Artículo de método

Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

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31 de octubre de 2025

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1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un sistema episomal no integrador basado en CRISPR/dCas9 para la edición epigenética dirigida en células K562, combinando efectores dCas9-DNMT3A y dCas9-HDAC1 con sgRNAs específicos para inducir la metilación del ADN específica del locus con precisión y efectos fuera del objetivo reducidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigar el papel preciso de la metilación del ADN en la regulación transcripcional de genes y desarrollar terapias dirigidas a patrones específicos de metilación de genes presenta desafíos significativos debido a la escasez de herramientas versátiles capaces de inducir modificaciones epigenéticas específicas del sitio y a largo plazo para modular la expresión génica. El estudio tuvo como objetivo desarrollar y validar un sistema innovador basado en episodios para facilitar la metilación estable del ADN en un locus genético objetivo, potencialmente útil tanto para la investigación epigenética básica como para aplicaciones terapéuticas. Para lograr esto, la línea celular K562 se cotransfectó con dos vectores episomales distintos. Ambos tipos de vectores fueron diseñados para expresar ARN guía (ARNg) dirigidos a una región no metilada de 367 pb dentro de la isla CpG 326, ubicada aguas arriba del gen ZBTB7A . Cada vector codificaba una forma desactivada de endonucleasa Cas9 (muerta o dCas9) fusionada con el dominio catalítico de la ADN metiltransferasa DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) o la histona desacetilasa de longitud completa HDAC1 (dCas-HDAC1). La secuencia dCas incluyó dos señales de localización nuclear (NLS) para garantizar la importación nuclear de la proteína. Este casete de expresión de doble sistema promueve un estado de cromatina potencialmente propicio para el silenciamiento epigenético a largo plazo, prometiendo resultados epigenéticos robustos y duraderos. Este enfoque intermedio del epigenoma del huésped mediante la utilización de vectores episomales autorreplicantes ofrece varias ventajas: mantenimiento y expresión de vectores con un bajo número de copias a lo largo de múltiples divisiones celulares sin integración en el genoma del huésped, minimizando así los efectos fuera del objetivo y preservando la integridad del genoma. Informamos del aumento preciso y significativo de la metilación del ADN en la isla ZBTB7A CpG 326 objetivo. Los hallazgos validan que los sistemas episomales CRISPR / dCas diseñados pueden provocar una metilación duradera del ADN específica del sitio. Por lo tanto, este sistema es una valiosa herramienta de investigación para evaluar los efectos funcionales de los cambios de metilación dirigidos y una plataforma prometedora para desarrollar futuros tratamientos epigenéticos.

Introducción

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La regulación epigenética, incluida la metilación del ADN y las modificaciones de histonas, juega un papel fundamental en el control de la expresión génica, la diferenciación celular y la estabilidad del genoma. La desregulación de estos mecanismos a menudo está involucrada, ya sea como causa o consecuencia, en varios estados patológicos, particularmente en el cáncer, los trastornos neurológicos y los síndromes de impronta 1,2,3. En particular, al intervenir con precisión en el panorama epigenético en loci genómicos específicos utilizando la tecnología de edición del epigenoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), se pueden lograr niveles de represión génica comparables a los observados en modelos knock-out de genes, sin alterar la secuencia de ADN subyacente4. Como resultado, la edición epigenética dirigida ha surgido como una estrategia prometedora para diseccionar los mecanismos reguladores de genes y desarrollar terapias de precisión.

Los inhibidores de la metiltransferasa del ADN (DNMT) y los inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) son terapias epigenéticas actualmente aprobadas para uso clínico. Sin embargo, estos agentes se dirigen de forma no selectiva a marcadores epigenéticos en todo el genoma, alterando los estados globales de la cromatina, causando efectos fuera del objetivo y toxicidad en los pacientes5. Para abordar las limitaciones de los agentes de alteración epigenética tradicionales, se han desarrollado editores epigenéticos programables basados en Cas9 catalíticamente muerta (dCas9) fusionada con dominios efectores, como metiltransferasas de ADN (p. ej., DNMT3A), desmetilasas (p. ej., TET1), histonas acetiltransferasas (p. ej., p300) o desacetilasas (p. ej., HDAC3), 6,7,8,9 . El sistema efector dCas9 permite la modificación del epigenoma específico del locus guiada por una pequeña molécula de ARN, conocida como ARN de guía única (sgRNA), sin introducir roturas bicatenarias en la secuencia diana. Estudios recientes han demostrado su uso en la modificación de la expresión génica, la remodelación de la accesibilidad a la cromatina e incluso la reprogramación de fenotipos celulares 10,11,12.

