Artículo de método

Perfilado electrofisiológico despierto de la corteza prefrontal ventromedial en un modelo murino de depresión y enfermedad de Parkinson

DOI:

10.3791/69366

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30 de diciembre de 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

En este artículo

Resumen

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Utilizando un modelo murino similar a la enfermedad de Parkinson (EP) que sobreexpresa la forma mutante A53T de alfa-sinucleína humana (h-α-Syn) en el núcleo del rafe dorsal (DR), hemos desarrollado un método de registro electrofisiológico para investigar el papel del circuito ventromedial prefrontal (vmPFC)-DR en trastornos depresivos/de ansiedad en la EP.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aunque la enfermedad de Parkinson (EP) se conoce principalmente como un trastorno motor, los síntomas no motores suelen aparecer antes de los déficits motores y afectan significativamente la progresión de la enfermedad, siendo cruciales en todas las fases de la enfermedad. Entre estos, la depresión y la ansiedad son los síntomas más prevalentes y causan una mayor carga sintomática en mujeres que en hombres. Las alteraciones en el sistema serotoninérgico (5-HT) se relacionan frecuentemente con trastornos del estado de ánimo, y se han observado acumulaciones de α-sinucleína (α-Syn) en los núcleos del rapo (RN) de 5-HT en pacientes con enfermedad de Parkinson (EP) y depresión. Por tanto, es fundamental comprender los circuitos neuronales que subyacen a estos síntomas no motores.

Aquí presentamos un protocolo mejorado para investigar el papel del circuito de la corteza prefrontal ventromedial (vmPFC)-núcleo del rafe dorsal (DR) en trastornos del estado de ánimo asociados a la EP, utilizando un modelo femenino murino que sobreexpresa la forma mutante A53T de la α-syn humana (h-α-syn) en la DR. Nuestro método permite una evaluación de alta resolución de la actividad neuronal en las cortezas infralímbica (IL) y prelímbica (PL) tanto bajo condiciones basales como durante el condicionamiento aversivo y la extinción. Utilizando un paradigma de condicionamiento sensorial tono-luz en ratones despiertos y con la cabeza fija, empleamos sondas electrofisiológicas multicanal para registrar las respuestas neuronales. Los experimentos se realizaron en pasillos de realidad virtual, combinando una cinta de correr cilíndrica con una pantalla visual de doble pantalla para mantener el compromiso conductual asegurando al mismo tiempo un control preciso de los estímulos sensoriales y la estabilidad de la grabación.

Este protocolo se basa en la implicación establecida de las cortezas IL y PL en el condicionamiento y extinción del miedo, y proporciona un marco sólido para examinar la actividad neuronal dinámica en circuitos implicados en conductas depresivas y similares a la ansiedad en la EP. Al permitir mediciones conductuales y electrofisiológicas simultáneas bajo condiciones controladas, este enfoque ofrece una herramienta poderosa para esclarecer los mecanismos neurobiológicos de los síntomas no motores en la EP y para probar posibles intervenciones.

Introducción

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La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno motor, pero se sabe que los síntomas no motores preceden a las manifestaciones motoras y son críticos en todas las etapas de la enfermedad1, 2, 3 y 4. Entre estos, la depresión y la ansiedad son los síntomas neuropsiquiátricos más prevalentes, afectando gravemente la calidad de vida de los pacientes con EP y provocando una mayor carga sintomática en las mujeres que en loshombres. A pesar de ello, a menudo están infradiagnosticados y tratados de formainadecuada. Por todas estas razones, es esencial comprender la neurobiología y los circuitos implicados en los síntomas neuropsiquiátricos de la EP para estratificar a los pacientes y ofrecerles una atención más personalizada.

Aunque la etiología de la MP sigue siendo parcialmente incierta, se han identificado varias características neuropatológicas clave. La enfermedad se caracteriza por la degeneración progresiva y pérdida de neuronas y fibras dopaminérgicas (DA) en el sistema nigrostriatal, lo que conduce a los déficits motores prototípicos asociados con la EP 7,8. Otra característica distintiva de la DP es la presencia de cuerpos de Lewy (LB) y neuritas de Lewy —inclusiones intracelulares formadas por agregados de proteínas fibrilares— compuestas predominantemente por la proteína α-sinucleína (α-Syn)9,10. Los estudios de neuroimagen también revelan que otros sistemas de neurotransmisores están afectados —incluso antes de la implicación de la DA— entre ellos, el sistema serotoninérgico (5-HT) 11,12,13. Los cambios en el sistema serotoninérgico (5-HT) se asocian comúnmente con trastornos del estado de ánimo, y se han detectado depósitos de α-sinucleína (α-Syn) en los núcleos de rapo (RN) de 5-HT de personas diagnosticadas con enfermedad de Parkinson (EP) ydepresión 14.

