Artículo de método

Aislamiento de protoplast de alta calidad específico para tejido para análisis unicelulares en Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 de febrero de 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un protocolo mejorado de aislamiento de protoplastos para los tejidos de raíces, hojas, tallos y flores de Arabidopsis thaliana. Utiliza pasos optimizados de digestión y purificación enzimática para minimizar el daño celular y los residuos, aumentando así el rendimiento y obteniendo protoplastos de alta calidad para métodos unicelulares, como la secuenciación de ARN unicelular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) se ha convertido en una herramienta esencial en biología vegetal para obtener información de alta resolución sobre la expresión génica específica de cada tipo celular, la dinámica del desarrollo y las respuestas específicas de los tejidos a factores ambientales. Un gran desafío técnico en la aplicación de scRNAseq a plantas es el aislamiento eficiente y reproducible de células individuales viables sin paredes celulares, representando la heterogeneidad de los tejidos vegetales. El aislamiento con protopasto, que elimina enzimáticamente la pared celular para obtener células vegetales vivas individuales, es un enfoque ampliamente utilizado para este propósito. Sin embargo, el aislamiento exitoso de protoplastos requiere una optimización cuidadosa para mantener la viabilidad celular y preservar perfiles transcriptomas específicos de cada tipo celular. Aquí presentamos un protocolo robusto y reproducible para aislar protoplastos de alta calidad de múltiples tejidos de Arabidopsis thaliana , incluyendo tejidos superficiales (hojas, tallos, flores) y tejidos radiculares. Este protocolo tiene en cuenta las propiedades fisiológicas únicas de los tipos de tejido, optimizando las condiciones digestivas enzimáticas y los pasos de purificación para asegurar un alto rendimiento y una representación amplia de diversos tipos celulares. Los protoplastos resultantes son adecuados para aplicaciones como scRNAseq, citometría de flujo (FACS) y análisis de expresión génica transitoria. Permite la generación de suspensiones unicelulares a partir de múltiples tipos de tejido. El método presentado apoya la exploración de la heterogeneidad celular y mejora la fiabilidad de los enfoques unicelulares en la investigación de plantas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) ha revolucionado la biología vegetal al permitir el análisis de la expresión génica a una resolución sin precedentes. scRNAseq proporciona información transcriptomática sobre la heterogeneidad celular, las trayectorias de desarrollo y las respuestas a estímulos ambientales con resolución específica de tipocelular 1,2,3.

A diferencia de los sistemas animales, la pared celular rígida de las plantas y la complejidad estructural de los tejidos vegetales presentan barreras significativas para el aislamiento eficiente de células individuales para el análisis transcriptómico. Entre los métodos disponibles, la eliminación enzimática de la pared celular para producir protoplastos ha surgido como un método ampliamente utilizado, desarrollado hace más de 60 años 4,5,6. A pesar de su uso generalizado, el aislamiento de protoplastos sigue siendo un procedimiento técnicamente exigente que requiere optimización específica de tejido para equilibrar el rendimiento celular, la viabilidad y un transcriptoma estable. Métodos alternativos, como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq), evitan la necesidad de digestión de la pared celular aislando el núcleo7. Sin embargo, esto tiene el coste de perder información sobre los transcritos maduros presentes en el citoplasma. Otros métodos de disociación física, como la microdisección mecánica y asistida por láser, evitan la digestión enzimática de la pared celular, pero a menudo son susceptibles a la contaminación cruzada y pueden resultar en una menor viabilidad celular y un rendimiento limitado 8,9,10.

En los últimos años se han desarrollado muchos atlas celulares vegetales, especialmente para Arabidopsis, proporcionando importantes conocimientos sobre los paisajes transcriptómicos de variostejidos 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Sin embargo, estos atlas se basan principalmente en plantas en las etapas juveniles o de plántulas, centrándose principalmente en tejidos radiculares o foliares. Los protocolos utilizados en estos estudios requieren procesos de optimización para tejidos antiguos de Arabidopsis, como hojas, flores y tallos maduros. Además, hasta el uso de estudios de secuenciación específicos por tipo celular como scRNAseq o Fluorescencia-Activated Cell Sorting (FACS) combinados con secuenciación de ARN, los cambios transcriptomas que causaba el aislamiento del protoplasto no se contabilizaroncompletamente 19.