A pesar de los rápidos avances, los sistemas de ingeniería del epigenoma basados en dCas9 continúan enfrentando algunas limitaciones. El desafío más común son los efectos fuera del objetivo debido a la falta de especificidad de los dominios efectores epigenéticos, especialmente con la expresión fuerte o prolongada de las herramientas de fusión dCas913,14. Además, el gran tamaño de las fusiones de dCas9 presenta importantes desafíos de entrega. El tamaño de la secuencia Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) es de aproximadamente 4,2 kb15, que es comparable al tamaño de capacidad máxima de los vectores de virus adenoasociados (AAV). Si bien los vectores lentivirales tienen una capacidad relativamente grande (~ 12-1 kb), lo que permite la administración de SpCas9 de longitud completa fusionada con efectores epigenéticos, aún conservan la posibilidad de integración genómica aleatoria, lo que corre el riesgo de mutagénesis insercional y limita sus aplicaciones clínicas16. Por otro lado, los enfoques no virales, como la transfección de plásmidos, sufren de una retención deficiente en las células en división. Los enfoques de administración transitorios o de "golpe y fuga" excluyen la posibilidad de integración genómica, pero a menudo no logran mantener los cambios de metilación a través de las divisiones celulares, a menos que se combinen con remodeladores de cromatina o efectores cooperativos 17,18,19.

Para abordar estos desafíos, empleamos un sistema de vectores episomales autorreplicantes no integradores (pEPI-S / MAR) para administrar efectores epigenéticos fusionados con dCas9. Este vector persiste extracromosómicamente en células en división con un número bajo de copias (~ 1-2 por célula), lo que permite una expresión sostenida pero moderada, con el fin de minimizar las funciones no deseadas asociadas con la sobreexpresión20,21. El elemento Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR) del episoma interactúa con la matriz nuclear, contribuyendo al mantenimiento estable del episoma en el núcleo de las células durante la división celular22,23. Además, el sistema de vectores pEPI evita los riesgos asociados con la integración viral y permite la entrega de construcciones sin exceder los límites de empaque.

Estudios recientes han demostrado que las regiones promotoras marcadas por modificaciones activas de histonas, particularmente la acetilación de H3K27 (H3K27ac), a menudo son resistentes a la metilación del ADN diseñada. Se ha demostrado que los enfoques combinatorios que eliminan o agregan marcas de histonas utilizando escritores o borradores de modificaciones de histonas e introducen simultáneamente la metilación del ADN a través de DNMT3A aumentan la estabilidad y la persistencia de la represión génica, incluso en enfoques transitorios19,24. Con base en estos conocimientos, planteamos la hipótesis de que la administración conjunta de dCas9-HDAC1 y dCas9-DNMT3A y la orientación a áreas genéticas vecinas promoverían la remodelación de la cromatina y facilitarían una metilación más eficiente y duradera en los elementos reguladores objetivo.

En este estudio, nuestro objetivo fue diseñar y construir un sistema capaz de entregar metilación de ADN dirigida y estable a la isla CpG 326 de ZBTB7A, una región caracterizada por una baja metilación endógena y marcas aberrantes de H3K27ac en células K562. El objetivo de este estudio fue entregar dos construcciones episomales que codifican dCas9 fusionadas con cada uno de los distintos efectores epigenéticos, junto con sgRNA, dirigidas a la región reguladora rica en CpG aguas arriba del gen ZBTB7A utilizando el sistema pEPI de baja expresión, estable y no integrador. Como se ilustra en la Figura 1, la cotransfección de células K562 con estos episomas permite el reclutamiento dual de los complejos de edición a la isla de interés CpG, donde HDAC1 elimina la acetilación de histonas locales para facilitar la metilación posterior del ADN por DNMT3A, lo que da como resultado una modificación epigenética coordinada y específica del sitio.

El sistema descrito aquí es apropiado para aplicaciones en las que la administración viral no es factible debido al tamaño de la construcción, problemas de seguridad o limitaciones de costos. Admite la clonación modular de diferentes sgRNAs y fusiones efectoras, lo que lo hace adaptable a una variedad de loci diana. Actualmente es más adecuado para estudios in vitro o preclínicos en líneas celulares que toleran la transfección de plásmidos y la selección de antibióticos. En nuestra implementación, la administración episomal en células K562 se logró utilizando reactivos a base de lipofectamina y se mantuvo bajo selección G-418.