Los núcleos dorsales del rafe (DR) son el núcleo 5-HT más grande en el RN15, desempeñando un papel fundamental en la regulación emocional, la percepción, la recompensa, la agresión y las interacciones sociales. En consecuencia, la disfunción en la RD está asociada con trastornos neuropsiquiátricos como el estrés, la ansiedad y la depresión15,16. En este punto, es importante destacar la fuerte conexión funcional y anatómica bidireccional entre la DR y la corteza prefrontal (CPF), una región cerebral esencial para funciones cerebrales de orden superior. Mientras que las regiones más dorsales de la CPF están relacionadas con las funciones cognitivas, las áreas más ventromediales (vmPFC) desempeñan un papel fundamental en la regulación emocional, el control de la acción, la memoria y la toma de decisiones17,18. Por lo tanto, la vmPFC y la DR conjuntos influyen significativamente en el estado de ánimo, y la actividad alterada en este circuito se asocia con síntomasdepresivos 18. Además, se ha demostrado que la acumulación de formas agregadas de α-Syn en neuronas 5-HT en la enfermería induce ansiedad y fenotipos similares ala depresión 19,20,21.

Utilizando un modelo femenino murino con EP y fenotipo depresivo que sobreexpresa la forma mutante A53T de α-syn humana (h-α-syn) en la RD mediante un vector viral adenoasociado (AAV), hemos desarrollado un método de registro electrofisiológico. Este método tiene como objetivo investigar el papel del circuito vmPFC-DR en trastornos depresivos/de ansiedad en la EP. Este enfoque implica evaluar la actividad neuronal de las cortezas infralímbica (IL) y prelímbica (PL) en ratones despiertos mediante registros de potenciales de campo local y de una sola unidad (LFPs). Esto se consigue utilizando una sonda multicanal junto con un runner de realidad virtual. Reconociendo la implicación de las cortezas PL e IL en el condicionamiento aversivo, también medimos su actividad durante dicho paradigma para evaluar su función en situaciones de estrés. Es crucial entender que la PL impulsa principalmente las respuestas condicionadas, mientras que la corteza IL desempeña un papel clave en la extinción de estasrespuestas 22,23.

El siguiente protocolo describe los pasos para implantar una barra de cabeza y registrar de forma aguda la actividad eléctrica de las cortezas PL e IL in vivo. Lo conseguimos mediante un corredor de realidad virtual, que combina una cinta de correr cilíndrica para ratones con cabeza fija con una pantalla visual de doble pantalla. El protocolo está estructurado en cuatro etapas principales: (1) cirugía de implantación de barra de cabeza, (2) habituación, (3) registro y adquisición de señales, y (4) análisis de datos: ordenación de picos y preprocesamiento de datos.

Tres semanas después de inducir la sobreexpresión de h-α-syn en el sistema 5-HT cerebral, los ratones se someten a la cirugía de implantación de barra de cabeza, que permite la posterior fijación de la cabeza. Tras un periodo de recuperación de una semana, los ratones se acostumbran durante 4 días tanto al experimentador como a la cinta de correr y al sistema de fijación de la cabeza. El día de la grabación, esta configuración se utiliza para registrar la actividad neural de las cortezas PL e IL bajo condiciones basales y durante el condicionamiento aversivo. Los datos neuronales en bruto se procesan mediante ordenación automática de picos con Kilosort4 seguida de una curación manual en Phy2, para extraer clústeres de una sola unidad de alta calidad para análisis posteriores (Figura 1).

El protocolo propuesto de grabación vmPFC multicanal y despierto y fijo ofrece varias ventajas en comparación con alternativas clásicas como preparaciones anestesiadas o ex vivo y grabaciones inalámbricas en animales en movimiento libre. A diferencia de los enfoques anestesiados o ex vivo, este método permite evaluar la actividad de la vmPFC bajo estimulación visual y auditiva controlada dentro de un entorno de realidad virtual, lo cual es esencial para implementar paradigmas de condicionamiento aversivo24,25. A diferencia de las grabaciones en movimiento libre, la configuración con cabeza fija proporciona un control experimental preciso sobre las entradas sensoriales y las contingencias de tareas, reduciendo así la variabilidad y permitiendo estructuras de ensayo consistentes. Además, la fijación de cabeza reduce el riesgo de desenganche de tarea observado en paradigmas de movimiento libre, especialmente bajo estimulación aversiva, permitiendo aún grabaciones multicanal establesy de alto rendimiento 26.