El método presentado aquí se basa en esfuerzos previos a la vez que introduce varias mejoras críticas: tiene en cuenta la variabilidad fisiológica y anatómica entre los tejidos vegetales optimizando las concentraciones de tampón tanto para las raíces como para los tejidos sobre el suelo (hojas, tallos, flores) e incorpora pasos suaves de purificación para minimizar el daño celular y mejorar la pureza de los protoplastos. En comparación con los enfoques basados en núcleos, este método tiene el potencial de retener el transcriptoma celular completo, permitiendo obtener información de mayor resolución de moléculas maduras de ARNm presentes en el citosol. Es importante destacar que el procedimiento proporciona una alta viabilidad del protoplasto, heterogeneidad y concentraciones reproducibles entre tejidos, que van desde aproximadamente 9,8 × 103 células/mg en flores hasta 2,2 × 102 células/mg en hojas.

El objetivo general del método presentado es presentar un protocolo robusto y reproducible de aislamiento de protoplastos adaptado a múltiples tejidos de Arabidopsis thaliana, abordando una necesidad crítica de entrada de alta calidad que cubra diversos tipos celulares para estudios unicelulares en plantas.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del tampón

  1. Preparar el correspondiente buffer de aislamiento delprotoplasto 17,18 según la Tabla 1 en un tubo centrífugo de 15 mL; Amortiguador de aislamiento de protoplastos radiculares para tejido radicular o tampón de aislamiento de protoplastos de flor/tallo/hoja para tejidos sobre el suelo.
    NOTA: Cantidad aproximada de tampón de aislamiento de protoplastos necesaria para cinco plantas con flor de Arabidopsis thaliana cosechadas (etapas 11-12 con capullos florales cerrados): Raíz (~ 375 mg): 7 mL, Hoja (~930 mg): 5 mL, Tallo (~215 mg): 3 mL, Flor (~10 mg): 2 mL.
  2. Añade 2% (p/v) de celulasa RS y 1% (p/v) de Macerozima R10 fresca antes de usar el tampón de aislamiento de protoplastos de raíz/hoja. Mezcla bien aplicando el tampón de aislamiento de protoplastos en un rotador hasta que el polvo esté completamente disuelto (unos 10 minutos a 25 °C). Evita crear burbujas de aire y asegúrate de que no queden grumos de polvo dentro del amortiguador.

2. Digestión de tejidos

  1. Filtra el tampón de aislamiento del protoplasto correspondiente a través de un filtro de 0,2 μm antes de usarlo. Utiliza una placa de Petri de tamaño estándar (100 mm x 15 mm) para hojas y raíces, y una placa de Petri pequeña (30 mm x 15 mm) para pequeñas cantidades de tejidos como flores. Añade unas gotas de tampón de aislamiento de protoplastos en la placa de Petri antes de transferir los tejidos.
  2. Transfiere el papel correspondiente a la placa de Petri y córtalo en trozos más pequeños con movimientos verticales usando una cuchilla de afeitar de forma tan fina y rápida como sea posible (Figura 1A).
    NOTA: Siempre usa diferentes cuchillas y pinzas para cada muestra para evitar la contaminación cruzada. Lleva guantes protectores al manejar la cuchilla.
  3. Añadir el tampón de aislamiento restante del protoplasto en la respectiva placa de Petri para sumergir el tejido picado e incubar a 25 °C durante 1 hora. Mantén los tejidos sobre el suelo en el banco de trabajo (sin vibraciones) y transfiere los tejidos radiculares a una plataforma agitadora orbital (60 rpm).

3. Filtración

  1. Muestra de raíz tras la incubación:
    1. Utilizando una pipeta Pasteur, transfiere los protoplastos desde la placa de Petri a un colador de celdas de 40 μm colocado sobre un tubo centrífugo abierto de 50 mL preenfriado.
    2. Para extraer los protoplastos restantes, se añade exactamente el mismo volumen de solución W5 (2 mM pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM deCaCl 2, 5 mM de KCl) en la misma placa de Petri para recoger los protoplastos adheridos a la base de la placa de Petri. Transfiere los protoplastos resuspendidos en la solución W5 al mismo Colador Celar de 40 μm colocado sobre un tubo centrífugo abierto de 50 mL preenfriado.
    3. Pásalo una segunda vez por un nuevo filtro de celda de 40 μm hacia un nuevo tubo centrifugador preenfriado de 50 mL. A partir de ahora, mantén las muestras en hielo y sé muy cuidadoso al manipular los protoplastos.
  2. Muestras sobre el suelo tras la incubación:
    1. Utilizando una pipeta Pasteur, transfiere los protoplastos de la placa de Petri a un Colador de Celdas de 70 μm colocado sobre un tubo centrífugo abierto de 50 mL preenfriado.
    2. Para extraer los protoplastos restantes, se añade exactamente el mismo volumen de solución W5 (2 mM de pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM deCaCl 2, 5 mM de KCl) en la misma placa de Petri para recoger los protoplastos adheridos a la base de la placa de Petri. Transfiere los protoplastos resuspendidos en la solución W5 al mismo Colador Celar de 70 μm colocado sobre un tubo centrífugo abierto de 50 mL preenfriado. A partir de ahora, mantén las muestras en hielo y sé muy delicado con los protoplastos.

