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Interferometría de biocapas para investigar la unión de proteínas de membrana: TACAN Mutant y GsMTx4 como sistema modelo

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DOI:

10.3791/69348

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8 de mayo de 2026

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1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

En este artículo

Resumen

Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para optimizar y realizar experimentos de Interferometría de Biocapa (BLI) para estudiar las interacciones entre proteínas de membrana y ligandos para proteínas de membrana solubilizadas en detergente. Utilizando la interacción entre el mutante TMEM120A M207A y el inhibidor de péptidos GsMTx4 como modelo, este flujo de trabajo describe la preparación de proteínas, la carga de biosensores y la adquisición de datos cinéticos.

Resumen

La Interferometría de Biocapa (BLI) es una técnica biofísica eficiente que permite el análisis cuantitativo en tiempo real de interacciones biomoleculares. Aunque se utilizan comúnmente para proteínas solubles, su aplicación a proteínas de membrana sigue siendo un reto debido a la hidrofobia y la dependencia de detergentes. Este estudio presenta un protocolo BLI optimizado para caracterizar las interacciones entre la proteína de membrana solubilizada en detergente y el inhibidor de péptidos.

Como sistema modelo, se probó el péptido modificador de gating Grammostola mecanotoxina 4 (GsMTx4) contra el mutante multifuncional de la proteína de membrana TMEM120A M207A. La variante TMEM120A etiquetada con FLAG fue inmovilizada en biosensores anti-FLAG —que representan un sistema basado en etiquetas pero sin fluorescentes ni enzimas— y expuesta a diluciones en serie de GsMTx4 para medir las tasas de asociación y disociación.

El protocolo integra la optimización de detergentes utilizando Neopentil Glicol de Lauryl Maltosa (LMNG) y caracterización complementaria mediante fotometría de masas y fluorimetría diferencial de barrido (DSF). Este flujo de trabajo permite mediciones cinéticas fiables y es compatible con el cribado de rendimiento medio. Este enfoque puede ser aplicable a otros sistemas de membrana proteína-ligando donde se mantiene la estabilidad del detergente. En conjunto, el estudio destaca parámetros clave que influyen en la eficiencia de inmovilización y la entrega de analitos, apoyando la posible utilidad de BLI en el perfilado de inhibidores y en estudios mecanicistas de interacciones proteicas de membrana.

Introducción

Las proteínas de membrana desempeñan un papel central en procesos fisiológicos esenciales, incluyendo la transducción de señales, el transporte de iones y metabolitos, y la organización de membranas. Dada su implicación en la comunicación celular y la homeostasis, representan una proporción sustancial de los objetivos de fármacos en el desarrollo clínico. Comprender las interacciones entre proteínas de membrana y ligandos es fundamental para elucidar la función y guiar el diseño terapéutico. Sin embargo, la naturaleza anfipática de estas proteínas y su dependencia de los ambientes lipídicos presentan desafíos significativos para la purificación, estabilización y caracterización biofísica.

La resonancia plasmónica superficial (SPR) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) son técnicas ampliamente utilizadas para estudiar la cinética y la termodinámicade las interacciones membrana-proteína 1,2. Cuando se optimizan adecuadamente, ambos métodos pueden proporcionar información cuantitativa detallada, incluso para proteínas de membrana solubilizadas o reconstituidas en detergente. La termoforesis a microescala (MST) también se ha aplicado con éxito para evaluar afinidades de unión bajo condiciones cercanas a las nativas, especialmente para proteínas de membrana³. No obstante, estos enfoques pueden estar limitados por un consumo sustancial de muestras, dificultades para mantener la estabilidad de las proteínas de membrana o una compatibilidad restringida con ciertos sistemas de detergentes.

La Interferometría de Biocapa (BLI) es una técnica óptica en tiempo real que permite la medición cuantitativa de interacciones biomoleculares, incluidas aquellas que involucran proteínas de membrana solubilizadas en detergente o anfíhipol. Junto con las técnicas biofísicas mencionadas anteriormente, BLI ofrece una plataforma eficiente que permite la medición directa de la cinética de unión, incluyendo la asociación (k on), la disociación (koff) y las constantes de disociación de equilibrio (KD), con concentraciones muestrales más bajas y una adaptación sencilla a proteínas de membrana solubilizadas en detergentes o nanodiscos. También es destacable que, como todas las tecnologías biofísicas, BLI tiene sus propias limitaciones, que se mencionarán en la sección de Discusión.

BLI detecta desplazamientos en el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada por la punta de un biosensor, con cambios en el espesor óptico correspondientes a eventos de unión biomolecular. Estos desplazamientos (Δλ, en nm) se registran como sensorgramas y son proporcionales a la masa unida en la superficie del sensor. BLI se ha aplicado ampliamente a interacciones proteína-proteína y proteína-ligando (incluyendo péptidos y pequeñas moléculas) y es adecuado para rangos de afinidad que van desde nanomolares hastamicromolares 4. Su flexibilidad, bajo consumo de muestras y configuración relativamente sencilla la convierten en una herramienta potencialmente ventajosa para estudiar proteínas de membrana solubilizadas en detergente 5,6,7.

Este estudio presenta un protocolo BLI para caracterizar la interacción entre TMEM120A M207A, una proteína de membrana, y la mecanotoxina Grammostola 4 (GsMTx4), un inhibidor de péptidos. TMEM120A ha sido propuesto como un canal iónico mecanosensible implicado en la detección mecánicadel dolor 8; sin embargo, su actividad en canales iónicos sigue siendo controvertida. Múltiples estudios han reportado la ausencia de corrientes mecanosensibles cuando TMEM120A se expresa en sistemas heterólogos como HEK293 o célulasCHO 1,9,10,11. Hasta la fecha, más de cuatro estudios crio-EM han resuelto la estructura de TMEM120A en estado cerrado, y no se ha observado conformaciónabierta 1,9,10,11.

Las simulaciones de dinámica molecular y los análisis electrofisiológicos indican que la metionina 207 (M207) en TMEM120A humanos de tipo salvaje puede actuar como una barrera de acceso dentro de la vía de conduccióniónica 11. Se ha demostrado que la mutación de este residuo en alanina (M207A) aumenta la permeabilidad iónica, probablemente alterando el empaquetamiento de hélices y desplazando cadenas laterales hidrofóbicas como Phe223. En consecuencia, el mutante M207A fue seleccionado para estudios de unión con GsMTx4.

GsMTx4 es un péptido modificador de gating derivado del veneno de araña que inhibe los canales catiónicosensibles a la mecanosensibilidad. Consiste en una secuencia de 32 aminoácidos y tiene un peso molecular de 4 a 5 kDa, incluyendo canales piezoeléctricos y TRP, principalmente interactuando con la bicapa lipídica en lugar de bloquear directamente elporo 12,13. Estudios previos han demostrado que GsMTx4 reduce la actividad TMEM120A en sistemas bicapasartificiales 8. En los ensayos BLI, el mutante M207A TMEM120A fue inmovilizado en biosensores anti-FLAG y expuesto a concentraciones crecientes de GsMTx4, lo que permitió medir las tasas de asociación (kactivadas) y disociación (kdesactivadas).

Este trabajo proporciona un protocolo detallado para la optimización de detergentes y el análisis cinético utilizando la Interferometría de Biocapa (BLI). Aunque BLI presenta algunas limitaciones, como posibles artefactos derivados de la sobrecarga de sensores o efectos de transporte de masa y una menor idoneidad para interacciones rápidas de tasa de asociación (kon), es un método útil para estudiar las interacciones de membrana entre proteínas y ligandos bajo condiciones controladas de solubilización en detergente. El protocolo es adecuado para sistemas con afinidades de unión de moderadas a bajas (típicamente en el rango nanomolar a micromolar) y puede adaptarse a otros objetivos hidrofóbicos cuando se aplican los controles y condiciones de tampón apropiados.

