Monitorización del ácido 2,4-diclorofenoxiacético en productos de abejas mediante fluorescencia superficial sólida

Summary

Este trabajo propone el desarrollo de una nueva metodología alternativa a las técnicas tradicionales para el control y monitorización del ácido 2,4-diclorofenoxicarboxílico en muestras de productos de abejas del centro y norte de Argentina.

Abstract

La salud de las abejas es esencial para la producción de miel y la polinización de cultivos. La producción de miel puede verse afectada negativamente por el uso de herbicidas, ya que las abejas pueden entrar en contacto con estos compuestos al recoger néctar y polen de las plantas tratadas, lo que puede provocar contaminación de la miel con estos residuos tóxicos. Aunque el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) está diseñado para controlar las malas hierbas de hoja ancha, puede llegar a las flores y contaminar la producción de las abejas, afectando potencialmente la salud y la calidad de vida de las abejas. Por estas razones, es importante analizar la miel periódicamente para detectar la presencia de residuos de herbicidas y, si es necesario, tomar medidas correctivas. Este trabajo propone el desarrollo de una nueva metodología alternativa a las técnicas tradicionales para el control y monitoreo del 2,4-D en muestras de productos de abejas del centro y norte de Argentina. Las muestras se acondicionaron a pH = 7,0 en presencia del tensioactivo aniónico dodecilo sulfato de sodio (SDS), filtrando los sistemas mediante papel filtro de banda azul como soporte sólido antes de determinarse por fluorescencia en fase sólida. En condiciones óptimas de trabajo, se alcanzaron límites de detección y cuantificación de 0,33 ng/L y 0,90 ng/L, respectivamente, y un rango de linealidad de 0,90 x 10³ ng/L a 1,13 x 10³ ng/L. Entre las ventajas del nuevo método se encuentran el uso de instrumentos económicos y disolventes ecológicos, la baja generación de residuos y, en consecuencia, la protección de algunos principios de la química verde.

Introduction

La salud de las abejas es esencial para la producción de miel y la polinización de cultivos. Una colonia sana depende de una gestión sanitaria integral que incluya una nutrición adecuada, medidas de higiene y prevención y tratamiento de enfermedades. La producción de miel, si se realiza de forma responsable, no perjudica a las abejas, ya que los apicultores solo extraen una pequeña parte de la miel total, dejando reservas para la colonia ^1,2.

La producción de miel puede verse afectada negativamente por el uso de herbicidas, ya que las abejas pueden entrar en contacto con estos químicos al recolectar néctar y polen de las plantas tratadas, lo que puede provocar contaminación de la miel con residuos de pesticidas. Además, algunos herbicidas, como el glifosato, pueden afectar directamente al desarrollo y comportamiento de las abejas, reduciendo su capacidad de búsqueda de alimento y desarrollo fisiológico 3,4,5,6. Aunque el herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ha sido diseñado para controlar las malas hierbas de hoja ancha, puede llegar a las flores y contaminar la miel, lo que puede afectar potencialmente la salud y la calidad de la miel ^7,8,9.

El comercio nacional e internacional de miel y otros productos abejas ha mostrado un crecimiento significativo y sostenido en los últimos años, reflejado en un aumento^{de la producción 10, 11, 12}. Según datos de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), hay cinco grandes países productores de miel en el mundo: China, Argentina, Turquía, Estados Unidos y^{Ucrania 13}. La producción apicola es de gran importancia en Argentina y crece constantemente debido a las oportunidades de exportación que han surgido en los últimos años. Las condiciones ambientales de Argentina (clima, flora, etc.) y la tecnología invertida en la producción han permitido al país posicionarse en una posición importante a nivel mundial. Por otro lado, la presencia de xenobióticos constituye un tema de preocupación y requiere vigilancia, como en otros países, ya que afecta tanto a la comercialización de la miel como a la salud de los consumidores debido a sus efectos^{tóxicos 14,15}.

