Visualización de la dinámica espaciotemporal de las neuronas de la corteza somatosensorial durante la electroacupuntura utilizando imágenes in vivo con dos fotones

Summary

Este protocolo integra ventanas craneales en ratones transgénicos Thy1-GCaMP6f, electroacupuntura estandarizada e imagen de dos fotones para visualizar la dinámica del conjunto cortical a escala de milisegundos durante la estimulación, revelando la plasticidad específica de cada capa.

Abstract

Este protocolo establece un marco experimental integral para investigar la dinámica de los circuitos corticales durante la estimulación de la EA (electroacupuntura). La metodología integra tres componentes clave: implantación crónica de ventanas craneales en ratones transgénicos Thy1-GCaMP6f, estimulación EA estandarizada en el punto de acupuntura ST36 usando pulsos bifásicos a 2/100 Hz, y imagen calciosa de alta resolución con dos fotones. Este enfoque integrado permite la visualización en tiempo real de la actividad del conjunto neural en la corteza somatosensorial primaria (S1) con precisión temporal milisónica, capturando detalles previamente inaccesibles de las respuestas a nivel de red a la neuromodulación. La técnica revela con éxito patrones de activación específicos de cada capa y cambios longitudinales en la plasticidad, proporcionando conocimientos clave sobre los mecanismos corticales que subyacen a los efectos del EA. Al superar las limitaciones espaciotemporales fundamentales inherentes a la fMRI convencional y las técnicas electrofisiológicas, esta plataforma de alta resolución ofrece capacidades analíticas sin precedentes para mapear circuitos neuronales dinámicos. El diseño robusto del protocolo y sus resultados reproducibles lo hacen especialmente valioso para optimizar terapias de neuromodulación dirigidas y avanzar en nuestra comprensión de la plasticidad a nivel de circuito en respuesta a la estimulación periférica.

Introduction

La electroacupuntura, una adaptación moderna de la acupuntura tradicional que incorpora corrientes eléctricas controladas aplicadas mediante agujas en puntos específicos de acupuntura, es reconocida por modular circuitos neuronales implicados en el procesamiento del dolor, el control motor y la función autónoma. Se cree que sus efectos implican cascadas complejas de señalización iniciadas por la activación del nervio sensorial periférico (principalmente fibras Aδ y C), que conducen a la liberación de neurotransmisores (por ejemplo, opioides, serotonina, GABA) y a la posterior modulación en los niveles espinal, tronco encefálico y cortical ^1,2. Las estructuras clave implicadas incluyen las cortezas somatosensoriales. Dentro de la corteza S1, que procesa información táctil y nociceptiva, la EA probablemente influye tanto en los equilibrios inhibidores-excitadores locales como en la conectividad a largo^{alcance 3,4}. Sin embargo, la secuencia temporal precisa de activación/inhibición a través de diferentes poblaciones neuronales (por ejemplo, neuronas piramidales, interneuronas) y capas dentro de S1 durante e inmediatamente después de la estimulación EA sigue siendo en gran medida sin mapear debido a las restricciones metodológicas mencionadas^{anteriormente 5,6}. Comprender estas dinámicas en tiempo real es crucial para optimizar los parámetros de EA y predecir resultados terapéuticos.

Los métodos tradicionales para investigar los efectos neuromoduladores de la EA (electroacupuntura) sobre los circuitos corticales, como los estudios de comportamiento y análisis post-mortem, ofrecen información valiosa pero no pueden capturar la actividad neuronal en tiempo real con alta resolución espaciotemporal ^7,8. Para superar estas limitaciones, la imagen calciosa in vivo con dos fotones surge como una alternativa poderosa, que permite la visualización directa de la dinámica del conjunto neuronal durante la^{estimulación 8,9}. Esta técnica ofrece ventajas sin precedentes para estudios longitudinales crónicos, permitiendo a los investigadores observar —con resolución celular— la actividad rápida y distribuida a lo largo de las capas corticales en animales despiertos y comportados. A diferencia de la electrofisiología aguda, que ofrece alta resolución temporal pero cobertura espacial limitada, la imagen de dos fotones facilita la monitorización a gran escala de cientos o miles de neuronas simultáneamente dentro de un campo de visión^{definido 9,10}. Además, en comparación con la resonancia magnética funcional (fMRI), que destaca en la cobertura cerebral total pero opera a escalas temporales más lentas y carece de especificidad celular, la imagen de calcio con dos fotones ofrece una detección fina de la actividad de poblaciones neuronales específicas en una escala temporal relevante para procesos sinápticos y a nivel^{de circuito 11,12}. Así, la imagen de dos fotones está especialmente posicionada para salvar una brecha crítica en nuestra comprensión de cómo los estímulos de EA periféricos se traducen en patrones de activación cortical, espaciotemporalmente precisos, especialmente en regiones como la corteza somatosensorial primaria (S1). Como principal centro para el procesamiento somatosensorial (incluidas las señales de puntos de acupuntura), y dado que la EA modula robustamente su actividad, S1 representa una puerta estratégica para estudiar la dinámica de circuitos corticales inducida por la electroacupuntura.