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Protocolo

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1. Diseño de sgRNAs

  1. Identifique la isla CpG deseada o los sitios reguladores de CpG dentro de la región promotora del gen de interés utilizando un navegador del genoma (por ejemplo, el navegador del genoma UCSC). Aquí, el diseño se aplicó en la isla CpG 326 (GRCh38) del gen ZBTB7A .
  2. Diseñe ARN de guía única (sgRNA) utilizando una plataforma de diseño de sgRNA CRISPR en línea [p. ej., herramienta web CHOPCHOP (versión 3)]. Al diseñar sgRNA, siga las recomendaciones a continuación para garantizar una alta actividad en el objetivo y efectos mínimos fuera del objetivo:
    1. Seleccione la proteína SpCas9 como endonucleasa, utilizando 5'-NGG-3' como motivo adyacente al protoespaciador en el extremo 3' (PAM-3').
    2. Elija que la longitud del sgRNA sea de 20 pb (además de la secuencia PAM). Permitir coincidencias fuera del objetivo con solo tres desajustes en la secuencia del protoespaciador.
    3. Al seleccionar apuntar a una región específica del gen, elija la opción 'Promotor' y defina el rango aguas arriba (por ejemplo, de 1500 pb a 3000 pb aguas arriba para la isla CpG 326) para posicionar los sgRNA dentro de la región reguladora.
    4. Utilice puntuaciones de eficiencia en el objetivo, como las desarrolladas por Doench et al.25, para evaluar la actividad del sgRNA.
  3. Al seleccionar sgRNAs para uso experimental, tenga en cuenta los siguientes criterios:
    1. Clasifique todos los sgRNA candidatos por eficiencia para la región objetivo. Elija sgRNA en el 10-20% superior de la eficiencia prevista. Al elegir, evite los sgRNA con desajustes (MM0, MM1, MM2, MM3) en posibles sitios fuera del objetivo.
    2. Elija sgRNA que se dirijan a áreas originalmente no metiladas o débilmente metiladas para la represión transcripcional utilizando dCas9-DNMT. Para la represión transcripcional utilizando dCas9-HDAC, diríjase a regiones altamente acetiladas para aumentar la eficiencia. Utilice bases de datos en línea (por ejemplo, ChIP-Atlas) para confirmar la metilación del ADN y las marcas de acetilación de histonas en células K562 en los loci diana.
    3. Utilice múltiples sgRNA para cubrir regiones diana mayores de 100-200 pb26.
      NOTA: Las modificaciones epigenéticas (metilación y desacetilación) influyen en las regiones aguas arriba y aguas abajo del sitio de unión del sgRNA, y estos efectos pueden limitarse a períodos genómicos cortos.
    4. Elija sgRNA con un contenido de GC entre el 40% y el 80%.
      NOTA: El contenido de GC del sgRNA es importante, ya que un mayor contenido de GC mejora la estabilidad del ARN y la unión de dCas.
    5. Evite los sgRNA que contengan tramos de cuatro o más timidinas (Ts) y elija sgRNA con nucleótidos de adenina o timina ubicados cuatro bases aguas arriba del sitio PAM.
      NOTA: Cuatro o más T pueden provocar la terminación prematura de la transcripción. Los sgRNA con A o T ubicados cuatro bases aguas arriba del sitio PAM pueden exhibir una unión de dCas más fuerte.
    6. Verifique y evite los sgRNA con alta autocomplementariedad para minimizar el riesgo de formación de estructuras secundarias.
    7. Finalizar la selección de algunas secuencias de sgRNA.
      NOTA: Se diseñaron cuatro sgRNA que abarcan la isla CpG 326. Las secuencias diana de sgRNA1-4 y las posiciones diana en la isla 326 de CpG se muestran en la Tabla complementaria 1.
  4. Transforme la secuencia de sgRNA de elección (excluyendo el triplete PAM) en su complemento inverso. Agregue GATCG al extremo 5 'de la secuencia directa y G a su extremo 3', y AAAAC al extremo 5' de la secuencia complementaria inversa y C a su extremo 3'. Solicite los dos oligos finales para cada sgRNA a un proveedor de oligonucleótidos comercial.

2. Clonación

NOTA: Esta sección describe la adaptación del plásmido pEPI-1 para generar vectores episomales que transportan casetes de expresión de expresión de dCas-efector epigenético y dCas. Consulte la Figura 2 para obtener una descripción general completa del flujo de trabajo de clonación y la arquitectura vectorial. Todas las reacciones de digestión y ligadura de restricción que se describen a continuación se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante para cada enzima y reactivo utilizados, y las especificaciones de reacción se enumeran en detalle en la Tabla complementaria 2.