4. Lavado y purificación de ficoll

  1. Preenfría la centrífuga a 4 °C y recoge (pellet) los protoplastos durante 5 minutos a 500 × g sin frenar la centrifugadora.
  2. Muestra de raíz tras centrifugación:
    1. Descarta el sobrenadante sin alterar el pellet de protoplasto.
    2. Resuspende los protoplastos muy suavemente en un buffer de resuspensión radicular preenfriado (4 °C) de 600-700 μL (partes iguales de protoplastos de raíces, buffer de aislamiento (sin enzimas) y solución W5) usando una pipeta Pasteur o una pipeta Gilson de 1 mL con punta cortada para evitar el cizallamiento.
    3. Transfiere la suspensión a tubos preenfriados de 1,5 mL (4 °C).
  3. Muestras sobre el suelo tras centrifugación:
    1. Descarta el sobrenadante sin mover la bola.
    2. Resuspende el pellet muy suavemente en un buffer de resuspensión de flores/tallos/hojas preenfriado (4 °C) de 600-700 μL (partes iguales de buffer de aislamiento de protoplastos flor/tallo/hoja (sin enzimas) y solución W5) usando una pipeta Pasteur o una pipeta Gilson de 1 mL con punta cortada para evitar el corte de la cizalladura.
    3. Transfiere la suspensión a tubos preenfriados de 1,5 mL (4 °C).
    4. Preparar 300 μL de solución de Ficoll PM 400 al 13,3 % (p/v) en un tubo de 1,5 mL. Mezcla y déjalo en hielo.
    5. Añade la muestra de protoplasto resuspendida (600-700 μL) lentamente sobre la solución de Ficoll preparada sin tocar ni mezclar la capa de Ficoll.
    6. Centrifugar a 4 °C durante 5 minutos a 700 × g con ajuste de ruptura cero de la centrífuga.
    7. Recoge los protoplastos presentes en la capa intermedia (interfaz) junto con la fase superior (primera capa) (Figura 1B). Ten cuidado de no recoger la tercera capa inferior, que contiene Ficoll y los restos separados. Guárdalo a 4 °C hasta que se use más.

5. Recuento y control de calidad

  1. Utilice 10 μL de la solución del protoplasto para contar el número de protoplastos aislados con un hemocitómetro de Neubauer.
    OPCIONAL: Se puede añadir un tinte Evans Blue al 1% (p/v) para evaluar la viabilidad de los protoplastos (Figura 1C).
  2. Diluir la solución del protoplasto a la concentración requerida de protoplastos/mL utilizando un tampón de resuspensión preenfriado (4 °C) (explicado en el paso 4.2.2 para la raíz y en el paso 4.3.2 para tejidos sobre el suelo) del tejido correspondiente.
  3. Proceder con el experimento previsto lo más rápido posible, por ejemplo, secuenciación de ARN unicelular y/o FACS15,19.

Resultados

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Los protocolos de aislamiento de protoplastos implementados para tejidos superficiales y radiculares permiten con éxito una digestión eficiente de la pared celular y la liberación de células individuales intactas de todos los tejidos de Arabidopsis thaliana. En los tipos de tejidos probados, que incluían flores, tallos, hojas y raíces, el proceso enzimático de digestión produjo protoplastos bien separados con un número mínimo de grupos celulares no digeridos (Figura 2A-D). Los ensayos con colorante azul de Evans confirmaron que los protoplastos que mostraban morfología esférica con límites suaves de membrana plasmática son células viables (Figura 1C). Para cada tipo de tejido se contaron los protoplastos esféricos. Las flores contenían de media 97.875 ± 7.531 (9.788 celdas/mg, n = 3), tallos 119.025 ± 22.508 (550 celdas/mg, n = 4), hojas 210.483 ± 15.572 (225 células/mg, n = 3) y raíces 225.363 ± 52.561 (599 células/mg, n = 4).

