rendimiento de ARN, incubar muestras a -20 °C durante 1 hora hasta toda la noche (O/N) tras añadir isopropanol. Para muestras de baja entrada, añadir glucógeno (10-20 μg/mL final) o GlycoBlue justo antes de añadir isopropanol para mejorar la visibilidad y la eficiencia de recuperación de los bolítidos de ARN. El isopropanol es altamente inflamable y potencialmente perjudicial para la salud humana; La inhalación de vapores o el contacto con la piel o los ojos puede causar irritación, dolor de cabeza, mareos o depresión del sistema nervioso central. Manipula con precaución y recoge todas las soluciones restantes en un recipiente aprobado para residuos orgánicos para su correcta eliminación.
5. Centrifugar las muestras de nuevo a 13.500 × g durante 10 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
6. Lava el pellet de ARN resultante con 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar a 6.800 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   NOTA: Invierte suavemente el tubo después de añadir etanol para levantar el pellet.
7. Retira el sobrenadante con cuidado y seca al aire la pellet durante 10 minutos a 42 °C. Resuspende el pellet seco en agua libre de RNasa e incuba a 55 °C durante 10 minutos.
   NOTA: Cuando la pureza del ARN es alta, el pellet blanco puede volverse translúcido durante el proceso de secado al aire. Evita secar en exceso el pellet durante más de 10 minutos, ya que el secado excesivo puede reducir la eficiencia de la resuspensión.
8. Mide la concentración y pureza del ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop.
9. Sintetiza cDNA a partir de μg de ARN utilizando el kit de síntesis de cDNA M-MLV, siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla 2).

Componentes	Volumen utilizado
Búfer RT 10x M-MLV	2 uL
dNTP	2 uL
Imprimación (Random / Olido dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
Inhibidor de la RNASA	0,5 uL
Muestra de ARN	2ug (Volumen ajustado según la concentración de la muestra de ARN)
DW	Ajuste de volumen según la concentración de la muestra de ARN (para completar el volumen final)
Volumen total	20 uL

Tabla 2: Composición de la reacción de síntesis de ADNc (transcriptasa inversa M-MLV). Volúmenes detallados y reactivos utilizados para la transcripción inversa de 2 μg de ARN total utilizando el kit de síntesis de cDNA M-MLV. El volumen de la muestra de ARN se ajustó en función de su concentración y se añadió DW libre de nucleasa para llevar el volumen final de reacción a 20 μL.

10. Incuba la reacción de ADNc a 37 °C durante 2 horas, luego inactiva la enzima a 85 °C durante 5 minutos.
    NOTA: Almacenar ADNc sintetizado a -20 °C. La concentración típica de ADNc es aproximadamente 100 ng/μL. Para detectar eARN intragénicos, sintetiza ADNc de la misma muestra de ARN utilizando cebadores hexaméricos aleatorios y cebadores oligo(dT).

4. Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)

1. Preparar una mezcla de reacción de 10 μL que contenga 15 ng de ADNc, 5 μL de mezcla master Power SYBR Green PCR, 5 pmol de cada cebador y agua destilada (DW).
   NOTA: los loci de eRNA suelen contener o estar adyacentes a secuencias repetitivas, lo que requiere un diseño cuidadoso de cebadores. Utiliza secuencias con máscara repetida para restringir regiones candidatas y verificar la especificidad de pares de cebador en todo el genoma usando BLAST. Cuando sea posible, incluye regiones de control cercanas para excluir la amplificación^{no específica 36}.
2. Realizar amplificación utilizando un sistema de PCR en tiempo real con la siguiente condición de ciclo térmico: un paso inicial de activación y desnaturalización a 50 °C durante 2 minutos y 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, y recocido, extensión y medición de fluorescencia a 60 °C durante 1 min^{34, 37} (Tabla 3).

Etapa	Paso	Temperatura (°C)	Hora	Ciclo
Hold Stage	Transcripción inversa	50	2 min	1
	Desnaturalización inicial	95	10 min	1
Etapa PCR	Desnaturalización	95	15 s	40
	Recocido/Extensión	60	1 min	40
Etapa de curva de fusión	Desnaturalización	95	15 s	1
	Recocido	60	1 min	1
	Disociación (curva de fusión)	95	15 s	1

Tabla 3: Condiciones de ciclo térmico para RT-qPCR. Condiciones resumidas de temperatura, tiempo y ciclo para transcripción inversa, qPCR de 40 ciclos (reacción de 10 μL) y análisis estándar de curvas de fusión.