Desde una perspectiva práctica, este protocolo requiere que los animales estén acostumbrados a la fijación de la cabeza y a correr en cinta, pero se beneficia de sistemas de fijación de cabeza disponibles comercialmente y relativamente asequibles que incorporan cintas de correr cilíndricas. Esto hace que el enfoque sea accesible para laboratorios más pequeños, ya que las sondas pueden reutilizarse varias veces (hasta ~10 inserciones), reduciendo sustancialmente los costes en comparación con implantes crónicos de movimiento libre. En consecuencia, este método proporciona un equilibrio entre control experimental, relevancia conductual y coste-efectividad. Otro factor a considerar es la implementación del paradigma de condicionamiento aversivo. En este estudio, empleamos un diseño experimental basado en la aversión natural de los roedores a la luz: 10 tonos auditivos (estímulos condicionados) fueron seguidos cada uno por una breve exposición a luz intensa (estímulo incondicionado). Aunque este patrón es menos estresante que otros métodos clásicos de condicionamiento, como los que implican descargas eléctricas, constituye un factor de estrés más similar en el mundo real.

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Protocolo

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Todos los experimentos se realizaron con controles de edad igual, y los procedimientos en animales se diseñaron conforme a las reglas de los 3R; realizada conforme a las directrices éticas establecidas en la Directiva de la UE 2010/63 (22 de septiembre de 2010), la legislación española (RD 1201/2005, L.32/2007 y L.6/2013) y aprobada por la Generalitat Valenciana (ES462500001003; ref. 2023-VSC-PA-0073), y el Comité Local de Bioética de la Universidad de Valencia (ref. A20230214153605).

NOTA: Para garantizar la seguridad y prevenir la contaminación, durante todo el procedimiento, lleva equipo de protección personal, incluidos guantes y botines desechables, bata de laboratorio, mascarilla y una rede para el pelo. Utilizar sistemas de recuperación de medicamentos veterinarios para la eliminación de residuos derivados de su uso, de acuerdo con la normativa local y los programas nacionales de recuperación aplicables.

1. Generación de modelos de ratón

NOTA: Las hembras adultas de ratones C57BL/6J (9 semanas) fueron alojadas bajo condiciones ambientales controladas (22 ± 1 °C; ciclo luz/oscuro de 12 horas) con acceso improvisado a comida y agua.

  1. Bajo anestesia isoflurana (4% para inducción, 2% para mantenimiento) en la cámara de anestesia del ratón, asignar aleatoriamente a los ratones para recibir microinyecciones estereotáxicas en la DR (coordenadas relativas al bregma: anteroposterior [AP] −4,5 mm, mediolateral [ML] −1,0 mm, dorsoventral [DV] −3,2 mm; ángulo de inyección: 20°) usando un microinyector automatizado a un caudal de 0,4 μL/min, como se describióanteriormente 19,27,28.
  2. Asegúrese de que cada ratón reciba un volumen total de 0,6 μL de un virus recombinante adeno-asociado serotipo 1/2 (AAV1/2; concentración: 5,16 × 1012 gp/mL) que codifica la forma mutante A53T de la h-α-Syn humana, para inducir la sobreexpresión en las neuronas 5-HT de la DR (n = 4) o de un vector vacío AAV1/2 que contenga ADN enllenador no codificante (AAV-EV), usado como grupo de control (n=5).
  3. Para evitar el reflujo, mantén la aguja en su sitio durante 8 minutos más antes de retirarla lentamente a una velocidad de 320-400 μm/min.
    NOTA: Por seguridad, asegúrese de que los sistemas de recogida funcionen correctamente para captar los vapores anestésicos antes de cualquier cirugía estereotáxica (secciones 1 y 2). En caso de que se derrame isoflurano al rellenar el vaporizador, límpialo inmediatamente usando un material inerte y absorbente, como serrín. Utilice sistemas veterinarios de recuperación de medicamentos para la eliminación de filtros de isoflurano y de cualquier residuo resultante de su uso, de acuerdo con la normativa local.

2. Cirugía de implantación de barra de cabeza

NOTA: Realice la cirugía de implantación de la barra de cabeza siguiendo los pasos siguientes, 3 semanas después de generar el modelo murinho.