Protocolo

1. Purificación de proteínas y optimización de muestras

  1. Cultivo celular y transfección
    1. Cultivar células de suspensión HEK293T/SF17 en un medio sin suero suplementado con 20 mM de L-glutamina en una incubadora agitada ajustada a 120 RPM, 37 °C, 80% de humedad y 8% de CO₂. Mantener las células pasando hasta el paso cinco; permiten que las células alcancen una densidad de aproximadamente 5 × 10⁶ celdas/mL.
    2. Transfecte las células con el plásmido TMEM120A M207A (N-terminal FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) en el vector pCDNA3.1 utilizando un reactivo comercial de transfección según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de Materiales).
    3. Las células transfectadas en pellet por centrifugación a 5.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Guarda la cápsula a -80 °C hasta la purificación.
  2. Lisis y solubilización celular (Figura 1)
    1. Resuspender un pellet de 30 mL en un tampón de solubilización que contenga 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanolsulfónico (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5% (v/v) o 4,98 mM neopentil glicol maltosa de lauril (LMNG); 1x cóctel inhibidor de proteasas; 50 μg de DNasa I; 10% (v/v) de glicerol.
    2. Lisa las células mediante ultrasonicación a un 25% de amplitud usando un ciclo de pulsos de 20 s encendido y 20 segundos apagado durante 15 minutos, manteniendo la muestra en hielo para evitar el sobrecalentamiento.
    3. Clarifica el lisado mediante centrifugación a 25.800 × g durante 45 minutos a 4 °C.
  3. Purificación de afinidad usando resina anti-FLAG
    1. Equilibrar resina anti-FLAG M2 con un tampón de equilibrio que contenga 25 mM de HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,05% (p/v) o 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol.
    2. Incubar el sobrenadante clarificado con resina equilibrada durante 2 horas a 4 °C sobre un balancín.
    3. Lava la resina 2 veces con un buffer de lavado que contiene 25 mM HEPES, pH 7,8; 150 mM NaCl; 0,05% (p/v) o 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol.
    4. Eluir la proteína unida usando un tampón de elución que contiene 25 mM de HEPES, pH 7,8; 400 mM NaCl; 0,001% (p/v) o 0,00995 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol; Péptido FLAG de 200 μg/mL.
  4. Cromatografía de concentración y exclusión de tamaño (SEC)
    1. Concentra la proteína eluída a ~500 μL usando una unidad filtrante centrífuga con un corte de 30 kDa.
    2. Realizar SEC usando la columna de exclusión de tamaño referenciado equilibrada con 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (v/v) o 0,00149 mM LMNG.
    3. Recoge y agrupa las fracciones pico correspondientes a la proteína objetivo.
    4. Concentra las fracciones agrupadas hasta ~3 mg/mL de concentración final. Tras la purificación de afinidad, se confirma que el monómero TMEM120A proteína M207A aparece aproximadamente en 43 kDa en SDS-PAGE (Figura 2A). Para la SEC, confirma que la proteína purificada en LMNG elue como un pico monodisperso correspondiente a aproximadamente 150 kDa, que representa el dímero TMEM120A M207A junto con la micela detergente LMNG (Figura 2B).
      NOTA: Ocasionalmente, la banda proteica monómera puede aparecer alrededor de 50 kDa, lo cual es común en proteínas de membrana solubilizadas en detergente, ya que no es habitual hervir muestras de proteínas de membrana.

2. Análisis de estabilidad térmica mediante fluorimetría de barrido diferencial nano (NanoDSF)

  1. Diluir la proteína purificada TMEM120A M207A a 0,15 mg/mL en un tampón SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Carga 10 μL de cada muestra en capilares de alta sensibilidad.
  3. Ejecuta el ensayo de desplazamiento térmico en un instrumento NanoDSF con una rampa de temperatura de 25 °C a 90 °C.
  4. Utiliza software compatible para configurar el ensayo y realizar análisis automatizados.
  5. Confirmar que una única curva de transición térmica (Tm) es visible, indicando un evento de despliegue cooperativo (Figura 3).

3. Fotometría de masa para la determinación del estado oligomérico

  1. Prepara una muestra diluida a 80 nM en un tampón SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Coloca la muestra en láminas prelimpiadas compatibles con fotometría de masa.
  3. Adquirir datos usando ajustes estándar y calibrar usando estándares de proteína.
  4. Procesar datos con software de análisis para generar histogramas de distribución de masa (Figuras 4A-C).

4. Protocolo de interferometría de biocapa (BLI)

NOTA: Este protocolo describe un ensayo cinético BLI diseñado para estudiar las interacciones entre TMEM120A M207A marcados con FLAG y ligandos como GsMTx4, utilizando un formato de microplaca de 384 pozos. Aunque se desarrolló para TMEM120A, el flujo de trabajo puede adaptarse para otras proteínas de membrana. Todos los experimentos se realizaron utilizando una plataforma de interferometría óptica con sondas biosensores FLAG para inmovilizar TMEM120A M207A etiquetados con FLAG. Se utilizó una microplaca negra de 384 pozos con un buffer de cromatografía optimizada por exclusión de tamaño (SEC) que contenía 25 mM de HEPES, 200 mM de NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG y 0,0005% Tween-20, pH 7,8. Se incluyó Tween-20 para minimizar la unión inespecífica. La concentración de proteínas se mantuvo en 250 nM, y todos los ensayos se realizaron en duplicado para garantizar la reproducibilidad.