La microscopía de barrido láser de dos fotones (2PLSM) junto con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP6, representa una herramienta revolucionaria para la neurociencia. Permite la obtención de imágenes crónicas y de alta resolución de la actividad neuronal in vivo con especificidad celular y^{subcelular 13}. Los GECIs fluorescan en proporción a los transitorios intracelulares de calcio, sirviendo como un indicador fiable de la activación^{neuronal 14}. De forma crucial, el uso de luz de excitación en el infrarrojo cercano por parte de 2PLSM proporciona una penetración de profundidad superior (cientos de micras) en comparación con la microscopía convencional, permitiendo la visualización de la actividad en capas corticales superficiales e incluso más profundas (por ejemplo, L2/3, L4, L5). Su sección óptica inherente minimiza la fluorescencia desenfocada y el daño fotográfico, lo que la hace ideal para estudios longitudinales durante las semanas o^{meses 15, 16 y 17}. Esta tecnología representa un avance revolucionario en la investigación de la EA, con el potencial de transformar fundamentalmente nuestra comprensión de la misma, ofreciendo la posibilidad de seguir la dinámica a escala milisegundo de cientos o miles de neuronas individuales simultáneamente dentro de un volumen cortical definido durante la estimulación.

Protocol

Todos los experimentos utilizaron ratones transgénicos Thy1-GCaMP6f de 8 a 12 semanas de edad^. Todos los procedimientos experimentales y protocolos de cuidado animal se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (IACUC; Número de aprobación del protocolo: 3603). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento. Un esquema del montaje experimental se muestra en la Figura 1.