  1. Digestión del plásmido pEPI-1 utilizando AgeI y BspEI, que flanquean la secuencia codificante de eGFP (proteína fluorescente verde mejorada). Después de la digestión de restricción, desafile los salientes resultantes usando el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I. Ligue la columna vertebral del plásmido de extremo romo usando ADN ligasa T4 para generar el vector eliminado de eGFP.
    NOTA: La deleción del gen eGFP se realiza para reducir el tamaño total del vector. Un tamaño de vector mayor podría limitar los pasos posteriores de clonación y transfección.
  2. Obtener las secuencias codificantes para el dominio catalítico (CD) del gen DNMT3A y la longitud completa del gen HDAC1 . Agregue un codón de terminación en el extremo 3' (aguas abajo) de cada secuencia de codificación. Agregue los sitios de restricción BglII (5') y AseI (3') flanqueando las secuencias.
  3. Digestión del vector pEPI-1 con deleción de eGFP con BglII y AseI. Por separado, digiera las secuencias codificantes preparadas de DNMT3A (CD) y HDAC1 con las mismas enzimas. Realice dos reacciones de ligadura independientes:
    1. Ligue el fragmento DNMT3A (CD) en el vector digerido para generar la construcción pEPI-1-DNMT3A.
    2. Ligue el fragmento HDAC1 en el vector digerido para generar la construcción pEPI-1-HDAC1.
      NOTA: Los sitios BglII y AseI colocan los insertos aguas abajo del promotor pCMV y aguas arriba del elemento S/MAR para una expresión óptima.
  4. Transforme Escherichia coli químicamente competente (p. ej., E. coli competente NEB 5-alfa, alta eficiencia) con los productos de ligadura de cada vector por separado. Coloque las células transformadas en agar LB que contenga kanamicina (50 μg/ml) e incube durante la noche a 37 °C. Seleccione colonias positivas y aísle el ADN plasmídico utilizando el método de minipreparación de ebullición rápida27,28.
  5. Obtenga la secuencia que codifica el SpCas9 catalíticamente muerto (dCas9). Introduzca los siguientes elementos en el orden especificado:
    1. En el extremo 5': sitio de restricción de AscI, secuencia de consenso de Kozak y codón de inicio (ATG).
    2. En el extremo 3': NLS, opcionalmente una etiqueta HA, seguida de un sitio de restricción BamHI.
  6. Digestión de los vectores pEPI-1-DNMT3A y pEPI-1-HDAC1 con AscI y BamHI. Realice la misma digestión en el inserto dCas9. Ligue el fragmento dCas9 en cada vector respectivo.
    NOTA: Los sitios AscI/BamHI aseguran que dCas9 se inserte aguas arriba de DNMT3A o HDAC1, directamente aguas abajo del promotor pCMV. Asegúrese de que haya un enlazador corto o unos pocos nucleótidos entre dCas9 y el efector epigenético para mantener el marco de lectura correcto.
  7. Transforme los productos finales de ligadura en cepas de E. coli competentes de alta eficiencia con un control estricto de la expresión de plásmidos (p. ej., E. coli competente NEB 5-alfa F'Iq, alta eficiencia). Seleccione transformadores en placas de kanamicina. Prepare ADN plasmídico de alta calidad a partir de clones positivos utilizando el método de minipreparación de ebullición rápida.
  8. Secuenciar las construcciones finales de plásmidos (pEPI-1-dCas9-DNMT3A y pEPI-1-dCas9-HDAC1) mediante secuenciación de nanoporos para confirmar el ensamblaje correcto de todos los componentes, verificar el marco de lectura utilizando una herramienta de traducción en línea (p. ej., Expasy translate tool 3.0) y verificar posibles mutaciones o eventos de recombinación utilizando una herramienta de alineación en línea (p. ej., herramienta de alineación BLAST).
    NOTA: Los vectores grandes son más propensos a la recombinación y pueden acumular mutaciones. Por lo tanto, la validación exhaustiva de la secuencia es esencial.
  9. Fosforilar los grupos hidroxilo 5' de oligonucleótidos de sgRNA directos e inversos utilizando la polinucleótido quinasa T4. Hibride las dos hebras complementarias calentando la mezcla a 90 °C durante varios minutos para desnaturalizar las estructuras secundarias, luego deje enfriar gradualmente a temperatura ambiente durante la noche para un recocido completo en ADN bicatenario.
  10. Digestión del vector de expresión de sgRNA pGuide seleccionado con BamHI y Esp3I. Ligue el fragmento de sgRNA bicatenario recocido en el vector linealizado utilizando T4 DNA ligasa.
  11. Usando cebadores de PCR específicos (Tabla complementaria 3), amplifique el casete de expresión de ARNg completo que comprende (1) promotor U6, (2) secuencia de ARNg clonada y (3) andamio de ARNg. Utilice una ADN polimerasa de alta fidelidad que no genere voladizos de 3' (es decir, una polimerasa de corrección) para garantizar productos de PCR limpios y romos adecuados para la clonación posterior.
  12. Repita los pasos 2.9-2.11 para cada ARNg individual diseñado en la sección 1. Asegúrese de que cada casete de ARNg se prepare y amplifique por separado para preservar la especificidad del objetivo.
  13. Digestión de los vectores pEPI-1-dCas9-DNMT3A y pEPI-1-dCas9-HDAC1 con SacII. Desafile los extremos pegajosos usando el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I. Clone los casetes de andamio de sgRNA promotor U6 previamente amplificados en estos vectores usando T4 ligasa.
    NOTA: Durante la fase experimental se construyeron varias combinaciones de efectores de ARNg y epigenéticos (por ejemplo, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, etc.). Sin embargo, solo se llevaron a cabo dos combinaciones seleccionadas para los experimentos presentados en las secciones posteriores.
  14. Transforme los productos finales de ligadura en cepas de E. coli competentes de alta eficiencia con un control estricto de la expresión de plásmidos. Seleccione transformadores en placas de kanamicina. Prepare ADN plasmídico de alta calidad a partir de clones positivos utilizando el método de minipreparación de ebullición rápida.
  15. Secuenciar las construcciones finales de plásmidos mediante secuenciación de nanoporos, verificar el marco de lectura y verificar posibles mutaciones o eventos de recombinación.