  1. Consideraciones de diseño del ensayo
    1. Equilibrio de temperatura
      1. Antes de comenzar el ensayo BLI, equilibrar todos los componentes del ensayo —incluidos tampones, muestras y sondas biosensores— a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C). Durante la adquisición de datos, mantener la temperatura del ensayo en 30 °C, lo cual se recomienda para análisis cinéticos que optimizen la estabilidad de proteínas, la unión de ligandos y la reproducibilidad.
        NOTA: Este paso de equilibrio garantiza perfiles cinéticos consistentes y minimiza los artefactos causados por las fluctuaciones de temperatura durante el experimento. Permitir tiempo suficiente (al menos 10-15 minutos) para que todos los reactivos y biosensores alcancen el equilibrio térmico antes de comenzar el ensayo.
    2. Hidratación y regeneración de sensores
      1. Hidratar los nuevos biosensores FLAG en 250 μL de tampón compatible con BLI (tampón SEC que contiene 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% w/v LMNG y 0,0005% Tween-20, pH 7,8) en la placa Max durante un mínimo de 10 minutos antes del uso.
        NOTA: Manipula los biosensores con cuidado con pinzas limpias y libres de polvo para evitar contaminaciones, que pueden interferir con la adquisición de señales y dar resultados inconsistentes. Para la reutilización del sensor, realiza la regeneración usando el tampón Q (0,3 M glicina, pH 3,8). Una hidratación y regeneración adecuadas son fundamentales para mantener el rendimiento y la reproducibilidad de los sensores, especialmente al trabajar con proteínas de membrana solubilizadas en detergente, que son sensibles a las condiciones ambientales.
    3. Manejo de buffers
      1. Evita las burbujas de aire al dispensar líquidos, ya que pueden interferir con la adquisición de señales ópticas.
    4. Composición y consistencia del buffer
      1. Utiliza un tampón que minimice las interacciones inespecíficas mientras preserva la función de las proteínas. Para TMEM120A M207A, prepare el tampón que contiene 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG, 0,0005% (p/v) Tween 20, pH 7,8.
    5. Inmovilización de proteínas
      1. Optimiza la carga de ligandos para alcanzar una saturación del sensor entre el 50 y el 80%. Utiliza una concentración fija de proteína a 250 nM, con una duración típica de carga de aproximadamente 120 s. Carga TMEM120A M207A (250 nM) con etiqueta FLAG sobre el biosensor durante 120 s para lograr una saturación del 50-80%.
      2. Confirma que la señal del biosensor alcanza entre el 50 y el 80% de la capacidad máxima de unión durante la fase de carga.
        NOTA: Las señales por debajo del 50% pueden indicar inmovilización insuficiente de proteínas, mientras que las señales por encima del 80% pueden introducir limitaciones en el transporte de masa o obstáculos estéricos, comprometiendo potencialmente las mediciones cinéticas.
      3. Para evaluar los posibles efectos del transporte de masa, se realiza un experimento de control en el que la concentración de analito (por ejemplo, 100 nM GsMTx4) se mantiene constante mientras se varían los niveles de carga de TMEM120A-M207A en biosensores FLAG (Figura suplementaria S1).
        NOTA: Las mediciones cinéticas posteriores —incluyendo asociación, disociación, ajustes globales de unión y determinación de kencendido y k apagado— no difirieron significativamente de las obtenidas en el ensayo principal. Este resultado indica que TMEM120A carga dentro del rango del 50-80% no introduce artefactos significativos de transporte de masa, confirmando que el nivel de carga del biosensor es adecuado para un análisis cinético fiable.
    6. Estimación de KD
      1. Determinar la afinidad de unión (KD) probando concentraciones del analito (GsMTx4) de 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM y 100 μM.
    7. Controles de señal de fondo
      1. Incluir controles adecuados para restar con precisión las señales de fondo y garantizar mediciones cinéticas fiables.
      2. Utiliza una sonda FLAG de referencia para tener en cuenta la unión o deriva inespecífica que pueda ocurrir durante el ensayo.
        NOTA: Esta sonda de referencia no debe tener la proteína objetivo inmovilizada y sirve como línea base para corregir la señal obtenida de las sondas que contienen muestras.
      3. Se resta la señal de referencia de la señal de muestra para analizar solo interacciones específicas entre TMEM120A M207A etiquetados con FLAG y analitos.
        NOTA: Verifique que la sonda FLAG de referencia muestre una señal mínima durante todo el ensayo. Una línea base estable y baja indica una unión inespecífica insignificante. Si la señal de referencia fluctúa o aumenta, se reevalúa la composición del tampón, el manejo de la sonda o la preparación de la muestra para reducir las interacciones inespecíficas antes de proceder con el análisis cinético.
  2. Configuración de parámetros básicos del ensayo para el análisis cinético
    1. Ajusta la frecuencia de adquisición de datos a 5 Hz para recoger 5 puntos de datos/s (recomendado para todos los ensayos cinéticos).
    2. Selecciona la placa de 384 pozos como formato de placa.
    3. Se ajusta la velocidad del agitador a 1.000 RPM y la temperatura entre ambiente y 30 °C (30 °C usados en este experimento para obtener resultados cinéticos óptimos).
  3. Configura la configuración de la placa.
    1. Navega a la pestaña de Configuración de Placas y define las asignaciones de pozos tanto para la placa de 384 pozos como para la placa Max.
    2. Asignar funciones de pozo en la placa de 384 pozos.
      NOTA: Los símbolos y anotaciones utilizados tanto para la placa de 384 pocillos como para la Max Plate se resumen en la Tabla Suplementaria S1.
      1. Etiqueta los pozos según su función: tampón, proteína (carga), ligando (muestra).
      2. Anota los pozos de carga proteica con concentración (por ejemplo, 250 nM) para ensayos cinéticos.
        NOTA: Un etiquetado preciso es esencial para calcular kon y kD (véase la Figura Suplementaria S2A).
    3. Configura el mapa de placas Max (placa de sonda).
      1. Asignar sondas biosensores a los pozos correspondientes.
      2. Si se planifica la regeneración de la sonda, asigna pozos para buffers de regeneración y neutralización. Etiqueta claramente estos pozos en el software para asegurar una automatización adecuada durante la regeneración (véase la Tabla Suplementaria S2).
        NOTA: El tampón del ensayo consistía en 25 mM de HEPES (pH 7,8), 200 mM de NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG y 0,0005% (v/v) Tween-20. El paso de regeneración de las sondas biosensores anti-FLAG se realizó utilizando un tampón Q que contenía 0,3% de glicina (pH 3,8), seguido de un paso de neutralización con el tampón del ensayo (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG y 0,0005% Tween-20, pH 7,8).
  4. Selecciona la pestaña Pasos del ensayo .
    1. Ve a la pestaña de Pasos del ensayo para configurar el flujo de trabajo del ensayo cinético. Especificar las posiciones del pozo para cada fase del ensayo, incluyendo línea base, carga de proteínas, asociación y disociación (véase la Figura Suplementaria S3).
    2. Selecciona el tipo de paso adecuado en el menú desplegable. Asegúrate de que los pasos de asociación y disociación estén correctamente etiquetados para un análisis cinético preciso.
    3. Introduce la duración de cada paso en segundos para definir los tiempos de exposición de todas las fases de interacción.
      1. Establece la duración del paso base para permitir el equilibrio del sensor antes de la carga de proteínas (60 s).
      2. Establezca la duración del paso de carga de proteínas para alcanzar los niveles deseados de inmovilización de ligandos de (60 s) (Figura 5).
      3. Establezca la duración del paso de asociación para permitir una unión suficiente al analito (300 s) (Figura 5).
      4. Establezca la duración del paso de disociación para capturar adecuadamente la cinética de desunión del analito (600 s) (Figura 5).
    4. Ajusta la velocidad del vibrador (RPM) para cada paso para mantener una mezcla consistente y una calidad óptima de datos (1.000 RPM).
  5. Paso de alineación y filtrado (véase la Figura Suplementaria S4 y la Figura Suplementaria S5)
    1. Realizar corrección de datos en bruto ajustando el rango de datos según sea necesario para eliminar artefactos de los pasos cinéticos.
    2. Para alinear el eje Y, alinea los datos al inicio del paso de asociación seleccionando Asociación en Alinear Tipo de Paso y activando la opción Inicio .
    3. Activar la opción de corrección Interstep para mantener la continuidad entre pasos durante los ensayos cinéticos estándar.
    4. Filtrado: Aplica suavizado de datos para reducir el ruido de la señal sin distorsionar las tendencias. Selecciona Procesado para comparar datos suavizados con señales en bruto.
  6. Establezca un paso de referencia (véase la Figura Suplementaria S6).
    1. Designa una sonda de referencia seleccionando la sonda de referencia y haciendo clic en el botón Ref. Probe .
    2. Selecciona las sondas de muestra haciendo clic en los números de columna correspondientes para las sondas de muestra.
    3. Para definir la función de resta, abre el Editor de Fórmulas, haz clic en Editar Fórmula y define la función de resta para eliminar el fondo.
    4. Revisar la vista de la tabla para confirmar que la resta de referencia se ha aplicado correctamente.
  7. Paso de ajuste de fijación
    1. Navega a la pestaña de Ajuste y define los parámetros de análisis (Figura suplementaria S7).
    2. Selección de datos: Incluye tanto las fases de asociación como de disociación para el ajuste cinético local. Excluye manualmente los valores atípicos si muestran un mal ajuste de curvas o señal errática.
    3. Selección del modelo de enlace: Elige el modelo de enlace 1:1 para ajustarlo a los datos, salvo que se observe un comportamiento complejo. Revisa las superposiciones de curvas y los residuos para validar la idoneidad del modelo.
    4. Estrategia de ajuste: Seleccione una de las siguientes estrategias de ajuste según la calidad de los datos y los objetivos experimentales:
      1. Local: Se ajusta individualmente a cada concentración de analito, permitiendo una evaluación independiente de la cinética de asociación y disociación.
      2. Global: Ajusta simultáneamente todas las concentraciones de analitos usando un único conjunto de parámetros cinéticos, proporcionando un modelo global para el conjunto de datos.
      3. Completo: Encaja tanto en las fases de asociación como en las de disociación a nivel global en todas las concentraciones.
      4. Parcial: Solo encaja en la fase de asociación, ignorando la disociación.
        NOTA: Los datos de BLI se analizaron utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 con ajuste local y completo. El ajuste local asegura que cada concentración de analito se trate de forma independiente, proporcionando una representación precisa de la cinética de asociación y minimizando artefactos derivados de la heterogeneidad en la fase de disociación. Este enfoque evita el sobreajuste en regiones con señales variables o inestables, permitiendo una estimación más fiable de los parámetros cinéticos (kencendidos yk apagados) (Tabla 1 y Tabla 2).
  8. Análisis cinético
    1. Revisión de curvas ajustadas y residuos: Examinar las curvas ajustadas y los residuos correspondientes para evaluar la calidad y validez del modelo. Confirmar que los residuos están distribuidos aleatoriamente alrededor de cero sin desviaciones sistemáticas (véase la Figura 4E para los residuos representativos).
    2. Exclusión de datos mal ajustados: Eliminar las concentraciones de analitos que presenten señales planas, ruidosas o poco fiables para mejorar la precisión general del modelo.
      NOTA: Por ejemplo, la concentración de 10 μM se excluyó del ajuste debido a la superposición con el conjunto de datos de 5 μM, lo que podría distorsionar la estimación de parámetros cinéticos (véase la Figura 6A,B).