1. Implantación crónica de ventanas craneales

1. Inducción anestesiática y estabilización estereotáxica
   1. Inicia la anestesia colocando al ratón Thy1-GCaMP6f de 8-12 semanas en una cámara de inducción suministrada con un 4-5% de isoflurano (vol/vol) en oxígeno 100% de grado médico a un caudal de 1 L/min.
   2. Al perder el reflejo de enderezamiento (normalmente en 2-3 minutos), transfiere al animal a una almohadilla térmica controlada por termostática (mantenida a 37 °C) integrada en un marco estereotaxico digital.
   3. Asegura el ratón usando un cono nasal que administre isoflurano entre 1,5 y 2,0% para el mantenimiento quirúrgico. Aplica pomada oftálmica (por ejemplo, pomada Puralube Vet) en ambos ojos para evitar la desecación corneal.
   4. Insertar cuidadosamente barras para los oídos no traumáticos en el meto auditivo externo, asegurando una posición simétrica sin presión excesiva que pueda causar daño tisular o rotura de la membrana^{timpánica 19}.
   5. Asegura el paladar maxilar con la pinza nasal, evitando obstrucciones de las vías respiratorias.
   6. Confirma anestesia profunda por ausencia de reflejo de retirada del pedal hasta pinzca firme en el dedo y ritmo respiratorio estable y lento (80-120 respiraciones/min). Monitoriza continuamente la temperatura central del cuerpo mediante una sonda rectal y ajusta la almohadilla térmica en consecuencia.
   7. Administrar analgesia subcutánea (s.c.) preventiva (por ejemplo, Carprofeno, 5 mg/kg) y soporte líquido (solución salina estéril, 0,5-1 mL de s.c.). Verifica parámetros fisiológicos estables (SpO₂ > 95%, respiración regular) durante toda la instalación.
2. Exposición quirúrgica del cráneo
   1. Afeita el cuero cabelludo dorsal meticulosamente con una máquina de cortar cabello eléctrica, seguida de la aplicación de una crema depilatoria química para la depilación completa. Enjuaga bien con solución salina estéril.
   2. Realizar antisepsis secuencial: Frota la piel expuesta tres veces, alternando entre hisopos de povidona-yodo (10%) y alcohol isopropílico al 70%, finalizando con una solución de gluconato de clorhexidina (2%).
   3. Utilizando tijeras microdiseccionadoras estériles y pinzas finas (Dumont #5), realiza una incisión sagital en la línea media (~15-20 mm de longitud) a través de la piel y el tejido conectivo subyacente, comenzando ~2 mm detrás de los ojos y extendiéndose hasta la unión interparietal-occipital.
   4. Utiliza pinzas microhemostáticas o cauterización bipolar (bajo ajuste) para controlar el sangrado capilar a lo largo de los márgenes de la incisión. Retrae suavemente los colgajos de la piel lateralmente usando micro-retractores curvos o suturas de seda 5-0 ancladas al manto circundante.
   5. Exponer todo el calvario dorsal, incluyendo los huesos frontal, parietal e interparietales. Utilizando una micro-cureta (#00), raspa meticulosamente el periosteo —una membrana vascular fibrosa adherida a la superficie ósea— bajo gran aumento (microscopio quirúrgico).
   6. Aplica movimientos suaves y tangenciales para evitar raspar el cráneo o dañar suturas (bregma, lambda, sagital, coronal). Consigue una superficie ósea lisa y avascular, esencial para una craneotomía precisa y la posterior unión adhesiva.
   7. Riega el campo con frecuencia con solución salina estéril, tibia (37 °C) al 0,9% para eliminar el polvo óseo y mantener la hidratación de los tejidos.
3. Segmentación estereotáxica de la región de la extremidad posterior S1
   1. Utilizando un brazo manipulador estereotáxico de alta precisión, coloca la punta de un marcador quirúrgico fino o una broca micro directamente sobre el punto de referencia anatómico bregma (la intersección de las suturas coronal y sagital). Confirma las coordenadas con visualización del microscopio (10x).
   2. Ajustar el manipulador para mover el marcador con precisión anteroposterior (AP) -1,5 mm (posterior al bregma) y mediolateral (ML) +2,0 mm (hemisferio derecho) respecto a la línea media (sutura sagital).
      NOTA: Esta ubicación corresponde al área de representación primaria de la extremidad posterior de la corteza somatosensorial (S1).
   3. Graba ligeramente una pequeña mira (<0,5 mm) sobre la superficie del hueso parietal expuesta en esta coordenada, asegurando la visibilidad sin penetrar el hueso.
   4. Verificar la ausencia de vasculaturas superficiales importantes que atraviesen el sitio señalado; si hay vasos significativos presentes, ajusta mínimamente las coordenadas ML (±0,1-0,2 mm) para evitarlos, ya que los vasos durales pueden sangrar abundantemente si se perforan y dificultar la claridad óptica.
   5. Documenta las coordenadas ajustadas finales.
4. Ejecución precisa de craneotomía
   1. Centra un punzón de biopsia estéril y desechable de 3 mm de diámetro precisamente sobre la coordenada marcada S1HL. Aplica una presión firme y constante hacia abajo mientras giras suavemente el puñetazo para marcar completamente la capa cortical exterior alrededor de la circunferencia. Quita el ponche.