3. Cultivo celular y transfección

  1. Mantener las células K562 en matraces de cultivo T-75 a 37 °C, en condiciones deCO2 y humedad al 5%. Use el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, solución de penicilina / estreptomicina al 1× (Pen/Strep).
  2. Preparar plásmidos para la transfección:
    1. Utilice 8 μg de ADN plasmídico total por transfección, por lo tanto, 4 μg de cada plásmido para una cotransfección de dos plásmidos. Cuantifique el ADN utilizando la absorbancia a 260 nm y luego diluya la cantidad requerida en 90 μL de agua ultrapura.
    2. Agregue 10 μL de solución de acetato de sodio 3 M y 2,5 volúmenes de etanol al 100% al ADN diluido.
    3. Mezclar bien e incubar a -20 °C durante la noche para precipitar el ADN.
      NOTA: Al cotransfectar dos plásmidos con distintas combinaciones de efectores epigenéticos de ARNg (p. ej., ARN1-dCas9-DNMT3A y ARN2-dCas9-HDAC1), se recomienda combinar ambos plásmidos en el mismo tubo de precipitación para simplificar el manejo de los procedimientos posteriores.
    4. Al día siguiente, centrifugar los tubos de precipitación de ADN a 11.000 × g durante 15 min a 4 °C.
      NOTA: Realice todos los pasos posteriores en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad, ya que esta etapa también implicará el manejo de células vivas.
    5. Deseche con cuidado el sobrenadante. Añadir 500 μl de etanol al 70 % para lavar el pellet. Centrifugar a 11.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    6. Retire el sobrenadante de etanol por completo. Deje que el gránulo se seque al aire hasta que no quede etanol visible.
    7. Vuelva a suspender bien el gránulo de ADN seco en 50 μL de DMEM. Mantenga la solución de plásmido-DMEM a 4 °C hasta su uso.
    8. Ejecute 400 ng del ADN episomal preparado (aproximadamente 2,5 μl de la solución resuspendida) en un gel de agarosa al 1% para verificar el éxito de la purificación y la integridad del ADN antes de la transfección.
  3. Preparar células:
    1. Coseche células K562 de un matraz T-75 cuando los cultivos alcancen una confluencia del 50-60% para garantizar la eficiencia de la transfección.
    2. Cuente las células con un hemocitómetro. Transfiera un volumen que contenga 2 × 105 células a una placa de cultivo de 35 mm que contenga 900 μL de DMEM sin FBS ni antibióticos.
      NOTA: Utilice DMEM sin suero para todos los pasos del procedimiento de transfección. Reanude las condiciones de cultivo del medio completo solo después de que se complete el período de incubación de la transfección.
    3. Coloque el plato en la incubadora (37 °C, 5% CO2) para mantener las células listas para la transfección.
  4. Use un kit de transfección a base de lipofectamina para la administración de plásmidos. Siga las instrucciones del fabricante para el kit específico utilizado, ajustando los volúmenes si es necesario.
    1. Agregue 3 μL de reactivo P3000 (suministrado en el kit de transfección) a la solución de plásmido-DMEM preparada. Mezclar suavemente e incubar la mezcla de reactivos plásmido-P3000 a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Agregue 5 μL de reactivo Lipofectamine 3000 (suministrado en el kit de transfección) junto con suficiente DMEM para alcanzar un volumen total de reacción de 100 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    3. Agregue la mezcla de transfección completa de 100 μL al plato de 35 mm que contiene las células. Agite suavemente el plato para dispersar la mezcla, luego regrese el plato a la incubadora.
  5. A las 24 h después de la transfección, agregue 3 ml de medio completo (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1× de pluma / estreptococo) a cada placa de 35 mm para iniciar la proliferación de células transfectadas. A las 72 horas después de la transfección, comience el procedimiento de selección agregando el antibiótico G-418 a una concentración final de 1 mg / ml.
  6. Una vez que la selección esté adecuadamente establecida y el recuento total de células supere 1 × 106, proceda a aislar clones individuales (Figura 3A) utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS):
    1. Cosechar las células por centrifugación a 300 × g durante 6 min a 25 °C. Lavar una vez con 1× solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, pH ~7,4) y centrifugar de nuevo en las mismas condiciones.
    2. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1× PBS y determine la concentración celular usando un hemocitómetro. Diluir la suspensión a 1 × 106 celdas/ml, asegurando una resuspensión completa.
    3. Configure FCS más corto al modo de una sola célula (asegura 1 célula por gota), utilizando una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos como dispositivo de recolección. Ajuste la configuración del software si es necesario, según el instrumento utilizado (Figura 3B).
    4. Controlar la población primaria en función del tamaño esperado (FSC) y la granularidad (SSC). Excluya los desechos (bajo FSC / SSC) y material altamente granular o muerto (alto SSC). Use diagramas de puntos FSC-A vs. FSC-H o SSC-A vs. SSC-H para marcar singletes.
    5. Llene previamente la placa de 96 pocillos con 100 μl de medio completo que contenga 1 mg/ml de G-418 por pocillo. Caliente la placa en la incubadora antes de clasificarla.
    6. Realice la clasificación en modo de celda única, manteniendo una velocidad de clasificación por debajo de 300 eventos por segundo para mejorar la precisión de la clasificación.
    7. Después de clasificar, inspeccione los pocillos bajo un microscopio para confirmar una célula por pocillo. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
  7. Permita que los clones unicelulares se expandan individualmente en la placa de 96 pocillos. Una vez establecido el crecimiento clonal, reduzca la concentración de G-418 a 400 μg/ml para mantener la selección.
  8. Transfiera los clones bien cultivados secuencialmente a placas de 12 pocillos, luego a matraces T-25 y finalmente T-75 según sea necesario, hasta que cada clon alcance ~ 1 × 106 células.
  9. Recoja gránulos de doble celda a intervalos regulares. Almacenar un pellet a -20 °C para la extracción de ADN genómico. Además, almacene un gránulo homogeneizado en 500 μL de reactivo Trizol a -20 °C para la extracción de ARN y la síntesis de ADNc.
    PRECAUCIÓN: El reactivo Trizol debe manipularse con precaución debido a su toxicidad y naturaleza corrosiva en una campana extractora química mientras se usa equipo de protección personal, y los materiales contaminados deben etiquetarse para la eliminación de desechos peligrosos.
  10. Extraiga ADN genómico de clones seleccionados utilizando la extracción tradicional de fenol-cloroformo, seguida de precipitación de etanol.
    PRECAUCIÓN: El fenol: cloroformo es tóxico y corrosivo, y debe manipularse en una campana extractora química mientras se usa equipo de protección personal. Deseche los desechos que contienen fenol y cloroformo como desechos químicos peligrosos.
  11. Asegúrese de que el ADN se resuspenda completamente en agua libre de nucleasas o tampón TE. Mida la concentración y la pureza del ADN con un espectrofotómetro antes de proceder a las aplicaciones posteriores.
    NOTA: Este ADN se utilizará en experimentos posteriores como PCR y pirosecuenciación para evaluar la eficiencia de la edición epigenética.
  12. Extraiga el ARN total de los gránulos celulares utilizando el reactivo Trizol, seguido de la precipitación de isopropanol29. Manipule las muestras de ARN con precaución asegurándose de que los reactivos y desechables no contengan ARNasa y mantenga las muestras a 4 °C durante el procedimiento.
    NOTA: El ARN total se utilizará para la síntesis de ADNc utilizando un kit de transcripción inversa.