Resultados

El mutante M207A TMEM120 se expresó en celdas de suspensión HEK293SF-17 utilizando un vector pCDNA3.1 que codifica una etiqueta FLAG N-terminal Figura 1. La transfección transitoria permitió la expresión de proteínas recombinantes. Tras la extracción celular, las proteínas de membrana se solubilizaron en neopentil glicol de maltosa de lauril al 0,5% (LMNG), un detergente no iónico adecuado para mantener la solubilidad de proteínas de membrana.

La fracción solubilizada fue sometida a purificación de afinidad utilizando resina anti-FLAG M2. La resina se lavó con un tampón que contenía 0,01% LMNG para eliminar proteínas no ligadas específicamente, y TMEM120 M207A fue eluído en un tampón que contenía 0,001% LMNG. La elución se concentró mediante filtros centrífugos con cortes de peso molecular de 30 kDa o 100 kDa, dependiendo del rendimiento de la muestra. Se realizó una purificación adicional mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El paso final de la SEC se realizó en un tampón que contenía 0,00015% LMNG, produciendo un perfil de elución monodispersa compatible con una preparación proteica homogénea y estable, adecuada para análisis estructurales y funcionales posteriores (Figura 2B).

La optimización y caracterización biofísica de TMEM120 M207A etiquetadas con FLAG se resumen en la Figura 2. La expresión y purificación fueron confirmadas por SDS-PAGE, que mostró una sola banda a aproximadamente 50 kDa. La migración observada fue ligeramente superior al peso molecular esperado de la forma monomérica (Figura 2A), probablemente debido a la muestra no hervida antes de la electroforesis. El cromatógrama SEC mostró un único pico simétrico de elución a un volumen correspondiente a una masa molecular aparente de aproximadamente 150 kDa en LMNG 0,00015% (p/v) (Figura 2B), consistente con el dímero TMEM120A M207A en micelas detergentes LMNG. Este comportamiento de elución muestra una población proteica homogénea y monodispersa, lo que la hace adecuada para la caracterización biofísica posterior.

Las propiedades de micela detergente de la LMNG bajo las condiciones experimentales de tampón se analizaron mediante fotometría de masa. Se realizaron mediciones en un tampón SEC con concentraciones variables de LMNG en ausencia de proteína para evaluar la contribución de las micelas detergentes a la masa molecular clara. Al 0,001% (p/v) de LMNG, una concentración superior a la concentración crítica de micelas (CMC), se detectó el pico predominante en aproximadamente 69 kDa, correspondiente a las micelas LMNG por sí solas sin ninguna proteína asociada (Figura 4A). Cuando la concentración de LMNG se redujo a 0,0001% (p/v), por debajo de la CMC, la especie principal se desplazó a ~48 kDa, lo que indica la presencia de agregados residuales de LMNG más pequeños o conjuntos submicelares sin proteína (Figura 4B). Más adelante (Figura 4C), TMEM120A M207A fue diluido en un tampón SEC que contenía diferentes concentraciones de LMNG para evaluar su estado oligomérico mediante fotometría de masa. A 0,00001% LMNG (~20 veces por debajo del CMC, magenta), se observó un pico predominante en aproximadamente 42 kDa, correspondiente al monómero de TMEM120A M207A. Con 0,00015% LMNG (~10 veces por debajo del CMC, azul), la población principal con ~86 kDa indicó la presencia de dímeros. Aumentar la concentración de LMNG a 0,001% (~2 veces por encima del CMC, naranja) dio lugar a una especie principal ~150 kDa, consistente con complejos proteína-detergente. Con 0,002% LMNG (~4 veces por encima del CMC, verde), se detectó una distribución amplia centrada cerca de 180 kDa, que representa conjuntos asociados a micelas más grandes o oligómeros de orden superior. Estos resultados demuestran que la concentración de LMNG dentro del tampón SEC influye fuertemente en el estado oligomérico claro de TMEM120A M207A, observándose un equilibrio monómero-dímero por debajo de la CMC y predominando la formación del complejo detergente-proteína por encima de la CMC.

La estabilidad termodinámica de TMEM120A M207A recogido del pico principal de la SEC y mantenido en el tampón de la SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG, pH 7,8) fue evaluada mediante análisis de desnaturalización térmica. La proteína presentaba un punto de inflexión de aproximadamente 46 °C, correspondiente a su temperatura de fusión (Tm) bajo estas condiciones solubilizadas en detergente. Este valor de Tm indica una estabilidad térmica moderada, lo que sugiere que TMEM120A M207A mantiene una conformación correctamente plegada dentro de las micelas LMNG, pero puede comenzar a desplegarse o agregarse a temperaturas más altas.

La interferometría de biocapas (BLI) muestra afinidad de unión μM de TMEM120A M207A a GsMTx4T. Las trazas de la Figura 5 ilustran cinco pasos experimentales: (1) línea base, (2) carga TMEM120A muestras de M207A, (3) línea base para eliminar la unión inespecífica y el exceso TMEM120A M207A, (4) asociación y (5) disociación. El desplazamiento de longitud de onda (nm) se representa a lo largo del tiempo para el aumento de concentraciones de GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 y 100 μM) que interactúan con TMEM120A M207A inmovilizada.

Durante la línea base inicial (paso 1), la señal permaneció estable, confirmando el equilibrio del sensor en el buffer. TMEM120A carga M207A (paso 2) produjo un aumento característico de la señal, correspondiente a ~50-80% de saturación de la sonda entre sensores. La fase de carga mostró una respuesta ligeramente curva en lugar de una meseta pronunciada, posiblemente reflejando una limitación parcial del transporte de masa, donde TMEM120A difusión de M207A a la superficie del sensor es más lenta que la tasa de unión — un efecto común en proteínas solubilizadas en membrana o detergente que puede influir en la cobertura superficial aparente.