   2. Utilizando un taladro microquirúrgico de alta velocidad (por ejemplo, con muebla de carburo de 0,5-0,8 mm) unido a un brazo estereotáxico bajo riego constante con solución salina al 0,9% (refrigeración y eliminación de residuos), adelgaza cuidadosamente el hueso dentro del círculo marcado.
   3. Perfora en ráfagas cortas usando un movimiento de fresado ligero y tangencial, progresando sistemáticamente desde la periferia hacia el centro. Monitoriza la translucidez ósea de cerca bajo aumento.
   4. Cesa el taladro inmediatamente al observar una apariencia sutil de "ruborizado" en la duramadre subyacente, indicando un grosor óseo mínimo (<50 μm). Cambia a micropinzas finas (Dumont #5/45) y microtijeras para levantar y pelar meticulosamente los fragmentos finos de hueso restantes, trabajando radialmente hacia afuera desde el centro.
   5. Conserva la duramadre intacta: asegúrate de que parezca translúcida y brillante, sin desgarros ni sangrados significativos. Controla cualquier sangrado dural leve de inmediato aplicando una presión suave con un pledget de espuma comprimida estéril empapado en suero o trombina al 0,9%.
   6. Riega abundantemente la dura expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) caliente y estéril o solución salina al 0,9% para eliminar todos los restos óseos. Evita la desecación^17,20.
5. Implantación crónica de ventanas craneales y fijación de barras de cabeza
   1. Prepara una cubierta circular de vidrio estéril de 3 mm de diámetro y grosor #1 (aprox. 150 μm). Opcionalmente, recubre su superficie interior con una fina capa de elastómero de silicona para mayor claridad óptica y reducción de adherencia.
   2. Coloca la capa de cobertura con precisión sobre la craneotomía usando pinzas finas. Prepara un cemento dental de curado rápido y curado ligero (por ejemplo, Metabond o Charisma) según las instrucciones del fabricante.
   3. Trabajando rápidamente (<90 s de tiempo de trabajo), aplica una fina perla de cemento alrededor del perímetro del abrigo, directamente sobre la superficie seca y limpia del cráneo. Asegúrate de que el cemento sella completamente el borde de la cubierta pero no se absorba por debajo sobre la duramadre.
   4. Cura inmediatamente el cemento usando una luz de curado dental (luz azul, 450 nm) durante 20-30 segundos por cuadrante. Refuerza el sello con varias capas de un cemento dental acrílico autocurable de 5 mL de curado más lento (por ejemplo, Jet Repair Acrylic o Paladur), construyendo una capa de cemento robusta y de perfil bajo (<2 mm de altura) que se extienda varios milímetros más allá del borde de la craneotomía hasta el cráneo circundante.
   5. Incrustar una barra de cabeza ligera y hecha a medida de acero inoxidable o titanio (por ejemplo, de 15-20 mm de largo con apertura central) en la capa de cemento durante su fase inicial de curado.
   6. Asegúrese de que la barra de la cabeza esté situada paralela a la sutura sagital y centrada sobre la ventana, proporcionando puntos de fijación rígidos y equilibrados para futuras sujeciones de cabeza bajo el microscopio sin obstruir el acceso óptico.
   7. Deja que el cemento cure completamente (≥15 minutos). Verifica la hemostasia completa y la claridad de la ventana²¹.
6. Recuperación y monitorización postoperatoria
   1. Tras el curado con cemento, suelta cuidadosamente el ratón de las barras para los oídos y la pinza nasal. Suspenda el isoflurano y administre 100% de oxígeno hasta que la respiración espontánea se reanude completamente.
   2. Administrar buprenorfina HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) inmediatamente después de la operación para analgesia. Transfiere al animal a una cámara de recuperación precalentada (30-32 °C), suplementada con oxígeno, revestida con cama de papel limpia.
   3. Monitoriza continuamente hasta que se recupere la reclinación esternal y la caminación completa (normalmente entre 30 y 60 minutos). Administrar una segunda dosis de carprofeno (5 mg/kg de c.s.) 24 horas después de la operación. Proporciona solución de Ringer lactada calentada (1 mL de s.c.) para apoyar la hidratación si es necesario.
   4. Alojar al ratón individualmente en una jaula estándar enriquecida con material de anidación para evitar que sus compañeros dañen el implante de cabeza. Mantener las condiciones ambientales (22-24 °C, 40-60% de humedad, ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h) con acceso ad libitum a alimentos e hidrogel.
   5. Vigila al ratón al menos dos veces al día durante 7 días tras la cirugía en busca de signos de dolor o malestar (postura encorvada, piloerección, reducción de actividad, pérdida de peso >15%), infección (secreción purulenta, hinchazón, enrojecimiento), déficit neurológico o aflojamiento de la barra de cabeza.
   6. Permitir un periodo mínimo de recuperación de ≥7 días antes de comenzar cualquier procedimiento experimental (imagen o EA) para asegurar la resolución de la inflamación quirúrgica aguda, la restauración del comportamiento normal y la eliminación glymphática, y la estabilización de la actividad cortical basal. Pesa al animal a diario para controlar la recuperación^22.