4. PCR para confirmar la presencia de ambos episomas en clones

  1. Coseche aproximadamente 5 × 105 células de cada clon de cultivo, después de volver a suspender completamente las células. Centrifugar a 7.000 x g durante 3 min a 25 °C. Deseche el medio sobrenadante.
  2. Lave la celda resuspendiendo en 1× PBS. Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones.
  3. Deseche el sobrenadante, dejando un pequeño volumen, justo por encima del nivel de los gránulos. Utilice 1 μL de la suspensión celular directamente como plantilla para la PCR.
  4. Alternativamente, use 200 ng de ADN genómico purificado extraído de los clones transfectados.
    NOTA: La PCR directa de células lavadas proporciona un método de detección rápido, pero puede producir resultados variables. Para una mayor especificidad y sensibilidad, utilice ADN genómico purificado como plantilla.
  5. Prepare la mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 1.
  6. Utilice dos juegos de cebadores, con un cebador directo común dirigido a la secuencia dCas9 y cebadores inversos separados específicos para cada vector efector epigenético (Tabla complementaria 3).
  7. Siga las condiciones de ciclismo presentadas en la Tabla 2.
  8. Ejecute productos de PCR en gel de agarosa o analice con electroforesis capilar para verificar los tamaños del producto: 230 pb para el vector que contiene DNMT3A y 205 pb para el vector que contiene HDAC1 (Figura 3C). Incluya un control positivo (mezcla de ambos plásmidos a una concentración de 10-20 ng) para confirmar los tamaños de banda esperados y validar la eficiencia de la PCR. Incluya un control sin plantilla (NTC).
ReactivoConcentración/cantidad final
10× Búfer1×
Imprimación directa1 μΜ
Cebadores inversos0,5 μM
ADN200 ng
Polimerasa1,25 U
dNTP200 μM cada uno
Agua, libre de nucleasashasta 50 μL

Tabla 1: Mezcla de reacción de PCR para verificación de episomas.