El siguiente paso base (paso 3) eliminó efectivamente TMEM120A M207A sin atar o sin fijación laxa. Durante la fase de asociación (paso 4), aumentar las concentraciones de GsMTx4 resultó en incrementos claros y dependientes de la concentración en el desplazamiento de longitud de onda. Durante la disociación (paso 5), el biosensor se colocó en un buffer SEC que contenía LMNG a ~10 veces por debajo del CMC. Los primeros 5-10 segundos de disociación mostraron una disminución rápida de la señal, probablemente representando una liberación rápida de GsMTx4 de sitios fácilmente accesibles, seguida de una desintegración más lenta que puede reflejar complejos más estables TMEM120A M207A-GsMTx4 con cinética de disociación lenta. Las señales de la sonda de referencia permanecieron planas durante todo el experimento, lo que indica una unión mínima inespecífica. En general, estos datos demuestran interacciones específicas TMEM120A M207A-GsMTx4; sin embargo, la cinética observada debe interpretarse con cautela debido al entorno del detergente y a los posibles efectos del transporte masivo.

Los sensorgramas de asociación y disociación de los datos procesados tras la resta de la sonda de referencia (Figura 6A) mostraron respuestas dependientes de la concentración para GsMTx4 en el rango de 5-100 μM. El aumento de las concentraciones de ligandos produjo desplazamientos progresivamente mayores en la longitud de onda, seguidos de una disminución gradual y lenta durante la fase de disociación de 200 s. El conjunto de datos de 10 μM fue excluido del ajuste debido a la superposición con la traza de 5 μM, lo que mejoró la calidad general del modelo.

El análisis cinético se realizó utilizando un modelo de asociación-disociación de Langmuir 1:1 con una estrategia local de ajuste completo, en la que las concentraciones individuales de los analitos se ajustaron de forma independiente dentro de un marco cinético compartido (Figura 6B). Las curvas ajustadas (rojo) coincidieron bien con las trazas experimentales, lo que proporcionó una constante de disociación estimada (KD) en el rango de micromolares bajos. El análisis residual (Figura 6C) no reveló desviaciones sistemáticas importantes, lo que indica que el modelo aplicado era adecuado para el conjunto de datos. Las diferencias menores observadas durante la fase inicial de asociación pueden reflejar limitaciones en el transporte masivo o los efectos del entorno de las micelas con detergente. Ejemplos adicionales de curvas de asociación y disociación ajustadas, gráficos residuales y estadísticas de ajuste entre múltiples réplicas de ensayo y posiciones de la sonda se muestran en la Figura Suplementaria S8.

En los datos en bruto (Figura 5), los primeros 5-10 segundos de disociación mostraron una rápida disminución de la señal, probablemente representando la liberación rápida de GsMTx4 de sitios fácilmente accesibles, seguida de una desintegración más lenta que podría reflejar complejos M207A-GsMTx4 más estables TMEM120A con cinética de disociación lenta. Por lo tanto, en la Tabla 2, los primeros 100 segundos de disociación se eliminaron del ajuste. La ausencia de desviación sistemática indica un buen ajuste del modelo local de Langmuir 1:1 para TMEM120A M207A en todas las concentraciones testadas (Figura 7).

El análisis cinético de la unión de GsMTx4 a TMEM120A M207A reveló comportamientos de asociación y disociación dependientes de la concentración en el rango de ligandos de 5 a 100 μM (Tabla 1). Las constantes de tasa de asociación observadas (kon) aumentaron modestamente con el aumento de la concentración de GsMTx4, oscilando aproximadamente entre 1,0 × 10⁻⁶ y 3,2 × 10-6 1/M·s, mientras que las constantes estimadas de la tasa de disociación (koff) se mantuvieron cerca de cero dentro del error experimental, lo que sugiere una fase de disociación lenta o insignificante bajo las condiciones probadas. Las constantes de disociación de equilibrio calculadas (Kd) estaban en el rango micromolar bajo a medio (~0,8-3,3 μM), consistentes con una interacción de afinidad moderada. El ajuste local completo utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1 produjo ajustes de alta calidad en todas las concentraciones de GsMTx4, con coeficientes de correlación superiores a 0,99 y valores relativos bajos de χ2 tanto para las fases de asociación como de disociación (Tabla 1). Las constantes de disociación de equilibrio calculadas fueron consistentes entre concentraciones y replicaciones, con valores de KD en el rango bajo de micromolares (~1-2 μM), indicando una unión moderada pero específica entre TMEM120A M207A y GsMTx4.

Los conjuntos de datos replicados en cada concentración mostraron reproducibilidad, como indica los altos coeficientes de correlación (R² > 0,99) tanto para los ajustes de asociación como de disociación. Los valores de χ² total y relativo fueron bajos y comparables entre réplicas, lo que apoya aún más la robustez del modelo de unión de Langmuir 1:1 aplicado en el análisis. A concentraciones más altas de ligandos (≥50 μM), se observaron un ligero aumento de valoresde k en y KD , lo que puede reflejar efectos menores del transporte de masa o heterogeneidad local en la superficie más que cambios reales de afinidad. La consistencia cinética entre múltiples réplicas y posiciones de la sonda se ilustra aún más en la Figura Suplementaria S9.

Los perfiles cinéticos demuestran que GsMTx4 interactúa de forma específica y estable con TMEM120A M207A, formando complejos relativamente estables caracterizados por una disociación lenta y afinidad por la unión de micromolares.