2. Estimulación con electroacupuntura

1. Localización anatómica precisa del punto de acupuntura ST36
   1. Apunta al punto de acupuntura ST36 ("Zusanli") basándote en los puntos anatómicos establecidos en la extremidad posterior del ratón. Antes de la inserción de la aguja, palpa la tibia anterior proximal para identificar la tuberosidad tibial, la prominente prominencia ósea situada justo distal a la articulación de la rodilla donde se inserta el ligamento rotuliano.
   2. Utilizando pinzas finas o un marcador estéril, mide 2 mm lateral (hacia la fíbula) y 2 mm caudal (posterior) en relación con el centro de la tuberosidad tibial. Esta localización corresponde al vientre del músculo tibial anterior, superficial a la rama profunda del nervio peroneo y proximal a la bifurcación de la arteria tibial anterior.
   3. Confirmar la ausencia de vasos sanguíneos superficiales importantes en el lugar mediante transiluminación si es necesario.
      NOTA: La precisión es fundamental, ya que pequeñas desviaciones (>0,5 mm) pueden alterar significativamente las estructuras neuronales estimuladas y las respuestas corticales posteriores en S1. La identificación de puntos de referencia debe realizarse de forma constante por personal capacitado para minimizar la variabilidad entre operadores^23,24.
      NOTA: Los métodos para asegurar la estabilidad de la aguja son: (i) Tras la inserción y fijación de la aguja, se permite un periodo de adaptación para que el ratón se aclimate y reduzca la dificultad inicial. (ii) La frecuencia de vibración generada por el estimulador de electroacupuntura (por ejemplo, 2 Hz) es inherentemente baja en amplitud. Además, las agujas finas utilizadas (por ejemplo, Φ0,16 mm) poseen suficiente rigidez para resistir eficazmente esta vibración mínima. (iii) Durante todo el experimento, el operador monitoriza continuamente la posición de la punta de la aguja. Los datos del ensayo se excluirán si se observa algún desplazamiento significativo causado por el movimiento del animal.
2. Técnica de inserción de agujas estériles
   1. Tras la desinfección cutánea (alternando un exfoliante al 70% de etanol y clorhexidina), insertar perpendicularmente una aguja de acupuntura estéril de acero inoxidable de un solo uso (diámetro nominal: 0,18 mm, equivalente a calibre 36; longitud: 13 mm) perpendicularmente en la piel en la coordenada marcada ST36.
   2. Avanza la aguja de forma constante a través de la piel, el tejido subcutáneo y hacia el músculo tibial anterior subyacente mediante un movimiento rotatorio suave para minimizar el trauma tisular.
      NOTA: La profundidad de inserción del objetivo es de 3 mm desde la superficie de la piel. Esta profundidad garantiza un compromiso óptimo de las aferentes musculares tipo II/III (fibras Aδ) y de fibras potencialmente somáticas de pequeño diámetro sin riesgo de contacto con la tibia subyacente o con haces neurovasculares profundos.
   3. Asegura firmemente el cubo de la aguja usando una pequeña almohadilla adhesiva estéril o un clip personalizado para evitar que se desaloje durante la estimulación eléctrica posterior y posibles movimientos sutiles de las extremidades.
   4. Verifica la colocación estable de la aguja observando una leve fasciculación muscular local y transitoria al insertarlo, un indicador fisiológico de la correcta posición intramuscular.
   5. Mantén una técnica aséptica estricta durante todo el proceso para prevenir infecciones, especialmente en paradigmas de estimulación crónica^.
3. Parametrización y administración de la estimulación por electroacupuntura
   1. Conecte el mango aislado de la aguja insertada al canal de salida del ánodo (+) de un estimulador programable de electroacupuntura (por ejemplo, HANS Acupoint Nerve Stimulator, modelo LH202).
   2. Colocar un electrodo de cátodo de referencia (-), normalmente una pequeña placa de acero inoxidable o un electrodo de clip recubierto con gel conductor, en la pata trasera ipsilateral (por ejemplo, en la superficie plantar cerca del talón).
   3. Asegurar contacto seguro y baja impedancia (<5 kΩ) en ambos sitios. Programa el estimulador para que administre pulsos de onda cuadrada bifásica (fases positivas/negativas equilibradas) para minimizar la polarización de los electrodos y el daño tisular.
   4. Configura el paradigma de estimulación en modo de dispersión densa: ráfagas alternas de 2 Hz (baja frecuencia) durante 3 s seguidas de 100 Hz (alta frecuencia) durante 3 s.
      NOTA: Este patrón combinado de frecuencia (a menudo denotado como 2/100 Hz) ha demostrado empíricamente que potencia la liberación de opioides endógenos (por ejemplo, β-endorfina, enkefalina) y monoaminas (por ejemplo, serotonina, noradrenalina) en el SNC de forma más eficaz que las frecuencias individuales por sí solas.
   5. Ajustar la intensidad actual de forma incremental a partir de 0,1 mA hasta que se observe visualmente un leve y rítmico tic de la pata (flexión de los dedos o el tobillo), que normalmente se alcanza entre 1,0 mA en ratones adultos bajo anestesia ligera. Este umbral de espasmos indica un reclutamiento suficiente de eferentes motores y aferentes de gran diámetro asociados (fibras Aβ), confirmando la activación fisiológica sin causar angustia ni luchas vigorosas. Mantén esta intensidad calibrada durante la sesión de estimulación de 20^{minutos 25,26}.
4. Controles críticos de procedimientos y monitorización fisiológica
   1. Mitigación de artefactos de estimulación
      1. Separa físicamente los cables EA del equipo de imagen/headstage.
      2. Implementa una toma de tierra robusta: Conecta el terminal de tierra del estimulador a una toma de tierra dedicada y asegúrate de que el marco del microscopio y la almohadilla térmica para animales compartan un punto de tierra común.
      3. Sincronizar temporalmente los pulsos de estimulación con la señal de borrado del microscopio si está disponible, o emplear procesamiento post-hoc para eliminar artefactos eléctricos residuales de las trazas de calcio.
   2. Estabilidad fisiológica
      1. Monitoriza continuamente la temperatura corporal central (mantenida en 37,0 ± 0,5 °C mediante una almohadilla térmica controlada por retroalimentación), la frecuencia respiratoria (80-120 respiraciones/min) y la SpO₂ (>95%) durante la sesión de 20 minutos de EA.
      2. Mantener anestesia ligera con isoflurano (1,0-1,5%) para evitar la inmovilidad durante la imagen/estimulación combinada. Observa continuamente el tic inducido de la pata; si disminuye o cesa, comprueba el contacto de la aguja y la impedancia, y ajusta ligeramente la intensidad (incrementos de ≤0,1 mA) para mantener una activación motora constante y suave.
      3. Suspende la estimulación inmediatamente si aparecen signos de malestar (por ejemplo, taquipnea, lucha intensa).
   3. Reproducibilidad
      1. Utiliza el mismo tipo de aguja, profundidad de inserción, modelo de estimulador y método de calibración (umbral de espasmo de pata) en todos los animales y sesiones. Documenta la intensidad final de estimulación utilizada para cada sujeto.
      2. Permitir un periodo mínimo de recuperación de 5 minutos tras la estimulación antes de terminar la anestesia o realizar procedimientos adicionales ^27,28.