  1. Preparación prequirúrgica y anestesia
    1. Anestesiar al animal con isoflurano (4% para inducción, 1,5-2% para mantenimiento) administrado mediante un vaporizador de isoflurano.
    2. Coloca el ratón en el aparato estereotáxico sobre una almohadilla eléctrica para mantener la temperatura corporal durante todo el procedimiento.
    3. Abre suavemente la boca del ratón para colocar sus dientes sobre la barra de mordida y coloca la mascarilla conectada a un aparato estereotáxico, para asegurar la administración continua de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia.
    4. Aplica colirios para evitar úlceras oculares.
    5. Administrar analgesia al menos 10 minutos antes de la incisión del bisturí mediante inyección subcutánea de butorfanol (5 mg/kg en solución salina).
    6. Aplicar lidocaína regional (0,03 mL en cada oído, 4 mg/kg, no exceder las dosis máximas de 7 mg/kg o crema de lidocaína/prilocaína [25 mg/g de lidocaína y 25 mg/g de prilocaína]) en el oído interno para reducir el malestar causado por las barras auriculares.
  2. Posicionamiento estereotáxico y preparación del cráneo
    1. Coloca las barras para sujetar la cabeza de forma firme, asegurando simetría y el mínimo movimiento.
    2. Ajusta la barra incisiva para que el bregma y el lambda queden al mismo nivel horizontal, asegurándote de que estén en la línea media.
    3. Confirma la inducción de la anestesia comprobando la pérdida de retirada del pedal, reflejos palpebres, disminución de la frecuencia respiratoria y ausencia de movimiento de bigotes.
    4. Asegúrate de que el ratón esté correctamente colocado en el marco estereotáxico con las barras auriculares cuidadosamente ajustadas.
    5. Afeita la zona quirúrgica y desinfectala usando una solución antiséptica (povidona-yodo seguida de etanol al 70%) para minimizar el riesgo de infección.
    6. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo y retrae suavemente los tejidos subyacentes para exponer el cráneo mientras mantienes la hemostasia. Asegúrate de que la piel esté lo suficientemente abierta para visualizar las crestas parietotemporales. Para lograrlo, coloca cuatro finas pinzas bulldog en la fascia bajo la piel para maximizar la exposición.
    7. Limpia y seca a fondo el cráneo expuesto para una vista clara de los puntos anatómicos (bregma y lambda).
    8. Nivelar el cráneo en el eje anteroposterior alineando el bregma y el lambda en el mismo plano horizontal.
    9. Nivelar el cráneo en el eje mediolateral igualando la profundidad de ambas crestas parietotemporales.
  3. Perforación y colocación de implantes
    1. Perforar un agujero de 1 mm de diámetro por encima del vmPFC en las coordenadas AP: +1,75; ML: −0,4; DV: +3,1 (Figura 2). Utiliza el brazo estereotaxico para marcar los cuatro vértices con tinta y guiar la inserción de la sonda de silicio el día de la grabación. Además, dibuja una cruz conectando los puntos previamente descritos con un bisturí y aplicando abundante tinta para que penetre las incisiones, asegurando que las marcas permanezcan estables. Elimina cualquier exceso de tinta con un hisopo de algodón humedecido con alcohol al 70%.
    2. Perfora dos agujeros adicionales en la región posterior del cráneo, por encima del cerebelo. Inserta manualmente un cable en cada agujero para referencia futura y puesta a tierra (Figura 2), respectivamente.
      1. Alternativamente, utiliza tornillos de acero inoxidable (acero inoxidable A2, M1 × tamaño 2, o acero inoxidable 18-8, 0,061" de diámetro × 3/16" de longitud) o puentes macho de acero inoxidable. Sea cual sea la elección, asegúrate de que el elemento que proporciona el contacto eléctrico permanezca en contacto directo con la superficie cerebral sin ejercer presión para evitar daños en los tejidos, comprometer el bienestar animal o afectar negativamente la calidad de la grabación.
    3. Haz surcos poco profundos en el cráneo expuesto con un bisturí para aumentar la superficie y así mejorar la adhesión del implante.
    4. Aplicar una resina adhesiva dental intermedia sobre el cráneo limpio y seco en dos capas secuenciales: primero con la mezcla base-catalizador, dejando que se seque completamente, y luego con la mezcla que contiene polvo, asegurando la cobertura de toda la superficie y los bordes del cráneo. Comprueba con pinzas que el adhesivo entre el cráneo y el futuro cemento implante esté completamente solidificado antes de continuar.
    5. Coloque una barra de cabeza de acero inoxidable entre el orificio de registro del PFC y los orificios de referencia/rectificado (Figura 2). Alinea la barra de cabeza con el brazo estereotáxico para asegurarte de que esté completamente nivelada con el cráneo, manteniendo así coordenadas estereotáxicas precisas durante la fijación de la cabeza y la posterior inserción de la sonda de silicio.
    6. Pega todos los componentes metálicos al cráneo usando cemento dental, evitando cuidadosamente que el cemento entre en el agujero de registro.
    7. Cubre la craneotomía con silicona quirúrgica bicomponente.
      NOTA: Si se siguen cuidadosamente todos los pasos, se espera que la implantación y la posterior funcionalidad de la barra frontal se desarrollen sin complicaciones, con una tasa estimada de éxito superior al 95%.
  4. Cuidados postoperatorios
    1. Supervisa cuidadosamente la recuperación del ratón tras una cirugía cerebral, asegurándote de que el animal recupere la conciencia, mantenga la temperatura corporal y experimente alivio del dolor.
    2. Los ratones de casa individualmente en jaulas y los vigilan hasta que se recuperen por completo.
    3. Administrar butorfanol subcutáneo (5 mg/kg en solución salina) cada 12 horas durante 3 días tras la cirugía.
      NOTA: (CRÍTICO) Durante todo el procedimiento quirúrgico, monitorea continuamente los signos vitales (frecuencia cardíaca y respiratoria, saturación de oxígeno y presión arterial). Aplica colirios según sea necesario para evitar sequedad o daño corneal.