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Figura 1: Flujo de trabajo de purificación de TMEM120A mutante M207A expresado en celdas de suspensión HEK293SF-17. Visión general esquemática del procedimiento de purificación de proteínas. TMEM120A M207A se expresó a partir de plásmidos pCDNA3.1 en células HEK293SF-17. Las células se solubilizaron en LMNG al 0,5%, seguidas de purificación por afinidad utilizando resina anti-FLAG M2. La resina se lavó con un tampón que contenía 0,01% LMNG para eliminar proteínas unidas de forma no específica. TMEM120A M207A fue eluído en un tampón que contenía 0,001% LMNG. El eluato se concentró utilizando filtros de corte de peso molecular de 100 kDa o 30 kDa y se purificó posteriormente mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un tampón que contenía 0,00015% LMNG. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Cromatografía de exclusión de tamaño y PÁGINA SDS de TMEM120A purificada M207A En detergente LMNG (A) SDS-PAGE de TMEM120A M207A etiquetada con FLAG purificada mediante cromatografía de exclusión de tamaño. La banda proteica aparece en ~50 kDa en la vía 1, correspondiente al monómero esperado. (B) Perfil SEC de TMEM120A purificado M207A en una columna SEC en el buffer SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG, pH 7,8). La elución proteica indica una especie predominante de monodisperso adecuada para ensayos biofísicos posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Fluorimetría diferencial de barrido de TMEM120A purificado M207A en LMNG. La DSF revela un punto de inflexión termodinámico a 46 °C, lo que indica la estabilidad térmica de la proteína bajo las condiciones de tampón probadas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: caracterización de TMEM120A purificado M207A en detergente LMNG mediante técnica de fotometría masiva. (A,B) Fotometría de masa del tampón SEC con concentraciones variables de LMNG. A 0,001% de LMNG (por encima de la concentración crítica de micelas, CMC), el peso molecular aparente es de ~69 kDa, correspondiente principalmente a las micelas LMNG. Con 0,0001% LMNG (diez veces por debajo de la CMC), el pico aparece en ~48 kDa. (C) Análisis de fotometría de masas de los efectos dependientes de la concentración de GNLM en la oligomerización TMEM120A. TMEM120A en 0,00001% LMNG (~20 veces por debajo del CMC, magenta) muestra una población principal de aproximadamente 42 kDa (monómero). En LMNG del 0,00015% (~10 veces por debajo de CMC, azul), se observa una población de ~86 kDa, consistente con el dímero. En LMNG al 0,001% (~2 veces por encima de CMC, naranja), una especie principal con ~150 kDa corresponde a complejos proteína-detergente. En LMNG del 0,002% (~4 veces por encima de CMC, verde), una distribución amplia centrada en ~180 kDa indica conjuntos asociados a micelas más grandes o oligómeros de orden superior. Estos resultados demuestran que la concentración de LMNG influye fuertemente en el aparente estado oligomérico de TMEM120A, observándose un equilibrio monómero-dímero por debajo de la CMC y predominando la formación del complejo proteína-detergente por encima de la CMC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Datos en bruto de software que muestran TMEM120A interacciones M207A-GsMTx4. La interferometría de la biocapa demuestra que TMEM120A (M207A) se une al inhibidor del canal mecanosensible GsMTx4 con afinidad micromolar. La figura muestra los datos brutos de respuesta BLI obtenidos del software Gator Prime, delimitando las cinco fases clave del ensayo: (1) Línea base inicial, durante la cual la señal permaneció estable; (2) Inmovilización de proteínas (carga), que resulta en un aumento de aproximadamente 1,5 nm en el desplazamiento de longitud de onda; (3) Segunda línea base, que permite la eliminación de proteínas no unidas o de forma débil; (4) Fase de asociación (unión de ligandos), donde el aumento de concentraciones de GsMTx4 produjo un aumento de respuesta de hasta ~5,5 nm en 300 s; y (5) fase de disociación (liberación de ligandos), mostrando decaimiento gradual de la señal durante 600 s. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Cinética de unión de TMEM120A M207A con el péptido GsMTx4. (A) Sensorgramas de asociación y disociación de TMEM120A M207A interactuando con GsMTx4 a cinco concentraciones: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM y 100 μM. El conjunto de datos de 10 μM fue excluido del ajuste debido a la superposición con la curva de 5 μM, lo que mejoró el ajuste general del modelo. Las líneas rojas discontinuas verticales indican el inicio y el final de la fase de disociación. (B) El ajuste de los sensorgramas se realizó utilizando un modelo de asociación y disociación 1:1 de Langmuir Local Full fitting. Las curvas rojas representan el modelo ajustado, mientras que las trazas experimentales corresponden a los datos medidos de asociación y disociación para cada concentración de GsMTx4 (dos réplicas por condición). (C) Gráficos residuales que muestran la desviación entre los datos experimentales y el modelo ajustado tanto para las fases de asociación como de disociación, confirmando la idoneidad del ajuste. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7: Gráficos residuales correspondientes a las curvas ajustadas de encuadernación que se muestran. Cada gráfico representa los residuos (diferencia entre los datos experimentales y el modelo ajustado) para una sola concentración de GsMTx4: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM y 100 μM. Los residuos se muestran como desviación de desplazamiento (nm) frente al tiempo (s), mostrando una distribución aleatoria alrededor de cero tanto en las fases de asociación como de disociación. La ausencia de desviación sistemática indica un buen ajuste del modelo Local Full Fitting Langmuir 1:1 para TMEM120A M207A en todas las concentraciones probadas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Resumen de los parámetros cinéticos para TMEM120A unión de M207A a GsMTx4. Los parámetros cinéticos se obtuvieron mediante ajuste Local Full utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. Se reportan y se replican las constantes de tasa observadas (kencendido), disociación(k activado), disociación (kobs) y constantes de disociación de equilibrio (KD). La calidad del ajuste se evaluó utilizando valores de R² y χ² para las fases completa, de asociación y de disociación. En todas las concentraciones, los ajustes mostraron altos coeficientes de correlación (R² > 0,99) y valores relativos bajos de χ², lo que indica un rendimiento fiable del modelo. Notas: M Conc. indica la concentración de GsMTx4 (μM). kOBS representa la constante de tasa observada que refleja procesos combinados de asociación y disociación. Los errores reportados para kobs, kon y koff reflejan incertidumbre de ajuste. Los valores R² indican la idoneidad para las fases de plena, asociación y disociación. Los valores relativos de χ² representan métricas normalizadas de bondad de ajuste, mientras que los valores absolutos de χ² indican desviación residual entre los datos observados y los ajustados. Abreviaturas: kon = constante de tasa de asociación (1/M·s); koff, = constante de tasa de disociación (1/s); kobs = constante de tasa observada (1/s); KD = constante de disociación en equilibrio; Rmax = respuesta máxima; Req = respuesta de equilibrio. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Parámetros de procesamiento y residuos del ajuste cinético. Parámetros de procesamiento: inicio de asociación, 0 s; final de la asociación, 300 s; inicio de disociación, 100 s; final de disociación, 300 s. Valor mínimo de R², 0,9; valor máximo de χ², 8. Paso de alineación: final de un solo paso (índice = 1, promedio = 0). La corrección entre pasos se aplicó durante la fase de asociación. media de la asociación, 50; Promedio de disociación, 0. El suavizado Savitzky-Golay fue desactivado. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria S1: Experimento de optimización para cargar diferentes concentraciones de TMEM120A proteína M207A en sondas anti-FLAG con una concentración fija (100 nM) del péptido GsMTx4. (A) sensorgramas BLI en bruto que muestran los cinco pasos de la medición cinética: (1) línea base en el tampón SEC o en el tampón de ensayo (25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (v/v) LMNG; 0,0005% (v/v) Tween-20); (2) carga de cuatro concentraciones diferentes de TMEM120A M207A sobre la sonda FLAG, usando la sonda de referencia (naranja) como control negativo para confirmar la ausencia de unión inespecífica; (3) en el segundo paso de la línea de base; (4) la fase de asociación, y (5) la fase de disociación. (B) El modelo global de unión 1:1 se ajusta a las cuatro concentraciones TMEM120A de M207A que interactúan con el péptido GsMTx4 de 100 nM. (C) Gráficos residuales tanto para la fase de asociación como para la de disociación, mostrando desviaciones mínimas respecto al modelo ajustado (<0,05 nm). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Configuración de placas y configuración del ensayo. (A) Diseño de placa para una placa de 384 pozos, donde se pueden asignar diferentes parámetros. Las muestras corresponden al ligando (GsMTx4) en diversas concentraciones. Los pozos naranjas indican TMEM120 proteína M207A a 250 nM. Los pozos representan replicaciones proteicas a 250 nM, y el mismo tampón se utilizó para los pasos de base, asociación y disociación. (B) Vista de la placa máxima mostrando cuatro sondas biosensores anti-FLAG: una sonda de referencia y tres sondas para réplicas de proteínas. Todas las sondas fueron pre-humedecadas en el tampón de ensayo, regeneradas en el tampón Q y neutralizadas en tampón de ensayo. El mismo buffer se utilizó en los pasos basales, de asociación y de disociación. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Ciclos de preparación del ensayo, incluyendo línea base, carga de proteínas, segunda línea base, asociación y disociación. Abreviaturas: B = búfer; L = carga; 0, 5, 10, 20, 30, 50 y 100 = concentraciones de GsMTx4 en μM. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: Nuevo flujo de trabajo de análisis de cinética (K). Seleccione el icono de Experimento , que ofrece una visión general de todos los ensayos realizados en un solo experimento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S5: Nuevo flujo de trabajo de análisis de cinética (K).Icono de Alinear y Filtrar , donde se pueden revisar y analizar los datos en bruto tanto de las fases de asociación como de disociación. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S6: Nuevo flujo de trabajo de análisis cinético (K).Icono de referencia de conjunto , usado para seleccionar el sensor de referencia adecuado para la resta de fondos y la interpretación precisa de datos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S7: Pasos de ajuste de unión en el flujo de trabajo de análisis cinético. Ajustes de parámetros de ajuste cinético usados para analizar datos de interacción de enlace. El modelo asume una interacción 1:1 con un único sitio de unión de ligando. El tipo de ajuste se establece en Local, ajustando cada curva de concentración de forma independiente en lugar de globalmente. La opción Full Fitting con Full Stitch activada incluye todas las curvas de asociación continua y disociación. Las ventanas temporales para las fases de asociación y disociación se fijan de 0 a 300 s y de 0 a 200 s, respectivamente. En segundo plano, el gráfico de ajuste de enlace, el gráfico de residuos y las curvas individuales del ensayo ilustran la calidad del ajuste y la variabilidad experimental. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S8: Pasos de ajuste de encuadernación en el flujo de trabajo de análisis cinético. Gráfico de ajuste de unión que muestra las fases de asociación y disociación a través de múltiples réplicas del ensayo y posiciones de la sonda (C1 y D1). El gráfico residual a continuación evalúa la calidad del ajuste, con los residuos indicando diferencias entre los datos experimentales y el modelo ajustado; Valores cercanos a cero reflejan un buen encaje. La tabla adjunta resume las estadísticas de ajuste, incluyendo los valores de R² completo, asociación R², disociación R² y chi-cuadrado (X²) para cada réplica. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S9: Pasos de ajuste de encuadernación en el flujo de trabajo de análisis cinético. Análisis cinético de interacciones de unión a partir de múltiples réplicas y posiciones de la sonda (C1 y D1). El desplazamiento de respuesta del sensor (nm) a lo largo del tiempo (s) muestra las fases de asociación y disociación, con cada curva codificada por colores según el ensayo y la posición de la sonda. La línea roja discontinua vertical marca la transición entre las fases de asociación (0-300 s) y disociación. A continuación, la tabla informa de parámetros cinéticos derivados del ajuste 1:1 del modelo de unión, incluyendo la concentración de analitos (M Conc.), la constante de tasa de asociación (kactivada), la constante de tasa de disociación (koff), los errores y la constante de disociación en equilibrio (KD). La calidad de ajuste constante respalda la robustez de las mediciones cinéticas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Tabla que ilustra los símbolos usados tanto en la placa de 384 pozos como en la placa Max. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Parámetros cinéticos obtenidos para las cuatro concentraciones de TMEM120A M207A cargadas en biosensores FLAG que interactúan con el péptido GsMTx4 de 100 nM, utilizando valores fijos de kon y koff. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Caracterizar las interacciones entre proteínas de membrana sigue siendo un reto debido a la necesidad de una purificación meticulosa de proteínas, una optimización cuidadosa de la concentración de detergentes y un diseño preciso del ensayo. Este estudio presenta un flujo de trabajo detallado para TMEM120A M207A, ilustrando tanto la purificación como el análisis cinético usando GsMTx4 con interferometría de biocapas (BLI).