3. Para la cuantificación intragénica de eARN, analiza tanto Tbp (u otro gen de control) como la región potenciadora intragénica usando cDNA sintetizado con cebadores oligo(dT). Para ARNe intergénicos, utiliza solo ADNc sintetizado con cebadores hexaméricos aleatorios (Tabla 4 y Figura 1B).
   NOTA: Ejecutar cada muestra en duplicados técnicos (dos pozos) para permitir el promediado durante el análisis de datos.

Nombre del gen	Sonda de cebador	Secuencia (5'-3')	Tamaños de amplicones
TBP	Adelante	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122 pb
	Marcha atrás	TTGCTGCTGCTGTCTTTGTT
Nsun2_mRNA	Adelante	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 pb
	Marcha atrás	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	Adelante	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 pb
	Marcha atrás	CGCCGGTTACAGAACATAC
Sox2_mRNA	Adelante	ACAGATGCAACCGATGCACC	105 pb
	Marcha atrás	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	Adelante	CCTGAGAGGTGTTTGCTTTGT	110 pb
	Marcha atrás	AGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNA	Adelante	CACTTCTCTGGGGTCTCTGG	107 BP
	Marcha atrás	CCAGGAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	Adelante	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 p.º
	Marcha atrás	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative control	Adelante	CCCCGTGTGTTTAAGAGGAATGA	88 pb
	Marcha atrás	ACTGAACAACCACTACTAGCA

Tabla 4: Secuencias de cebadores para análisis RT-qPCR. Secuencias de cebador hacia adelante y hacia atrás utilizadas para amplificación específica de cada gen objetivo en experimentos RT-qPCR. Estos cebadores estaban optimizados para asegurar una cuantificación precisa de la expresión de ARNm y ARNe.