3. Imagen de dos fotones durante EA

1. Preparación animal, fijación de la cabeza y mantenimiento fisiológico
   1. Tras ≥7 días de recuperación postquirúrgica, fija la cabeza del ratón Thy1-GCaMP6f usando la barra de cabeza implantada dentro de un aparato de fijación diseñado a medida y amortiguado por vibraciones, montado en una etapa motorizada XY.
   2. Coloca al animal cómodamente sobre una cinta cilíndrica de baja fricción lubricada con aire, permitiendo un movimiento sin restricciones de las extremidades traseras. Mantener una anestesia quirúrgica ligera mediante administración de isoflurano del 0,5-0,8% en un 100% de O₂. Este nivel reducido de isoflurano minimiza la supresión de la actividad neuronal y asegura la inmovilidad suficiente para la obtención de imágenes de alta resolución.
   3. Monitorizar y registrar continuamente la temperatura corporal central (mantenida en 37,0 ± 0,2 °C mediante una almohadilla térmica controlada por retroalimentación), la frecuencia respiratoria (100-140 respiraciones/min) y la saturación periférica de oxígeno (SpO₂ > 95%).
   4. Aplica gel oftálmico para evitar el sequeo corneal durante la imagen prolongada. Asegúrese de que el ipsilateral de la extremidad posterior a la ventana craneal S1HL esté accesible para la inserción de la aguja EA en ST36.
   5. Deja 15-20 minutos para la estabilización fisiológica tras la fijación de la cabeza antes de iniciar la imagen²⁹.
2. Orientación óptica y optimización para la imagen de capa II/III
   1. Determina con precisión el plano focal para adquirir señales neuronales de alta calidad. Sigue este procedimiento de verificación.
      1. Reducir la potencia del láser a un nivel bajo (normalmente entre el 10 y el 20% de la potencia de imagen, por ejemplo, 5-10 mW) para evitar el fotoblanqueamiento innecesario y el daño fotográfico durante la ubicación del avión.
      2. Utilizando el impulsor del eje Z del microscopio de dos fotones, mueve el objetivo lentamente en pasos de micras. Comienza en la superficie de la ventana craneal y avanza más profundamente en el tejido cerebral.
      3. En el modo de vista previa en directo , identifica el plano focal usando estos indicadores visuales descritos en los pasos 3.2.1.4 y 3.2.1.5.
      4. Para el plano focal correcto en una capa de soma neuronal: Confirma que la imagen muestra estructuras puntuadas claras, brillantes (somatas neuronales) que aparecen redondas u ovaladas con buen contraste de fondo. Asegúrate de que los límites celulares sean nítidos y muestren un aspecto distintivo de "sal y pimienta".
      5. Para un plano focal incorrecto: Si la imagen parece borrosa u homogénea sin estructuras puntuales bien definidas, reconoce que el enfoque está en una región sin somata. Si se ven sombras vasculares grandes, oscuras y no estructuradas, identifica esto como la capa de vasos sanguíneos.
   2. Verificación de la línea base de fluorescencia adecuada
      1. Confirmar una línea base de fluorescencia saludable y estable antes de aplicar cualquier estímulo experimental para asegurar una interpretación válida de las señales de calcio posteriores (ΔF/F). Realiza los pasos 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Ajusta la potencia del láser al nivel formal de imagen (por ejemplo, 30-50 mW).
      3. Adquire imágenes durante unos segundos en un modo de vista previa rápida y de baja resolución.
      4. Observa la intensidad media de fluorescencia mostrada en tiempo real (o monitoriza directamente el brillo de la imagen). Verifica que la señal se mantenga estable y no muestre signos de fotoblanqueamiento rápido antes de proceder a la adquisición experimental de datos.
   3. Centra el campo visual de imagen dentro de la ventana craneal.
      1. Aplica gel ultrasónico o agua destilada entre el objetivo y el cobertizo para el acoplamiento por inmersión. Utilizando contraste por gradiente Dodt infrarrojo o iluminación por epifluorescencia, identifica la vasculatura superficial y alinea el campo de visión (FOV) para evitar vasos superficiales grandes (>20 μm de diámetro).
      2. Cambiar al modo de excitación de dos fotones usando un láser Ti:Sapphire sintonizable con pulsos de femtosegundos. Ajusta la longitud de onda de excitación a 920 nm, óptima para excitar GCaMP6f (pico ~920 nm), minimizando la autofluorescencia verde y el daño fotográfico en comparación con longitudes de onda más cortas.