Pasos críticos y optimización:
Uno de los pasos críticos importantes fue la concentración de detergente, que se identificó como un determinante principal de la estabilidad de las proteínas. El proceso de purificación implicó la solubilización celular con un tampón que contenía 0,5% LMNG, seguida de lavado secuencial con 0,005% LMNG, elución con 0,001% LMNG y cromatografía final por exclusión de tamaño (SEC) en un tampón con 0,00015% LMNG. Esta estrategia de detergente, basada en la baja concentración crítica de micelas (CMC) y la velocidad de ralentización de LMNG, proporcionó una mejor estabilidad de la proteína en las micelas durante la purificación. El tampón SEC contenía detergente a una concentración 10 veces inferior a la CMC de LMNG (0,001%), minimizando efectivamente su impacto en los ensayos biofísicos posteriores. Se confirmó la homogeneidad proteica y la ausencia de agregación mediante espectrometría de masas y análisis de estabilidad térmica. Las Figuras 2, 3 y 4 ilustran la optimización exitosa de la purificación y estabilización de proteínas en concentraciones sub-CMC de detergentes.

La inmovilización de proteínas en el biosensor se controló cuidadosamente para alcanzar una saturación del 50-80% en la sonda. Un nivel de carga del 50-80% puede introducir cierto grado de limitación en el transporte masivo; sin embargo, este rango fue seleccionado para proporcionar una intensidad de señal adecuada en el sistema BLI, donde las sondas se movían entre pozos durante el ensayo. Alcanzar este nivel de inmovilización de ligandos ayudó a mantener una calidad de señal constante, aunque tales niveles de carga tienen tanto ventajas como posibles limitaciones. Incluir una sonda de referencia era fundamental para los experimentos de la BLI.

Un experimento de control adicional en el que se probaron cuatro niveles diferentes de TMEM120A inmovilizada con una concentración de un solo peptídico (100 nM). Estos datos están ahora incluidos en el manuscrito revisado (Figura Suplementaria S1). El aumento de la cantidad de proteína inmovilizada produjo señales de carga más altas, pero en todos los casos, el desplazamiento permaneció por debajo de 1 nm respecto a la línea base (Figura suplementaria S1A). Informamos de las curvas de asociación ajustada y disociación utilizando un modelo global de unión 1:1, e incluimos también los gráficos residuales, que muestran pequeñas diferencias no significativas entre los datos ajustados y experimentales.

En los ensayos cinéticos principales (analitos 5-100 μM), las constantes de tasa ajustadas mostraron las tendencias esperadas dependientes de la concentración. Los valoresde k off variaban aproximadamente entre 1,48 × 10⁻⁴ y 1,43× 10⁻³ s⁻¹, mientras que los valores k variaban entre 1,12 × 10² a 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Estos cambios graduales a lo largo de la serie de concentraciones son consistentes con la asociación normal dependiente del analito y el comportamiento de disociación.

En el experimento control, donde se probaron diferentes niveles de carga de la sonda a una sola concentración de analito (100 nM), las cuatro trazas arrojaron constantes cinéticas muy similares. Los valoresde k off eran consistentemente 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, y los valores de ken consistentemente eran 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ en todos los niveles de carga. Esta falta de variación sugiere que ni la fase de asociación ni la de disociación se vieron afectadas por la densidad de la sonda, las limitaciones del transporte de masa o la reunión de analitos.

También se espera que la disociación a 100 nM parezca más rápida en el experimento de control. La concentración de analitos de 100 nM está aproximadamente un orden de magnitud por debajo de KD, y a concentraciones muy por debajode K D el complejo es menos estable y la ocupación efectiva es baja. Bajo tales condiciones, la disociación avanza más rápidamente porque la afinidad de unión es más débil a bajas concentraciones de analito, y la reasociación durante la fase de disociación es mínima. Este comportamiento se alinea con lo que normalmente se observa cuando la concentración del analito es sustancialmente inferior a KD.

En conjunto, la consistencia de los parámetros cinéticos a través de las cargas de la sonda y el comportamiento esperado a bajas concentraciones de analito apoyan la idea de que las constantes de tasa observadas reflejan propiedades genuinas de unión más que artefactos derivados de la carga superficial o los efectos del transporte de masa.