El 2,4-D es un herbicida sistémico selectivo ampliamente utilizado que controla eficazmente las malas hierbas de hoja ancha actuando como una auxina sintética, provocando su crecimiento y muerte descontrolados. Se utiliza en agricultura, horticultura y silvicultura, y es especialmente útil para controlar las malas hierbas en cultivos como trigo, maíz y arroz, ya que no daña el césped ni los^{cereales 16}. El 2,4-D también puede usarse como regulador del crecimiento vegetal y está disponible en diferentes formulaciones, incluyendo sales amináticas y ésteres, para adaptarse a una variedad de aplicaciones. Las funciones 2,4-D están influenciadas por la dosis administrada y la susceptibilidad de especies y tipos de tejidos^{particulares 17,18}. Por ejemplo, el contacto con 2,4-D se ha implicado en resultados reproductivos adversos y alteraciones genéticas significativas en ratones, lo que indica un notable efecto genotóxico¹⁹.

Las abejas melíferas, como polinizadoras clave y organismos modelo para estudiar la eusocialidad, el aprendizaje y la memoria, son altamente vulnerables al envenenamiento directo por agroquímicos utilizados en^{campos 20}. La aplicación aérea de herbicidas e insecticidas durante la floración puede provocar una mortalidad significativa entre las abejas melíferas y reducir drásticamente la producción de miel. Las mezclas de pesticidas, incluso en dosis subletales, pueden desorientar a las abejas forrajeadoras, afectar su memoria y disminuir la eficiencia de la búsqueda. Esto, a su vez, debilita las colonias al reducir la acumulación de polen y néctar, lo que provoca deficiencias nutricionales. Además, se ha detectado 2,4-D en muestras de miel, y el polen y néctar contaminados pueden dispersarse entre las parejas^{de colmena 21}.

Es importante analizar periódicamente la miel en busca de residuos de herbicidas y, si es necesario, tomar medidas correctivas. Para la detección y cuantificación de contaminantes alimentarios como herbicidas, en este caso particular 2,4-D, los métodos instrumentales más utilizados son la cromatografía, a saber, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y la cromatografía de gases en tándem espectrometría de masas (GC-MS/MS⁾22,23,24,25,26 . Sin embargo, los investigadores presentan periódicamente nuevos métodos de monitorización para el 2,4-D que ofrecen ventajas sobre los métodos convencionales^{de cuantificación} 27,28,29, por ejemplo: uso de instrumentos menos costosos, simplicidad operativa, uso de menos disolventes, aplicación a muestras más complejas, entre otros.

La fluorescencia en fase sólida es una técnica versátil que, al combinar la fluorescencia molecular con métodos de extracción en fase sólida, mejora la ya alta sensibilidad inherente a la instrumentación de fluorescencia. También mejora el rango de linealidad y la selectividad al reducir o eliminar los efectos^{matriciales 30,31}.

En esta investigación, se propone y aplica una nueva metodología analítica para monitorizar y cuantificar el 2,4-D a muestras de miel y otras abejas del centro y norte de Argentina. Las muestras contienen cantidades desconocidas de 2,4-D. Lo que se sabe son las concentraciones de los niveles superañadidos, que son la concentración proporcionada por la muestra más la concentración de 2,4-D que añadimos. Este último valor es conocido y nos permite calcular la recuperación. La nueva metodología se basa en la determinación directa del analito mediante fluorescencia en fase sólida, demostrando múltiples ventajas en términos de ahorro de instrumentación, menores costes operativos y mayor protección ambiental.

Protocol

Este manuscrito no contiene estudios con participantes humanos ni animales realizados por ninguno de los autores.

Aparatos utilizados
Las mediciones espectrofluorimétricas se realizaron utilizando un espectrofluorómetro basado en PC equipado con una lámpara de xenón de 150 W. Se utilizó un portamuestras para mediciones de fluorescencia de superficies sólidas (SSF). Los parámetros utilizados para la cuantificación 2,4-D fueron los siguientes: λ_em = 580 nm, usando λ_ext = 555 nm (rendijas 3-3), usando un soporte sólido para muestras.