Las suspensiones de protoplastos mostraron una amplia distribución de tamaños celulares y la presencia de plastidos verdes o pálidos, reflejando la heterogénea composición celular de cada tejido extraído (Figura 3A-D). Para confirmarlo, se realizó un aislamiento de protoplastos con una línea reportera YFP específica de célula compañera transgénica, y la suspensión contenía pequeños protoplastos viables con una señal YFP que representaba a las células compañeras (Figura 3E). Esto subraya que el protocolo de aislamiento de protoplastos utilizado es adecuado para células vasculares difíciles de aislar con paredes celulares rígidas.

Con el método optimizado presentado, se puede aislar un alto número de protoplastos viables con una cantidad mínima de residuos de diversos tejidos de plantas adultas. Para mejorar la purificación de muestras sobre el suelo, incluimos un paso de limpieza de cojín Ficoll para eliminar orgánulos liberados y otros restos celulares de las muestras digeridas, preservando la calidad del transcriptoma (Figura 4).

En las bibliotecas de cDNA de scRNAseq generadas a partir de los protoplastos, se detectaron transcritos de mantenimiento altamente expresados como ACTIN2 y transcritos raros/de baja expresión como el factor de transcripción homeodominio KNAT1, un marcador específico de células cambiales y meristemáticas, así como los marcadores celulares compañeros SUC2 y PARCL1, mediante ensayos específicos de PCRde cDNA 15 (Figura 5)). Esto indica una representación amplia de tipos celulares y heterogeneidad de la población de protoplastos obtenida, lo cual se confirmó aún más analizando los datos de scRNAseq producidos por este método15.

figure-results-1
Figura 1: Flujo de trabajo de los pasos de aislamiento de protoplastos. Se muestran seis pasos principales: (1) preparación del tampón, (2) digestión de tejidos, (3) filtración, (4) lavado y purificación de Ficoll, (5) recuento y control de calidad, y (6) continuación con experimentos posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imágenes de los pasos de preparación del protoplasto. (A) Imagen representativa de la etapa de corte de la muestra de hoja (Paso 2.1). La imagen superior muestra el tejido extraído con unas gotas de tampón en una placa de Petri de tamaño estándar y una cuchilla para picar. La imagen de abajo, a la izquierda, representa el tejido tras unas pocas pinceladas verticales con la cuchilla de afeitar (ver flecha). La imagen de abajo, a la derecha, representa la muestra picada, lista para el siguiente paso. (B) Imagen de un cojín de Ficoll tras centrifugación en un tubo de 1,5 mL (Paso 4.3.7). La flecha blanca indica la capa media, que contiene protoplastos. (C) Imagen representativa al microscopio de protoplastos foliares incubados en tinte Evans Blue. Barra de escala: 250 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Imágenes microscopicas de protoplastos generados. Se muestran imágenes de protoplast de cada tipo de tejido. (a) flor, (b) tallo, (c) hoja, (d) raíz. Barra de escala: 250 μm. (E) Imágenes de microscopio confocal de una línea de reporteros YFP específica de célula compañera. La primera imagen (izquierda) representa la expresión del reportero celular compañero YFP en la vasculatura foliar (color verde). La segunda imagen (derecha) representa protoplastos de células que expresan el reportero YFP (señal verde). El color púrpura/azul representa la autofluorescencia del cloroplasto. Barra de escala 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Imágenes microscopicas de protoplastos foliares antes de (A) y después de (B) limpieza de cojín de Ficoll. Barras de escala: 250 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: PCRs de control de calidad de las bibliotecas scRNAseq. Imágenes representativas en gel de PCRs de control de calidad de bibliotecas de ARNSEQ unicelular de raíz y tejido sobre el suelo. Genes probadosSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (de la A a la D, respectivamente), y para cada tejido: flor, tallo, hoja, raíz de izquierda a derecha, respectivamente. cDNA (+) se usa como control positivo, y agua como control negativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Amortiguador de Protoplasting RadicularAmortiguador de Protoplasting de Flor/Tallo/Hoja
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mMMgCl 2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 mM CaCl2CaCl2 de 10 mM
2 mM de MES pH 5,720 mM de MES pH 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Ajusta el pH a 5,5 con 1M Tris Base si es necesarioAjusta el pH a 5,5 con 1M Tris Base si es necesario

Tabla 1: Composiciones de búfer de aislamiento de protopastos. Se proporcionan recetas de tampón de aislamiento de Protoplast para raíces y tejidos de la superficie (flor, tallo, hoja).