Cinética e interpretación de la vinculación:
El análisis cinético se realizó utilizando un modelo de asociación-disociación de Langmuir 1:1 con una estrategia local de ajuste completo, en la que las concentraciones individuales de los analitos se ajustaron de forma independiente dentro de un marco cinético compartido (Figura 6B). Este enfoque se eligió en lugar del ajuste global tradicional porque ciertos conjuntos de datos, especialmente en concentraciones más bajas de ligandos, mostraban solapamientos menores o desviaciones tempranas de fase probablemente causadas por limitaciones en el transporte de masa y efectos de las micelas detergentes en la difusión de proteínas. El ajuste global asume que todas las trazas siguen estrictamente el mismo comportamiento cinético, que puede verse comprometido cuando la accesibilidad superficial o el microambiente local difieren ligeramente entre concentraciones. El ajuste completo local permitió modelar cada concentración de analito de forma independiente, manteniendo un marco cinético consistente, asegurando que los parámetros derivados reflejaran con precisión el comportamiento en cada concentración. Las curvas ajustadas (rojo) coincidían estrechamente con las trazas experimentales, lo que proporcionó una constante de disociación estimada (KD) en el rango de micromolares bajos. El análisis residual (Figura 6C) no reveló desviaciones sistemáticas importantes, lo que respalda la idoneidad del modelo para estas interacciones proteicas de membrana solubilizadas en detergente.

TMEM120A M207A y GsMTx4 mostraron valores de KD en el rango bajo de micromolares (∼0,8-3,3 μM). La tasa de asociación (kon) aumentó modestamente con la concentración de ligandos, mientras que la tasa de disociación (koff) se mantuvo muy lenta, lo que indica la formación estable de complejos. La rápida desintegración inicial de la señal durante los primeros 5-10 segundos de disociación probablemente reflejaba sitios de unión fácilmente accesibles, mientras que la fase más lenta representaba interacciones más estables (Figura 6A). Estas observaciones destacan la importancia de seleccionar cuidadosamente las ventanas de disociación y considerar las limitaciones del transporte masivo al analizar proteínas de membrana solubilizadas en detergente (Tabla 2).

Limitaciones y solución de problemas:
Deben considerarse varias limitaciones para proteínas de membrana solubilizadas en detergente como TMEM120A M207A. Los efectos del transporte de masa pueden producirse durante la fase inicial de asociación, ya que la proteína puede difundirse lentamente hacia la superficie del biosensor, lo que puede distorsionar ligeramente las mediciones cinéticas. La sobrecarga de los sensores es posible si la saturación de la sonda supera el rango recomendado del 50-80%, lo que podría limitar la precisión del análisis cinético global y afectar los valores de kon y koff. Los efectos dependientes del detergente pueden influir en la estabilidad de las proteínas, el estado oligomérico o la accesibilidad superficial, especialmente en concentraciones superiores o cercanas a la CMC. Factores adicionales incluyen una deriva menor de la línea base, unión inespecífica y dificultades para captar la cinética de una disociación muy lenta.

Muchos de estos problemas pueden mitigarse con ajustes simples: reducir la carga de proteínas para evitar la sobresaturación, optimizar la composición del buffer e incluir sondas de referencia para corregir la deriva de referencia o señales inespecíficas. En este estudio, el tampón SEC que contiene 0,00015% LMNG y bajas concentraciones de Tween-20 minimizó eficazmente la unión inespecífica manteniendo la estabilidad proteica. Seleccionar cuidadosamente la ventana de disociación para el ajuste cinético, junto con mediciones de réplicas y análisis de residuos, también fue importante para confirmar la fiabilidad de los parámetros cinéticos. Estas estrategias generalmente mejoran la reproducibilidad y ayudan a generar datos más robustos e interpretables. Se empleó un ajuste completo local en lugar del ajuste global para tener en cuenta las diferencias menores entre trazas en concentraciones individuales de ligandos, asegurando que los parámetros cinéticos reflejaran con precisión el comportamiento de cada conjunto de datos.

BLI y otras técnicas biofísicas:
En comparación con la resonancia plasmónica superficial (SPR) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la interferometría de biocapas (BLI) ofrece varias ventajas prácticas para analizar las interacciones entre proteínas de membrana y ligando. Al igual que SPR e ITC, BLI puede proporcionar información detallada sobre las interacciones de unión, incluyendo tasas de asociación (kactivadas), tasas de disociación (kdesactivada) y constantes de disociación de equilibrio (KD), sin requerir sistemas microfluídicos complejos ni alta concentración de proteínas14. El formato de pozo abierto, inmersión y lectura, permite un intercambio rápido de búfer y procesamiento paralelo de múltiples muestras, apoyando un mayor rendimiento experimental. A diferencia de la ITC, que requiere grandes cantidades de proteína altamente pura y proporciona datos termodinámicos, el BLI puede medir tanto las tasas de formación de complejos como de disociación a partir de una concentración mínima de muestra en nanomolar. BLI también es compatible con tampones que contienen detergentes o lípidos, lo que lo hace adecuado para proteínas de membrana de bajo rendimiento o inestables que resultan difíciles de estudiar con otros métodos biofísicos. A pesar de estas ventajas, técnicas complementarias como SPR o ITC siguen siendo útiles para confirmar la consistencia termodinámica y verificar los parámetros de unión en condiciones libres de detergente y en condiciones de detergente, pero requieren una alta concentración deproteínas 3.

Direcciones futuras:
Este flujo de trabajo puede ampliarse para estudiar otras proteínas de membrana, interacciones proteína-lípidos o el cribado de moduladores de moléculas pequeñas. Combinar el BLI con enfoques ortogonales como la fotometría de masas, la caracterización estructural o la crio-EM podría proporcionar información más detallada sobre la oligomerización, la estequiometría y los mecanismos de unión. Una optimización adicional también puede permitir el análisis de ligandos de alta afinidad, interacciones multivalentes o complejos en entornos lipídicos más nativos.

En conclusión, un control cuidadoso de la inmovilización de proteínas, la concentración de detergente y las condiciones del tampón permite a BLI generar datos cinéticos fiables y reproducibles para TMEM120A M207A y proteínas de membrana similares y desafiantes. Aunque existen limitaciones inherentes, el método proporciona una plataforma sólida para estudiar interacciones específicas, de afinidad moderada entre proteína y ligando, bajo condiciones experimentales bien definidas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente a la plataforma de investigación de la Universidad de Melbourne, la Melbourne Protein Characterisation (MPC) Facility, por su apoyo en la purificación y caracterización de proteínas. La investigación contó con el apoyo de la subvención Ideas del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) (2020/GNT2000934 a I.R.) y del Australian Research Council (Centros de Formación en Transformación Industrial, IC200100052 a I.R. y M.M.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Filtro centrífugo Amicon Ultra, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Sonda Anti-FLAGGator Bio160036BLI
Gel de afinidad ANTI-FLAG M2Sigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comCreación de la Figura 1 
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich9048-46-8Fotometría de masa
Medio CD 293 (1x)Thermofisher11913019Cultivo celular
Centrífuga 5920 R: gran capacidad y alto rendimientoEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, Cocktail de inhibidores de proteasas libres de EDTAMerck11836170001Purification
Deoxiribonucleasa I del páncreas bovinoSigma-Aldrich9003-98-9Purification
Kit de transfección ExpiFectamine 293ThermofisherA14524Transfección
Software Gator BioGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
Suplemento GlutaMAXThermofisher35050061Cultivo celular
GsMTx4 trifluoroacetatoSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
Células HEK293T/SF17 adaptadas al crecimiento en suspensiónATCCATCC CRL11268Cultivo celular
LMNG (Lauril maltosa neopentyl glicol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Capilares de alta sensibilidad PrometheusNano TemperPR-C006Estabilidad termodinámica
Prometheus PantaNano TemperNAEstabilidad termodinámica
Tampon Q (0.3% Glicina pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Disruptor ultrasónico de células Qsonica Q500 SonicatorQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Gen TMEM120A (M207A) sintetizado clonado en el plásmido pCDNA 3.1 con un enlace FLAG-3CGenScript BiotechNAPlásmido
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAFotometría de masa

Referencias

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

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