3. Habituación

NOTA: Una vez que los ratones recuperen su peso previo a la cirugía (aproximadamente entre 5 y 7 días después de la cirugía), inicie un protocolo de habituación de 4 días para aclimatar gradualmente a los animales al entorno experimental.

  1. Día 1: Realiza dos sesiones de manipulación de 10 minutos cada una, con un descanso de 1 hora entre sesiones para familiarizar a los ratones con el experimentador. Toca suavemente el ratón mientras está en el antebrazo para familiarizarlo con el experimentador.
  2. Día 2: Realiza dos sesiones de manipulación de 5 minutos. Tras cada sesión, sujeta suavemente a los ratones por la barra de cabeza en intervalos de 10 segundos durante un total de 5 minutos.
  3. Día 3: Tras una breve sesión de manipulación, deja que los ratones corran libremente en la cinta durante 7 minutos. Luego, fija la cabeza y mantén los ratones en la posición fija durante 5 minutos.
  4. Día 4: Realiza una sesión de correr en cinta con cabeza fija de 15 minutos.
    NOTA: (CRÍTICO) Los animales que presenten pérdida de peso excesiva, barbería, disminución del comportamiento exploratorio o movilidad reducida, de acuerdo con las directrices establecidas de bienestar animal, deben ser retirados del estudio. El implante debe permanecer completamente estable. Cualquier desplazamiento requiere la exclusión del animal del estudio, ya que puede dañar la sonda multicanal durante la grabación y/o resultar en señales inestables y ruidosas.

4. Preparación de la sonda

NOTA: Para conectar la sonda a los adaptadores (Figura 3A) sigue estos pasos:

  1. Conecta el adaptador/conector de sonda al adaptador del brazo estereotráxico.
  2. Acopla 2 adaptadores de etapa de cabeza (cada uno Om32) con el adaptador de sonda (Figura 3A), asegurando que la orientación coincida y evitando una fuerza excesiva.
  3. Conecta la sonda al adaptador (Figura 3B). Para permitir grabaciones simultáneas desde regiones IL y PL a 64 profundidades distintas, se utiliza una sonda de silicio de un solo vástago y 64 canales (longitud del vástago: 8 mm; Grosor del vástago: 15 μm) (Figura 4A).
  4. Para facilitar la posterior localización de la sonda, recubre la sonda con un colorante fluorescente o partículas ferromagnéticas compatibles histológicamente, permitiendo una verificación post hoc del sitio de registro.
  5. Aplica el tinte mediante uno de los siguientes métodos:
    1. Mete todo el vástago en la solución.
    2. Libera una pequeña gota de la solución de una micropipeta sobre la sonda y extiéndela a lo largo del vástago.
    3. Usa un pincel fino mojado en la solución para pintar la parte trasera de la sonda.
    4. Para los pasos 4.5.2 y 4.5.3, aplica al menos tres trazadas para asegurar un recubrimiento adecuado del vástago.
      NOTA: Los pasos 4.1 a 4.3 solo son necesarios la primera vez que se utiliza la sonda, ya que puede reutilizarse en varias sesiones de grabación. Tras las grabaciones, desconecta los cables de interfaz periférica serie (SPI) manteniendo la sonda conectada al adaptador y los adaptadores montados en el adaptador de brazo estereráxico.