      3. Aumenta gradualmente la potencia del láser (típicamente 20-50 mW medida en la muestra) mientras se enfoca a través de la dura transparente hacia la superficie cortical (pia mater). Ajusta la posición Z del objetivo usando un dispositivo piezoeléctrico de nano-enfoque para alcanzar una profundidad de 200 ± 10 μm bajo la superficie pial, correspondiente a la capa cortical II/III.
      4. Confirmar la profundidad mediante densidad neuronal característica y morfología: una población densa de neuronas somatas piramidales pequeñas a medias (10-15 μm de diámetro) con dendritas apicales visibles.
      5. Optimizar la potencia láser y los ajustes de ganancia del tubo fotomultiplicador (PMT) para lograr una fluorescencia base de GCaMP6f fuerte (F₀) sin saturación (intensidad de píxeles ~50-70% del máximo del detector) y fondo^{mínimo 30,31}.
         NOTA: Durante la imagen, la potencia media de la luz de excitación de 920 nm se mantuvo con precisión en 30-50 mW en el objetivo. Este nivel de potencia fue validado mediante experimentos piloto en tejido animal sometido a procedimientos quirúrgicos idénticos, asegurando una adquisición efectiva de señales durante duraciones de escaneo de hasta 25 minutos, minimizando el daño fotográfico y el blanqueamiento por fluorescencia.
3. Protocolo de adquisición de calcio de alta velocidad
   1. Configura el escáner resonante para la adquisición de fotogramas a alta velocidad:
      Tamaño de fotograma: 512 × 512 píxeles (campo de visión típico: ~450 × 450 μm, tamaño de píxel ~0,88 μm)
      Tasa de fotogramas: 7 fotogramas por segundo (fps) obtenida mediante escaneo bidireccional (~14 kHz de velocidad de línea). Esta tasa muestrea adecuadamente la cinética de decaimiento GCaMP6f (τ~500 ms) mientras equilibra la relación señal-ruido (SNR) y minimiza el fotoblanqueamiento.
      Tiempo de permanencia del píxel: ~0,8 μs (optimizado para SNR a 7 Hz).
   2. Iniciar adquisición continua en time-lapse utilizando software de adquisición (por ejemplo, ScanImage, Prairie View). Registrar un periodo inicial de 5 minutos antes del inicio de la estimulación de EA para establecer la dinámica de la actividad neural (F₀) previa al estímulo.
   3. A la hora exacta t = 5 minutos, comienza la estimulación EA en ST36 mientras la imagen continúa sin interrupciones. Obtén datos de forma continua durante los 20 minutos de estimulación EA. Duración total del escaneo = 25 min (1500 s, ~10.500 fotogramas).
   4. Guardar los datos como una pila multi-TIFF o un formato binario propietario con marcas de tiempo integradas sincronizadas con pulsos de disparo EA a través de un canal de entrada TTL.
   5. Monitorizar la estabilidad de potencia del láser y la deriva de enfoque (<2 μm) en tiempo real; pausa brevemente para reenfocar solo si ocurre una deriva significativa (por ejemplo, >5 μm), señalando el punto temporal^32,33.
4. Corrección riquísmica de movimiento y registro espacial
   1. Después de la adquisición, procesa la pila de imágenes en bruto usando NoRMCorre (Corrección de Movimiento No Rígida) en MATLAB para eliminar artefactos espaciales de micromovimientos residuales (por ejemplo, respiración, pulso).
   2. Primero, divide la pila en parches espaciales superpuestos (por ejemplo, 64 × 64 píxeles, 50% de solapamiento). Para cada parche, calcula una plantilla de referencia promediando tramas de alta SNR desde el periodo base.
   3. Usando correlación cruzada basada en Fourier, calcula los desplazamientos traslacionales X-Y para cada fotograma relativo a la plantilla. Aplica estos desplazamientos mediante interpolación de subpíxeles.
   4. A continuación, abordar deformaciones no rígidas: modelar distorsiones locales dentro de parches usando transformaciones afines por partes (traslación + cizallamiento). Actualiza iterativamente la plantilla para mejorar la precisión del registro. Parámetros clave:
      max_shift: 20 píxeles (límite para traducción)
      max_dev: 3 píxeles (desviación máxima no rígida)
      bin_width: 50 fotogramas (binning temporal para actualizaciones de plantillas)
   5. Visualiza la eficacia de la corrección inspeccionando el gráfico de correlación fotograma a fotograma (debería estabilizarse cerca de 1,0 tras la corrección) y generando un mapa de diferencia de proyección media de imagen (antes frente a post-corrección). Guarda la pila corregida por movimiento para análisis posteriores. Este paso es fundamental para un análisis preciso píxel a píxel de los transitorios de calcio, especialmente durante los movimientos sutiles de las extremidades inducidos por EA.