Muestreo y tratamiento de muestras
Este estudio sobre la producción de muestras de miel producidas en 2025 se realizó en las provincias de San Luis, San Juan, Jujuy y Salta, en la región centro-norte de Argentina. Las muestras analizadas fueron: cuatro mieles multiflorales, dos mieles de propóleo, caramelos de miel pura y caramelos hechos con una mezcla de miel, coca y propóleos, comprados a apicultores de la región. Las mieles estudiadas eran frescas, extraídas de las colmenas en menos de una semana de producción, para evitar la posible degradación del 2,4-D por diferentes mecanismos. Todas las muestras se recogieron en recipientes nuevos y estériles y se transportaron inmediatamente al laboratorio. Se almacenaban a 4-8 °C en un lugar oscuro hasta el análisis. El caramelo sólido se homogeneizaba con un mortero y un manoz; su contenido se diluyó en 5 mL de agua ultrapura, y se extrajo 0,5 μL de esa solución.

Metodología
Se añadieron alicuotas de 0,5 μL o 1 μL de 2,4-D (1,23 ng/L y 3,49 ng/L), 100 μL de muestra, 250 μL de SDS (1 x ^10-4 mol/L) y 100 μL de tampón de fosfato (1 x ^10-4 mol/L, pH=7), y el volumen de mezcla se elevó a 3 mL añadiendo agua doble destilada. La mezcla se filtraba a través del soporte sólido (filtro de papel; véase la Tabla de Materiales para más detalles). Los soportes sólidos se secaron a temperatura ambiente y luego se midió la fluorescencia superficial sólida (SSF) a λ_em = 580 nm, usando λ_ext = 555 nm (rendijas 3-3) con un soporte sólido para muestras.

Lo anterior describe el procedimiento general de la metodología desarrollada, en la que se estudió y optimizó cada parámetro, como se muestra en la sección de Resultados.

Efecto del pH y del tampón
La optimización del pH se realizó ajustando los sistemas al pH en estudio utilizando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio para llevarlos al valor requerido (pH de rango probado 5-7). Posteriormente, una vez obtenido el rango de pH más adecuado para lograr una señal analítica adecuada, se seleccionaba el buffer a utilizar.

Los tampones probados fueron fosfato, Tris y bórax, que se prepararon a una concentración de 1 x ^10-4 mol/L. Se variaba su volumen para obtener la mejor señal de intensidad de fluorescencia. Se muestran los resultados del único fosfato tampón que mejoró la intensidad de la fluorescencia, junto con su respectiva concentración óptima. Aquí, el tampón seleccionado era fosfato, y el pH = 7.

Concentración de tensioactivos
El uso de diferentes tensioactivos en la fluorescencia molecular ofrece ventajas que mejoran la determinación del analito bajo estudio. Se utilizan medios micelares para minimizar las interacciones intermoleculares entre el analito y los componentes de la matriz muestral. Además, las propiedades fotofísicas de los solutos fluorescentes pueden modificarse en el medio micelar, mejorando así la sensibilidad a la fluorescencia. Se estudió el efecto de diferentes tensioactivos (SDS y HTAB) en la cuantificación del 2,4-D mediante fluorescencia de superficie sólida (SSF). Se encontró que el tensioactivo aniónico SDS, a una concentración de 8,3 x 10⁻⁶ mol/L, aumentaba la intensidad de fluorescencia del herbicida en cuestión.

Soporte sólido
Dado que la configuración plana es energéticamente preferida en estado de fluorescencia excitada, se exploró la retención del herbicida sobre soportes sólidos. Los sistemas se filtraban a través de varios tipos de membranas, incluyendo nailon, acetato de celulosa, ésteres mezclados y papel filtro Blue-Ribbon. Las soluciones filtradas se recogieron en recipientes separados y limpios, y las membranas se secaron a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se colocaron en un soporte sólido para muestras y se registró la fluorescencia en fase sólida (SSF). Se observó una retención adecuada y selectiva en papel de filtro, por lo que este soporte se seleccionó para la determinación de la fluorescencia en fase sólida. Las soluciones filtradas también se analizaron mediante fluorescencia molecular. La ausencia del complejo 2,4-D era evidente, demostrando la retención del herbicida en el papel filtro.

Estudio de recuperación
Se añadió 2,4-D a un volumen apropiado de cada muestra estudiada (0,5 μL para las muestras de miel y 1 μL para las demás muestras analizadas), aumentando gradualmente su concentración a 1,23 ng/L y 3,49 ng/L. Se determinaron las concentraciones de analitos usando esta metodología, como media de seis réplicas (n = 6).