5. Grabación y adquisición de señales

  1. Monitorizar el ciclo estrolo, utilizando un protocolo no invasivo basado en la tipología celular en los frotis vaginales para asegurar que las hembras estén en la fasediestral 29,30.
  2. Sujeta al animal en una posición fija con la cabeza en una cinta de correr cilíndrica integrada con un marco estereotáxico (Figura 4B). Asegúrate de que la cinta de correr y el marco estén correctamente alineados para proporcionar estabilidad y comparabilidad entre los sujetos.
  3. Para grabar y adquirir señales, sigue los pasos 5.3.1-5.3.15.
    1. Utiliza una lente de aumento para asegurarte de que el implante permanezca completamente inmóvil.
    2. Monta el conjunto de la sonda —que comprende la sonda, los adaptadores y los adaptadores de headstage— en el brazo adaptador del marco estereotráxico.
    3. Conecta los cables SPI, previamente conectados a la placa de adquisición, a las etapas principales (Figura 3B). Lleva un registro de qué cable SPI está conectado a cada etapa principal, ya que esta correspondencia es esencial para preservar la disposición de los electrodos durante la posterior clasificación automática de los picos.
    4. Conecta el cable de tierra del adaptador de sonda al puente macho ipsilateral al hemisferio registrado, y el cable de referencia al lado contralateral. Aplica una pequeña cantidad de estaño de soldadura al cable incrustado en el cerebro y luego aplica calor brevemente para asegurar la conexión. Evita el calor excesivo para evitar daños en el tejido subyacente o en la electrónica adaptadora.
    5. Coloca una lente de aumento para visualizar el orificio hecho para la inserción de la sonda en las cortezas PL e IL. Asegúrate de que los puntos de referencia de la tinta sean claramente visibles en todo momento para mantener coordenadas estereotáxicas precisas durante el procedimiento.
    6. Guía la sonda hacia el centro del agujero VMFP usando el brazo estereotaxico y los puntos de referencia premarcados.
    7. Coloca cuidadosamente la sonda en el centro de la craneotomía y toca suavemente la superficie cerebral. Aplica solución salina tibia sobre el tejido expuesto para evitar que se seque.
    8. Empieza a bajar la sonda a una velocidad de 50 μm/min durante 4-5 minutos para minimizar la inflamación tisular. Asegúrate de que el vástago de la sonda no se doblegue durante esta inserción inicial.
    9. Mide la impedancia de los sitios de grabación y compara los valores con los proporcionados por el fabricante. Esta evaluación inicial asegura que los primeros canales que acceden al cerebro no hayan sido dañados ni bloqueados durante la inserción.
      NOTA: (CRÍTICO) Las impedancias de los electrodos deben compararse con los valores base del fabricante. Desviaciones de hasta ~30% son generalmente aceptables y no comprometen las grabaciones. Los aumentos entre el 30 y el 100% aún pueden ser utilizables, pero merecen precaución y una vigilancia más estrecha. Los cambios que superan el 100% suelen indicar daños o obstrucciones, y los lugares afectados deben considerarse poco fiables. En tales casos, la sonda debe limpiarse para reducir la impedancia como se describió anteriormente. Si las impedancias no pueden restaurarse a un rango aceptable, la sonda debe descartarse. Sin embargo, en última instancia, depende del experimentador cuántos canales poco fiables pueden tolerarse antes de descartar la sonda; Un estándar comúnmente aplicado es que no se debe comprometer más de ~10% de los canales.
    10. Sigue bajando la sonda a una velocidad de 50 μm/min mientras monitorizas la señal en directo de los canales que entran en el cerebro. Verifica que estas señales se asemejan a las de los canales previamente evaluados para confirmar la inserción correcta.
    11. Avanza la sonda hasta que alcance una profundidad de +3,1 mm DV, manteniendo la craneotomía hidratada aplicando solución salina tibia durante todo el descenso.
    12. Quita la lupa y elimina cualquier otra fuente de ruido eléctrico de la habitación.
    13. Remide la impedancia para verificar que ningún sitio de grabación quedó bloqueado durante la bajada de la sonda.