4. Análisis de dinámica espaciotemporal

La pila de imágenes corregidas por movimiento se somete a segmentación neuronal automatizada y extracción de señales utilizando la tubería Suite2p (v0.12.3) en Python. Las etapas clave de procesamiento incluyen:

1. Identificación de huellas espaciales
   1. Aplicar la factorización de matrices no negativas restringidas (CNMF) para descomponer la pila en componentes espaciales.
   2. Inicializar regiones de interés (ROI) usando un enfoque basado en correlación: fusionar píxeles con correlación espacial cruzada > 0,7 y SNR local > 4 en ROIs candidatos. Distinguir los ROI somáticos de los dendritas/axones por tamaño (8-15 μm de diámetro) y circularidad (umbral de compacidad >0,6).
2. Corrección de la contaminación por neuropil
   1. Para cada ROI, defina un anillo neuropil concéntrico (radio interno: 1,5× radio ROI, radio externo: 2,5× radio ROI).
   2. Calcular el coeficiente neuropil (r_neuropil) mediante regresión de mínimos cuadrados:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Coeficiente validado empíricamente para ratones Thy1-GCaMP6f).
3. Deconvolución de señales
   1. Infiere la actividad de picos usando OASIS (deconvolución regularizada por l₁) con un modelo de ruido AR(2) para estimar la probabilidad de pico S(t) a partir de trazas ΔF/F:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      donde 'k' es el núcleo transitorio de calcio y ε es el ruido gaussiano.
4. Control de calidad
   1. Excluya los ROI con SNR <3, solapamiento espacial >30% o correlación neuropil >0,3. La verificación visual se realiza mediante la interfaz gráfica^{Suite2p 34}.
      Las operaciones específicas y los elementos de interfaz se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. El archivo TIFF corregido por movimiento generado arriba se alimentó directamente en la tubería Suite2p. Aunque el entorno integrado de Suite2p incluye su propia corrección de movimiento rígida, este paso interno redundante fue deshabilitado ya que se había aplicado una corrección no rígida más precisa. Los ROIs neuronales extraídos automáticamente pueden encontrarse en el Archivo Suplementario 2.

Results

Caracterización estructural de la corteza S1 y la actividad neural basal
Comenzamos estableciendo una línea base estructural y funcional de alta fidelidad para nuestros experimentos de imagen. El análisis de morfología tisular reveló diferencias estructurales discernibles entre preparaciones craneales de ventana no caplicadas (Figura 2A) y aplicadas con engobe de cobertura (Figura 2B). Aunque la aplicación de...

Discussion

Para salvar la brecha crítica en la observación de los efectos corticales de la electroacupuntura (EA) en tiempo real, presentamos un protocolo integrado integral que combina la implantación crónica de ventanas craneales para acceso óptico, la estimulación estandarizada de EA y la imagen longitudinal de calcio de dos fotones dirigida a la corteza somatosensorial primaria (S1).

Este protocolo integrado ofrece varias ventajas distintas frente a los métodos tradi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofeno	MCE	N/A	5 mg/kg para analgesia
Marco estereotáxico digital	RWD	Kopf Modelo 1900
Estimulador de electroacupuntura	HANS LH202 (pulsos bifásicos de 2/100 Hz)	N/A	HANS LH202 (pulsos bifásicos de 2/100 Hz)
Isoflurano	RWD	R510-22-10	Transportador de oxígeno de grado médico, 100%
Sistema de microtaladro	RWD		Muebla de carburo de 0,5 mm, refrigerada por solución salina
Povidona-yodo	MCE	HY-B2234	Solución del 10%
ScanImage	ScanImage	https://scanimage.org/
Suero fisiológico estéril	Beyuntian	ST341-500ml	0,9% NaCl
Microscopio quirúrgico	Zeiss	https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html	10-40 y más veces; Magnificación
Ratones transgénicos Thy1-GCaMP6f	Cygen	5523978	8-12 semanas, macho/hembra
Microscopio de dos fotones	Nikon A1MP	Nikon A1MP	Láser Ti:Zafiro (excitación de 920 nm)