PasoTemperatura, °CHoraNúmero de ciclos
Desnaturalización inicial953 minutos1
Desnaturalización9530 s30
Recocido5830 s
Extensión721 minuto
Extensión final725 minutos1

Tabla 2: Condiciones de ciclo de PCR para la verificación de episomas.

5. Análisis de pirosecuenciación dirigida

  1. Trate el ADNg (1,5 μg) extraído de clones transfectados con un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Imprimación de diseño que flanquea los sitios de CpG dentro de la región reguladora a la que se dirigen las construcciones. Utilice una herramienta de diseño de imprimación de bisulfito dedicada. Siga estas pautas de diseño:
    1. Convierta la isla CpG o la región reguladora del sitio CpG en la versión convertida de bisulfito.
    2. Diseñe un cebador directo e inverso para la amplificación por PCR del ADN convertido en bisulfito. Incluya una etiqueta de biotina en un cebador (generalmente al revés) para inmovilizar las perlas recubiertas de estreptavidina.
    3. Diseñar un cebador de secuenciación (18-25 pb) interno al producto de PCR, aguas arriba del primer CpG de interés. Como región objetivo, seleccione una ventana de 100 pb aguas arriba o aguas abajo del sitio de unión del sgRNA para evaluar posibles modificaciones epigenéticas locales.
    4. Evite los sitios CpG dentro de las secuencias de cebadores para garantizar una amplificación imparcial.
    5. Elija un par de cebadores con una puntuación de software de diseño de ensayos superior al 75 % y una calificación de calidad de "alta" (azul), lo que indica que el análisis del software no identificó ningún problema o inquietud.
      NOTA: Para secuencias de cebadores diseñadas para apuntar a la isla CpG 326, consulte la Tabla complementaria 3. Los cebadores fueron diseñados para unirse en regiones que flanquean los sitios de unión de sgRNA1 y sgRNA2, lo que permite la secuenciación de los sitios CpG que rodean los loci objetivo.
  3. Configure una reacción de PCR utilizando una ADN polimerasa de inicio en caliente de alta fidelidad optimizada para plantillas de bisulfito.
  4. Procedimiento de pirosecuenciación:
    1. Unir productos de PCR biotinilados a perlas de sepharose recubiertas de estreptavidina y aislar ADN monocatenario utilizando una estación de trabajo de pirosecuenciación.
    2. Agregue el cebador de secuenciación al ADN monocatenario en el tampón de recocido. Calentar la mezcla a 80 °C durante 2 min, luego dejar que se enfríe gradualmente a temperatura ambiente.
    3. Realice reacciones de secuenciación utilizando el instrumento de pirosecuenciación y el orden de dispensación definido durante el diseño del cebador.
  5. Análisis de datos:
    1. Utilice un software de pirosecuenciación dedicado para cuantificar el porcentaje de metilación en cada sitio de CpG.
    2. Compare los niveles de metilación entre clones transfectados y no transfectados. Evaluar la eficiencia de la edición (Figura 3D). Considere realizar una prueba t no apareada de dos colas para comparar los niveles de metilación entre los controles no tratados y cada clon transfectado en cada sitio CpG individual.

6. Síntesis de ADNc y PCR digital para el análisis de la expresión de dCas

  1. Preparar ARN total (1.100 ng por reacción) extraído de clones transfectados en 12 μL de agua libre de ARNasa. Mantenga las muestras en hielo.
  2. Ensamble la mezcla de eliminación de ADN genómico en hielo: mezcle 2 μL de tampón de eliminación de ADNg, muestra de ARN que contenga 1.100 ng de ARN total y agua libre de ARNasa hasta un volumen final de 14 μL. Incube durante 2 min a 42 °C, luego colóquelo en hielo.
  3. Prepare la mezcla maestra de transcripción inversa en hielo: mezcle 4 μL de tampón RT con 1 μL de cebadores RT y agregue 1 μL de transcriptasa inversa.
  4. Combine 14 μL de mezcla de eliminación de ADN genómico con 6 μL de mezcla maestra de transcripción inversa hasta un volumen total de reacción de 20 μL. Mezcle suavemente e incube a 42 °C durante 15 min. Inactivar la transcriptasa inversa calentándola a 95 °C durante 3 min.
    NOTA: Almacene el ADNc a -20 °C hasta su uso posterior.
  5. Diluya el ADNc de todas las muestras 1:1 con agua libre de nucleasas. Utilice el ADNc diluido para el análisis de PCR digital posterior, utilizando un sistema de PCR digital con cebadores específicos de dCas (Tabla complementaria 3):
    1. Prepare la mezcla maestra 4× y la mezcla de reacción de acuerdo con la Tabla 3. Agregue ADNc diluido a la mezcla y pipetee suavemente para garantizar una mezcla completa.
      NOTA: Configure reacciones en al menos duplicados para todos los clones. Incluir un control negativo (ADNc de células K562 no tratadas) y un NTC.
    2. Cargue 9 μL de la mezcla de reacción en cada pocillo de la placa de PCR. Configure el sistema de PCR utilizando las condiciones de ciclo presentadas en la Tabla 4.
    3. Seleccione el canal de tinte FAM para la detección e inicie la ejecución.
    4. Una vez completado, recupere las muestras y analice los datos.
      NOTA: La PCR digital informa los resultados como copias por μL de reacción.
    5. Multiplique el valor informado (copias/μL) por el volumen de reacción (10 μL) para obtener el total de copias por reacción. Divida este valor por la cantidad de ADNc en la reacción para obtener copias por ng de ADNc (equivalente a la entrada de ARN ng).
      NOTA: Si se sigue el protocolo exacto, cada muestra comienza con 1.100 ng de ARN en una reacción RT de 20 μL (55 ng/μL). Después de la dilución 1:1, la concentración de trabajo es de 27,5 ng/μL, y dado que se añade 1 μL a cada reacción de PCR, esto corresponde a 27,5 ng de ADNc (equivalente de ARN) por reacción.
Mezcla maestra (4×)
ReactivoConcentración/cantidad final
25× Tinte verde SYBR2×
5× Mezcla de PCR digital4×
Agua, libre de nucleasashasta 100 μL
Mezcla de reacción
ReactivoConcentración/cantidad final
4× Mezcla maestra1×
Imprimación directa1 μΜ
Imprimación inversa1 μΜ
ADNc (diluido)1 μl
Agua, libre de nucleasashasta 10 μL