    14. Monitoriza la señal de 4-5 canales consecutivos como referencia y espera entre 90 y 120 minutos para que la señal de la sonda se estabilize. Tras este periodo de estabilización, verifica que la deriva de señal sea mínima para asegurar que la posterior clasificación automática de picos pueda aislar de forma fiable los clústeres de una sola unidad.
    15. Remide la impedancia antes de iniciar la adquisición de datos para confirmar las condiciones adecuadas del sitio de registro y establecer una medición base de impedancia. Aplica solución salina tibia regularmente para evitar que el tejido se seque. Guarda la grabación como un archivo binario (por ejemplo, .dat o .bin) para facilitar el preprocesamiento posterior de los datos.
  4. Una vez estable, sigue los pasos 5.4.1-5.4.6.
    1. Registrar la actividad neural inicial durante 30 minutos (Figura 4C).
    2. Inicia el protocolo de condicionamiento aversivo usando Arduino, 30 minutos después de la grabación basal. Este consiste en 10 tonos auditivos (10 s/tono), emitidos una vez por minuto durante 10 minutos. Cada tono es seguido inmediatamente por un estímulo luminoso de 10 segundos presentado a través de las pantallas del laberinto de realidad virtual (Figura 4C).
    3. Registra la actividad neuronal durante 10 minutos sin ningún estímulo de condicionamiento.
    4. Registrar la actividad cortical PL e IL durante el protocolo de extinción, en el que se presentan 10 tonos auditivos sin el estímulo luminoso posterior.
    5. Registra la actividad neuronal durante otros 10 minutos en ausencia de estímulos.
    6. Para la grabación.
  5. Procedimientos posteriores a la grabación: Tras completar la sesión de grabación, siga el paso 5.5.1.
    1. Retirada de la sonda: Aplicar solución salina tibia y retirar cuidadosamente la sonda a una frecuencia de 100-150 μm/min mientras se monitorizan continuamente las señales del electrodo para evitar daños mecánicos en la sonda y el estiramiento del tejido, que podrían comprometer la posterior reconstrucción histológica.
    2. Una vez retirada la sonda del cerebro, remojas inmediatamente el vástago en agua destilada durante 10 minutos para evitar que el tejido adherido se seque.
    3. Anestesiar al animal con pentobarbital sódico (100 mg/kg). Luego, dentro de una campana extractora química, perfundir al ratón transcádicamente con 80 mL de solución salina (0,9%), seguido de 80 mL de paraformaldehído al 4% diluido en PB (0,1 M, pH 7,6).
      1. Para evitar el paraformaldehído, el contacto e inhalación, utiliza equipos de protección ocular y facial, guantes de protección química y una mascarilla antipolvo. Al final de la perfusión, deposita el paraformaldehído restante en un recipiente para disolventes no halogenados.
      2. En caso de derrame, humedece el material para evitar la dispersión del polvo y colócalo en recipientes sellados. Limpia las zonas contaminadas y las superficies de trabajo con lejía para neutralizar el paraformaldehído.
    4. Extrae el cerebro, fija después la noche a 4 °C y almacena un 30% de sacarosa en cacahuete de cacahuete (0,1 M, pH 7,6) a 4 °C para crioprotección. Obtén secciones coronales de 30 μm usando un microtomo congelante y monta las cortes sobre portaobjetos de vidrio gelatinizado.
      NOTA: Estas secciones se utilizarán para confirmar la sobreexpresión de α-Syn de DR mediante inmunohistoquímica como antes19, 20, 21y la ubicación de la sonda.
    5. Limpieza con sonda: Sumergir la región implantable de la sonda en una solución enzimática de detergente al 1% en agua destilada durante 1 hora.
    6. Remojas el vástago de la sonda en agua destilada otros 10 minutos para eliminar los restos del detergente.
    7. Seca durante 20-30 minutos en posición vertical. Tras el secado, inspecciona la sonda con un microscopio para confirmar que no quedan tejidos ni restos en los lugares de registro. Si la sonda está completamente limpia, sumérgela en alcohol isopropílico de alta calidad durante 1 minuto y guárdala en su caja antiestática original.