5. Análisis de datos de estabilidad de ^{eRNA 22}

1. Analizar todos los datos utilizando el método ΔCt y normalizar los niveles relativos de eRNA a Tbp_mRNA (Archivo suplementario 1 y Figura 2A).
   NOTA: Si la diferencia de valor de Ct entre dos réplicas técnicas supera 0,5, excluya los datos de análisis posteriores. Calcular los niveles relativos de expresión génica utilizando el método ΔCt restando el valor de Ct del gen de control (por ejemplo, Tbp_mRNA) del del gen objetivo (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). La expresión relativa puede entonces calcularse como 2^-ΔCt (Archivo Suplementario 2B).
2. Para la cuantificación intragénica de eARN, normaliza los valores de expresión dividiendo los valores de cDNA sintetizado usando hexámeros aleatorios por los de cDNA sintetizado con cebadores oligo(dT).
   NOTA: Realizar todas las reacciones qPCR utilizando tres réplicas biológicas independientes (n = 3).
3. Normaliza el nivel de expresión de cada punto temporal (obtenido medianteel método ΔCt) al valor 0 min y grafica la curva de decaimiento.
   NOTA: Aunque este protocolo emplea un tratamiento corto con Actinomicina D, la exposición prolongada a inhibidores de la transcripción (por ejemplo, ActD) también puede reducir la expresión génica de mantenimiento. Para una cuantificación de mayor precisión, recomendamos añadir un ARN exógeno de spik-in (por ejemplo, ERCC) en el paso de lisis celular para corregir las variaciones en la eficiencia de extracción de ARN, la eficiencia de transcripción inversa y la precisión del pipeteo, permitiendo así una normalización más consistente entre las muestras^38,39.
4. Graficar los niveles normalizados de eRNA a lo largo del tiempo y ajustarlos usando un modelo de regresión no lineal (desintegración exponencial monofásica) en GraphPad Prism (Archivo Suplementario 3).
5. Estima la vida media del eRNA a partir de réplicas biológicas individuales.
   1. Abre GraphPad Prism y selecciona Crear > XY (Opciones: X = Números; Y = Introduce y grafica un único valor Y para cada punto).
   2. Introduce los puntos de tiempo (0, 5, 10, 15, 20 y 30 min) como valores del eje X.
   3. Enumera los nombres de las muestras en el eje Y (Grupo) e introduce el valor de dato único correspondiente para cada punto temporal.
   4. Selecciona Analizar > regresión y curvas > regresión no lineal (ajuste de curva).
   5. En la pestaña Exponencial , selecciona el modelo de decaimiento monofásico .
   6. En la hoja Tabla a Resultado , calcula la media y la desviación estándar de los valores de vida media de cada muestra usando Excel o software similar. Grafica los valores resultantes.
6. Curvas de decaimiento ajustadas con intervalos de confianza del 95%
   1. Abre GraphPad Prism y selecciona Crear > XY (Opciones: X = Números; Y = Introduce 3 valores replicados en subcolumnas lado a lado).
   2. Introduce los puntos de tiempo (0, 5, 10, 15, 20 y 30 min) como valores del eje X.
   3. Enumera los nombres de las muestras en el eje Y (Grupo) e introduce los tres valores replicados de cada muestra de ARNe en la hoja de datos correspondiente.
   4. Selecciona Analizar > regresión y curvas > regresión no lineal (ajuste de curva).
   5. En la pestaña Exponencial , selecciona el modelo de decaimiento monofásico para el análisis.
   6. En la hoja de Tabla a Resultados, extraiga los valores del intervalo de confianza (IC) del 95% obtenidos del análisis de las muestras triplicadas.
      NOTA: Utiliza la siguiente ecuación de decaimiento: Y = (Y₀ - Meseta) • ^e-kt + Meseta, donde Y es el nivel relativo de eRNA en el tiempo t, Y₀ es el nivel inicial de eRNA y k es la constante de decaimiento. No fijes la meseta a cero durante el ajuste de la curva de eRNA, ya que estudios previos muestran que el eRNA puede persistir y no degradarse completamente con el^{tiempo 17,40}. Sin embargo, fija la meseta a cero al analizar la desintegración del ARNm, siguiendo los protocolos previos^{de ARNm 41,42}. Permite que GraphPad Prism calcule automáticamente la vida media del eRNA (t₁/₂) usando la fórmula: t_1/2 = In(2)/k. Introduce el tiempo en min; Informa de los valores de vida media resultantes en mínimos.

Results

Para evaluar la estabilidad del ARN tras la parada transcripcional, se trataron a los mESCs con actD y se recogió ARN total en momentos definidos (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min y 30 min). Tras la síntesis de ADNc, se realizó RT-qPCR para cuantificar el eRNA intragénico de Nsun2 y Sox2, el eRNA intergénico de Pou5f1 y sus respectivos ARNm. Estos datos se utilizaron para generar curvas de degradación dependientes del tiempo...

Discussion

Este protocolo describe un método fiable y reproducible para medir la estabilidad del ARNe-e-e-en en los mESC. Pasos experimentales críticos, incluyendo cultivo celular, tratamiento con actinomicina D, extracción de ARN y cuantificación RT-qPCR, están claramente ilustrados en las figuras y archivos complementarios para guiar a los usuarios durante el flujo de trabajo. Además, se proporcionan procedimientos analíticos detallados como el modelado de regresión no lineal e interpretación de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanol	Gibco	21985023
Actinomicina D	Sigma-Aldrich	A9415
cloroformo	Productos químicos de Daejung	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow' s Medio Esencial Mínimo (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (versión 9)	GraphPad Software
Isopropanol	Productos químicos de Daejung	5035-4105
Reemplazo del suero KnockOut (KOSR)	Gibco,	10828028
Factor inhibidor de la leucemia (LIF)	Merck	ESG1106
Solución de aminoácidos no esenciales (MnEA) de MEM	Welgene	LS005
Kit de síntesis de ADNcDNA M-MLV	Enzimomática	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Penicilina-estreptomicina	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix	Biosistemas Aplicados	4368708
Sistema de PCR en tiempo real QuanStudio1	Biosistemas Aplicados	A40425
Piruvato de sodio	Welgene	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018