Artículo de método

Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP

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DOI:

10.3791/69369

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5 de diciembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método escalable para la expansión de productos de Terapias Celulares Adoptivas (ACT), concretamente células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)-T y células Killer inducidas por citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansión rápida permeable a gas (G-Rex), demostrando un crecimiento eficiente y robusto en un entorno clínicamente relevante.

Resumen

Las terapias celulares adoptivas (ACT) han avanzado rápidamente en los últimos años, desempeñando un papel fundamental en la inmunoterapia contra el cáncer e influyendo significativamente en los resultados del tratamiento. Un paso fundamental en el desarrollo de la terapia celular, tanto en las etapas preclínica como clínica, es el proceso de fabricación. Los métodos convencionales de cultivo estático requieren manipulación celular frecuente y a menudo están limitados por la reducción del intercambio gasoso y el suministro de nutrientes, lo que puede comprometer el rendimiento y el fenotipo celular. Aquí presentamos un protocolo paso a paso, reproducible y escalable para la expansión ex vivo de dos productos ACT, a saber, las células del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)-T y las células Asesino inducidas por citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansión rápida permeable a los gases (G-Rex). Los dispositivos G-Rex están diseñados específicamente para mejorar el intercambio de nutrientes y apoyar cultivos de alta densidad con una intervención mínima del usuario. Entre los diversos enfoques ACT, las células CAR-T han demostrado un éxito notable en el tratamiento de malignidades hematológicas, facilitando un rápido avance desde la investigación experimental hacia aplicaciones clínicas. Además de las células CAR-T, las células CIK también se han utilizado ampliamente en ensayos clínicos debido a su fenotipo característico y a la ausencia de eventos adversos relacionados con el tratamiento y la enfermedad Injerto contra Huésped (GvHD). Este protocolo describe los pasos técnicos clave para ambos tipos celulares, comenzando con el aislamiento y la siembra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Brevemente, los PBMC se estimulan con anticuerpos anti-CD3/CD28, seguidos de transducción lentiviral para expandir las células CAR-T, o con interferón-γ (IFN-γ), anticuerpo anti-CD3 e interleucina 2 (IL-2) para obtener células CIK. Se emplea citometría de flujo para monitorizar la viabilidad y el fenotipo de las células, y se realizan ensayos funcionales para confirmar el potencial terapéutico del producto celular y validar la escalabilidad del enfoque. En conjunto, este protocolo proporciona una solución práctica para producir un gran número de células efectoras en un entorno preclínico, facilitando la aplicación clínica en varias poblaciones de células inmunitarias. Finalmente, ofrece una solución escalable para la fabricación de celdas efectoras de alto rendimiento.

Introducción

La terapia celular adoptiva (ACT) se ha convertido en un pilar importante de las terapias avanzadas para el tratamiento del cáncer. Este enfoque se basa en la administración de productos celulares expandidos ex vivo para lograr eficaciaantitumoral 1. Hasta la fecha, se han utilizado muchos tipos celulares en ACT, desde enfoques antígeno-específicos (por ejemplo, asesino natural (NK)2, asesino inducido por citocinas (CIK)3,4, asesino natural T (NKT)5 o células Tγδ 6, hasta células altamente específicas y personalizadas, como linfocitos infiltrantes en tumores (TIL)7 y terapias basadas en células diseñadas, por ejemplo, receptor de antígenos quiméricos (CAR)1. 8 y células receptoras de células T (TCR) 9,10.

Las células CAR-T son células T genéticamente modificadas generadas por transducción viral ex vivo para expresar un receptor inmunitario sintético diseñado para reconocer un objetivo molecular específico. La estructura CAR consiste en un anticuerpo de fragmento variable de cadena única (scFv) específico para antígeno combinado con dominios de señalización intracelulares, incluyendo la cadena TCRζ y moléculas coestimuladoras. Al activarse con antígenos, el dominio intracelular entrega señales de activación que promueven la proliferación de células T y la actividadantitumoral 11.

Las células CIK son una población heterogénea de linfocitos T activados que adquieren expresión de CD56 durante la expansión ex vivo a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (UCB)12. Esta expansión implica estimulación con interferón-γ (IFN-γ), anticuerpo monoclonal anti-CD3 e interleucina-2 (IL-2), seguida de un cultivo en IL-2 durante 14 días. Las células CIK se parecen funcionalmente tanto a las células NK como a las T, ejerciendo actividad antitumoral tanto a través de mecanismos independientes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) como de mecanismosdependientes 13,14,15,16. Estas propiedades permiten que las células CIK se utilicen tanto en entornos terapéuticos alogénicos como autólogos con un riesgo mínimo de enfermedad del injerto contra el huésped (GvHD) 17.