Estudio de precisión
Se estudió la repetibilidad del método y la precisión intradiaria mediante pruebas repetidas de muestras (n = 6) que contenían 1,23 ng/L y 3,49 ng/L de 2,4-D, y se determinó el contenido analítico utilizando la metodología. Además, se evaluó la reproducibilidad de la precisión interdía durante 7 días para los mismos sistemas.

Estudio de interferencia
Se añadieron diferentes cantidades de iones comunes a la solución de prueba que contenía 3,49 ng/L de 2,4-D, y se aplicó la metodología. Se probaron los siguientes posibles interferentes:

Concentración de la relación molar interferente/2,4-D = 1000:1:00 para Na⁺, K⁺, Cl^-,^{Fe 3+}, Cu²⁺, Cd²⁺, Sb³⁺, Mn²⁺, As³⁺, CO ^{3 2-}, SO₄^2-, Ca²⁺, Mg²⁺, NO^3-, Ni²⁺, fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, 2,4,5-T, sulfometurona-metil, glifosato y atrazina.

Concentración de la relación molar interferente/2,4-D = 500:1:00 para Zn²⁺, Co²⁺, Al³⁺, clorsulfurón, bensulfurón-metilo y triasulfurón.

Cálculo de parámetros analíticos de calidad
Los parámetros de calidad analítica son el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Estos se calcularon aplicando los siguientes pasos. El ruido de fondo se midió midiendo la respuesta de 15 muestras en blanco (muestras sin el analito) para obtener un conjunto de datos de ruido de fondo. Se calculó la desviación estándar del ruido. Esto se acepta como un valor LOD. Los límites de detección se basan en 3,3 veces las desviaciones estándar del blank (N = 15). Los límites de cuantificación se basan en 10 veces las desviaciones estándar del espacio en blanco (N = 15).

Results

Los resultados presentados a continuación indican cómo se abordó paso a paso el estudio de cada una de las variables que influyen en el procedimiento general, su optimización y las condiciones óptimas de trabajo alcanzadas.

Caracterización del espectro 2,4D
La caracterización en 2,4-D se realizó mediante espectroscopía UV-Vis y fluorescencia molecular, observando máximos de intensidad fluorescente en λ_em= 580 nm, usando λ_ext...

Discussion

El uso intensivo de herbicidas ha aumentado exponencialmente en Argentina y en el resto del mundo debido a la necesidad de satisfacer la demanda alimentaria de una población en crecimiento. Si el uso de estos productos se supervisa de forma adecuada, racional y periódica, no comprometería los beneficios esperados ni tendría efectos negativos sobre el medio ambiente en su conjunto. El 2,4-D se ha utilizado ampliamente en todo el mundo, y muchos estudios han demostrado que este herbicida i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	49083
Ácido acético/acetato	Fábrica Química Mallinckrodt & nbsp;
Papeles filtro Blue Ribbon	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	WHA1001929	2-5 & mu; m tamaño de poro y 12,5 cm de diámetro
Membrana de acetato de celulosa	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.		0,45 & mu; m tamaño de poro y 47 mm
Bromuro hexadeciltrimetilamonio (HTAB)	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	H5882
ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	1.09063
Membranas de inmovilidad (+)	Millipore, São Paulo, Brasil	HATF04700	0,45 & mu; m tamaño de poro y 47 mm
Ésteres mezclados membranas	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.		0,45 & mu; m tamaño de poro y 47 mm
Membranas de nailon y	Millipore, São Paulo, Brasil	Z290793	0,45 & mu; tamaño de poro m y diámetro de 47 mm
pHmeter (Analizador de Iones Expandibles Orion, )	Orion Research, Cambridge, MA, EE. UU.	Modelo EA 94.
Dihidrofosfato de potasio	Biopack, Buenos Aires, Argentina y nbsp;	2000168900
Ácido ftalato de potasio	Merk &Co., Inc
Dodecilo sulfato de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	11667289001
Hidróxido sódico	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	S2770
Tetraborato de sodio y nbsp;	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	221732
Espectrofluorimetría	Shimadzu	RF-5301	equipado con una lámpara de xenón de 150 W y pilas de cuarzo de 1,00 cm
Tris-(hidroximetil)-aminometano	Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.	77-86-1