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo optimizado para aislar protoplastos de varios tejidos de Arabidopsis fue adaptado para aplicaciones de scRNAseq, analizando todo el transcriptoma presente en el citoplasma y los núcleos. La optimización específica de los tampones por tejido y los pasos adicionales para la digestión y purificación resultaron en rendimientos robustos y reproducibles en diferentes tejidos. Específicamente, los protoplastos de flores promediaron ~98.000 células por muestra (~9.788 células por mg de tejido), los protoplastos de las flores ~119.000 células (~550 células por mg), los protoplastos foliares ~210.500 células (~225 células por mg) y los protoplastos radiculares ~225.000 células (~599 células por mg), reflejando la diversidad estructural y fisiológica de estos tejidos.

Una mejora clave en este protocolo fue el uso de un cojín basado en Ficoll en lugar de los gradientes/cojines basados en sacarosa más comúnmente usados para la purificación. A diferencia de la sacarosa, que es absorbida por las células y tiene un efecto importante sobre el transcriptoma 13,20,21, Ficoll es osmóticamente inerte e impermeable a membranas, preservando así la integridad del ARN durante el aislamiento22. Este paso también redujo el número de orgánulos libres, como los cloroplastos, provenientes de células rotas y restos celulares en la suspensión. La presencia de estos residuos puede interferir en la formación de gotas obstruyendo los canales de los dispositivos microfluídicos o provocando la presencia de más de una célula en las gotas formadas, lo que contribuye a la contaminación por ARN ambiental. Todos estos factores pueden llevar a conclusiones incorrectas o sesgos en el análisis de los datos de scRNA-seq.

Se demostró que el aislamiento de protoplastos puede alterar el transcriptoma de las célulasvegetales 2,15,16,19. Una estrategia clave en este protocolo para minimizar este artefacto es mantener los protoplastos a 4 °C (sobre hielo) tras la digestión enzimática, lo que ralentiza la actividad metabólica y de transcripción y, por tanto, reduce los cambios transcripcionales conocidos asociados al aislamiento de protoplastos. Además, es fundamental mantener el tiempo de extracción de tejido consistente entre réplicas y alinearlo con el objetivo del estudio, ya que se ha demostrado que las variaciones en el tiempo influyen tanto en los genes inducidos por protoplastos como en los transcritos regulados por la circadiana detectados en los conjuntos de datosscRNA-seq 15.

En este método, además de producir células individuales con escombros mínimos, otro punto muy importante fue mantener la heterogeneidad de los tejidos para representar potencialmente todos los tipos celulares. La diversidad en las suspensiones de protoplastos se confirmó mediante la detección de diferentes morfologías de protoplastos, incluyendo tamaños diversos y la presencia de señales de líneas reporteras específicas de tipo celular dentro de la población obtenida (Figura 2). Además, la población de protoplastos fue evaluada detectando transcritos raros y específicos de cada tipo celular, así como transcritos de mantenimiento en bibliotecas de cDNA de SCRNA-seq mediante PCR (Figura 4). Estos incluían genes marcadores raros del meristemo apical del brote y marcadores de célulascompañeras 15. La captura exitosa de estos transcritos confirma que el método presentado permite aislar diversos tipos celulares con alta integridad, convirtiéndolo en una herramienta valiosa para avanzar en la investigación unicelular en plantas. Además de scRNAseq, este método puede utilizarse para citometría de flujo, análisis de expresión génica transitoria y ensayos de regeneración vegetal.

Divulgaciones

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Los autores declararon no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este artículo forma parte de un proyecto que ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de Subvención nº 810131).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RS  de celulasa;Bioquímica de DuchefaC8003
Modelo de centrífuga 5810REppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozima R10Bioquímica de DuchefaM8002
Microcentrífuga modelo 5417REppendorfDescontinuado
Filtro de jeringuilla estéril Puradisc 30, 0,2 y micro; mCytiva10462200Denominado 0.2 & micro; Filtro m en el protocolo
Filtro de células estériles 40 y micro; m Malla de nailon y malla de nylon;Fisherbrand22363547
Colador de células estériles 70 y micro; m Malla de nailon y malla de nylon;Fisherbrand22363548

Referencias

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