Tabla 3: 4× Mezcla maestra y mezcla de reacción para el análisis de PCR digital de la expresión de dCas.

PasoTemperatura, °CHoraNúmero de ciclos
Desnaturalización inicial9610 minutos1
Desnaturalización965 s40
Recocido/Extensión6015 s

Tabla 4: Condiciones de ciclo para PCR digital.

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Resultados

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Para investigar si nuestras herramientas de edición epigenética dirigida podrían inducir cambios de metilación del ADN específicos del sitio en la isla ZBTB7A CpG 326, primero generamos vectores episomales que codifican dCas9 fusionados con DNMT3A (CD) o HDAC1, junto con varios sgRNA diseñados con sitios objetivo dentro de la isla CpG 326. Inicialmente cotransfectamos células K562 con combinaciones de estos plásmidos para evaluar si la administración simultánea de sgRNA y módulo...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno de los pasos más críticos de este protocolo es el diseño de sgRNAs altamente específicos. Los efectos fuera del objetivo son una limitación conocida de los sistemas de edición epigenética basados en CRISPR, que a menudo pueden surgir de la infidelidad de unión a dCas9, así como de la actividad no específica de los dominios efectores. Para minimizar esto, los sgRNAs deben diseñarse utilizando herramientas bioinformáticas que optimicen la alta actividad en el objetivo y la mínima unión...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o no financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki y Vasiliki Chondrou cuentan con el apoyo de una beca de tres años (subvención No. 80706) de la Cuenta Especial de Fondos de Investigación (ELKE) de la Universidad Abierta Helénica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mezcla digital PCR Absolute Q DNA (5x)Biosistemas AplicadosA52490
AgeI-HF NEBR3552
ASCINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
Clasificador de celdas melódicas BD FACSBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (10 mM cada una)NEBN0447
DMEM Glucosa alta con glutamina estable, con medio piruvato de sodioBiowestL0103
ADN polimerasa I, fragmento grande (de Klenow)NEBM0210
DNMT3A (CD), secuencias HDAC1IDT
DreamTaq DNA Polimerasa Termo CientíficaEP0712
EpiTectQiagen59104Kit de conversión de bisulfito  
Kit de bisulfito EpitectQiagen59104
Esp3INEBR0734
Suero fetal bovinoGibcoA5256701
Antibiótico selectivo de genética (G418 sulfato)Gibco11811031
Kit de transfección Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-alfa Competente  E. coli  (Alta eficiencia)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Competent E. coli  (Alta eficiencia)NEBC2992H
Tejido nucleoespín/nbsp;Macherey-Nagel740952.50
PBS, solución 10x pH 7,4LonzaBE17-517Q
Solución de penicilina-estreptomicina 100xBiowestL0022
Vector pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1 Saturado con 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Cebadores, sgRNAs y nbsp;Eurofins
Diseño de ensayo PyroMark  QiagenVersión 2.0Herramienta de diseño de cebador de bisulfito 
Reactivos PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Kit de PCR PyroMark  Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenEstación de trabajo de pirosecuenciación 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Software de pirosecuenciación  
Q5® ADN polimerasa de alta fidelidadNEBM0491
Kit de transcripción inversa QuantiTectQiagen205311
Kit de placas QuantStudio Absolute Q MAP16Biosistemas AplicadosA52865Sistema de PCR digital  
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, concentrado 10.000x en DMSOInvitrogenS7563
Ligasa de ADN T4NEBM0202
Polinucleótido quinasa T4NEBM0201
Reactivo de TrizolInvitrogen15596026

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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