6. Análisis de datos: Ordenación de picos y preprocesamiento de datos

NOTA: Para analizar registros neuronales extracelulares y atribuir picos individuales a neuronas específicas, utilice el algoritmo de clasificación de picos Kilosort431 .

  1. Realiza la clasificación automática de picos usando Kilosort431. En la interfaz gráfica de Kilosort4, selecciona el archivo binario de grabación y especifica la disposición de la sonda según la hoja de configuración del fabricante. Ejecuta la ordenación de picos usando los parámetros por defecto, que son ideales para capturar las formas de onda registradas en las cortezas IL y PL sin ajustes adicionales.
  2. Inspecciona la salida de Kilosort usando Phy2 (kwikteam/phy) para una curación manual adicional. Incorporar plugins desarrollados por la comunidad (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin) para añadir funcionalidades adicionales a Phy2 y mejorar la calidad de los datos seleccionados.
  3. Etiqueta como ruido y descarta cualquier grupo con una frecuencia <0,05 Hz o que contenga menos de 500 picos.
  4. Además, marca los siguientes grupos como ruido:
    1. Marca aquellos que muestran autocorrelogramas triangulares como ruido.
    2. Marca como ruido aquellos con formas de onda que no se parezcan a picos.
    3. Marca como ruido aquellos detectados en un solo canal de grabación o en todos los canales con amplitud variable.
    4. Marca como ruido aquellos que presentan una fuerte periodicidad en sus autocorrelogramas.
  5. Selecciona solo los grupos que presenten formas de onda fisiológicamente apropiadas, evidencia de un valle refractario en el autocorrelograma, variaciones plausibles de amplitud y componentes principales claramente separados.
  6. Limpia manualmente cada clúster aplicando la eliminación de outliers basados en distancias de Mahalanobis.
  7. Sigue revisando las formas de onda y los cambios de amplitud como indicadores clave de la validez de la limpieza manual.
    NOTA: Una vez completada la ordenación de picos, los patrones de actividad neuronal del vmPFC pueden analizarse usando las rutinas implementadas en Python.

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Resultados

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Los registros recientes de actividad cortical de PL e IL, utilizando el protocolo experimental detallado, revelan hallazgos significativos: la sobreexpresión de h-α-Syn en la DR, que induce un fenotipo similar a la ansiedad en ratones hembras, también altera la actividad vmPFC ventromedial. Mediante análisis basados en Python, demostramos que la sobreexpresión de α-Syn en neuronas 5-HT del núcleo DR alteraba la dinámica de disparo y la organización funcional del circuito vmPFC-DR, reduciendo la distinción electrofisiológ...

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Discusión

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Este protocolo presenta una metodología robusta para la evaluación electrofisiológica in vivo de las cortezas PL e IL en ratones despiertos con la cabeza fija, utilizando un sistema de corredor de realidad virtual. La importancia de este método radica en su capacidad para investigar el circuito vmPFC-DR directamente en ratones despiertos y comportándose dentro de un modelo de PD. Aunque la fijación de la cabeza restringe los movimientos de los animales y puede ser estresante, of...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo ha sido financiado por la beca BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) 2023, la subvención MCIU/AEI/FEDER UE PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Gobierno de Cataluña (AB), y PID2022-141733NB-I00 (VT). También queremos agradecer a la Red Española para la Investigación sobre el Estrés, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y CB/07/09/0034 Centro de Investigación Biomédica en Salud Mental Network (CIBERSAM). MSA cuenta con una Beca Margarita Salas (MS21-132) de la Universidad de Valencia (reclasificación del Sistema Universitario Español del Ministerio de Universidades del Gobierno de España, financiada por la Unión Europea y Next Generation UE).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AAV1/2-CMV/CBA-Humano A53T aSyn-WPRE-BGH-polyARío CharlesGD1001-RVHumano A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Vacío-WPRE-BGH-polyARío CharlesGD1004-RVControl de vectores vacíos
ADPT A64-Om32x2Cambridge NeuroTechOmnetics 2228Adaptador
silicona quirúrgica bicomponente  Instrumentos de Precisión MundialKWIK-SIL
Butorphanol Torbugesic vet / cymit quí Mica67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Kalma43640cemento dental y nbsp;
Sonda multicanal H9Cambridge NeuroTechASSY-77 H9
Crema EMLA (Lidocaína / pricolaína) Lirios Vañ &agudo; Farmacia Sempere679290
microinyector Instrumento de Precisión MundialKDS-310-PLUS
MSS Isoflurane Vaporizer  Suministros y Servicios Médicos, Reino UnidoMSSVAP02 
Junta de Adquisiciones de Open EphysOpen EphysOEPS-9029Junta de adquisiciones; La Junta de Adquisiciones Open Ephys puede transmitir hasta 512 canales de datos neuronales a un ordenador vía USB
C& B MetaBond ParkellS380-RDCemento adhesivo rápido
Pentobarbital Vetoquinol Dolletal / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLBarbitúricos
Canal derecho 32 y nbsp; Escenario principalIntan Technologies#C3314adaptador head-stage  
SiccafluidThea S.A. Laboratories / Lirios Vañ &agudo; Farmacia Sempere6515167Gel oftálmico & nbsp;
aparato estereotaxico Stoelting51730U
marco estereotáxicoNarishigeSR-6N/SM-15R
Terg-a-zymaSigma AldrichZ273287Solución de limpieza de sonda

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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