En la práctica clínica, tanto las terapias celulares CAR-T como CIK requieren la administración de un gran número de células. Las células CAR-T se infunden entre 50 y 200 millones de dosis por paciente18. De manera similar, las células CIK suelen administrarse en dosis de hasta 10.000 millones de células por infusión, con pacientes que suelen recibir múltiples infusiones según el protocolode tratamiento 19. Los métodos tradicionales de cultivo celular que utilizan matrazas o placas son ineficientes, tardados y requieren un paso frecuente, lo que hace inviable la expansión a gran escala y aumenta el riesgo de contaminación. Los sistemas automatizados o semiautomatizados que utilizan cultivos en bolsas o biorreactores permiten una expansión a gran escala, pero presentan limitaciones, es decir, esfuerzo cortante o la necesidad de ajustes de densidad y perfusión frecuente de medios20,21, y la manipulación de un lote a la vez, lo que conlleva altos costes tanto en contextos académicos como industriales. En esta situación desafiante, una alternativa está representada por el dispositivo de expansión rápida permeable al gas (G-Rex), un método de cultivo estático que incorpora una membrana de silicio en el fondo del pozo, que asegura un intercambio eficiente de osígeno y una mayor altura de los recipientes, permitiendo una capacidad de medios de alto volumen. Así, el sistema apoya el crecimiento celular sin reemplazo de medio ni ajuste dedensidad 22,23. Los sistemas G-Rex-M han demostrado escalabilidad de hasta 5000 mL y son compatibles con sistemas automatizados de cosecha, proporcionando una plataforma de cultivo cerrado y libre de contaminaciones que es fácilmente trasladable del ámbito académico al clínico para el desarrollo de medicamentos de terapia avanzada (ATMP)24.

En el procedimiento descrito, aprovechamos las ventajas y características de los dispositivos G-Rex para optimizar el protocolo de expansión tanto de las células CAR-T como CIK. Demostramos que ambos tipos celulares pueden expandirse y escalarse eficientemente, manteniendo un fenotipo y un perfil funcional consistentes entre diferentes sistemas de cultivo. Una visión esquemática del protocolo de expansión tanto para las celdas CIK como para las CAR-T se muestra en la Figura 1.

Figura 1
Figura 1: Visión general de los protocolos de expansión celular CAR-T y CIK utilizando dispositivos de cultivo G-24 o G-6M. Las células CAR-T y CIK se expanden a partir de PBMCs aislados a partir del Día 0. Para la expansión de las células CAR-T, los PBMC se estimulan en el día 1 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, modificados genéticamente en el día 2, y posteriormente se cultivan con suplementación con hIL-7 y hIL-15 cada 3-4 días, con la extracción final para ensayos funcionales en el día 9. En el formato G-6M, la suplementación con citocinas se limita al día 2, sin necesidad de alimentación adicional con citocinas durante todo el periodo de cultivo. Para la expansión de las células CIK, los PBMC se estimulan el día 1 con rhIFN-γ y en el día 2 con anticuerpos anti-CD3 y rhIL-2, que luego se administran cada 3-4 días. En G-24, se requiere un cambio de medio simultáneamente con el suplemento de citocinas. Las células CIK se extraen en el día 14 para ensayos funcionales posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Se obtuvieron abrigos buffy anonimizados de donantes sanos previamente analizados para detectar la ausencia de contaminación por patógenos (por ejemplo, VIH, HCV, HBV, SÍFILIS) antes de consentimiento informado por escrito. Las muestras de sangre se manipulaban en armarios certificados de bioseguridad y el personal llevaba el equipo de protección individual (EPP) adecuado.

NOTA: Todos los procedimientos que involucraron vectores lentivirales se realizaron bajo condiciones de Nivel de BioSeguridad 2 (BSL-2), según las directrices institucionales. El manejo del vector lentiviral requiere precauciones adicionales, incluyendo doble guante. Los residuos biopeligrosos (incluidos materiales virales, células transducidas y muestras de origen humano) se autoclavaban antes de su eliminación, mientras que los residuos químicos (incluidos colorantes fluorescentes y reactivos) requerían segregación según los protocolos institucionales de residuos peligrosos. Ten en cuenta que los requisitos específicos de bioseguridad pueden variar entre instituciones y deben verificarse antes de la implementación del protocolo.

1. Aislamiento de PBMCs

  1. Aislar PBMCs de pelaje buffy sano de donante o muestras de sangre periférica mediante centrifugación por gradiente de densidad. Diluye la capa buffy con un volumen igual de solución fisiológica estéril 1x Phosphate Buffer (PBS) y coloca cuidadosamente la sangre diluida sobre el mismo volumen de Lymphoprep en un tubo cónico de 50 mL. No es necesario diluir con 1x PBS para la sangre periférica. Centrifuga a 400 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin freno.
  2. Tras la centrifugación, recoge la capa de PBMCs en la interfaz plasma-Lymphoprep y lávala con PBS estéril 1x. Centrifugar y resuspender los PBMC en un medio de cultivo celular hematopoyético (CM) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina (en adelante cCM). Evalúa el recuento celular y la viabilidad utilizando el ensayo de exclusión Trypan Blue.

2. Expansión de células CAR-T a partir de PBMCs en vasos de cultivo de G-24

  1. Activación de PBMCs (Día 0)
    1. Resuspender 2 x 106 PBMCs recién aislados en 2 mL de cCM suplementados con suero bovino fetal (FBS) al 5% (en adelante cCM-F), resultando en una densidad final de siembra de 1 x 106 PBMCs/cm2/mL, y transfiere a un pozo de un vaso de cultivo G-Rex (G-24) de 24 pozos. Siembra tantos pozos como el número de condiciones de transducción diferentes que deben realizar en el Día 1 (Paso 2.2 - Día 1).
    2. Añadir 4 μl de anticuerpos anti-CD3 (grado funcional puro, concentración final: 0,2 μg/mL) y 20 μl anti-CD28 (grado funcional puro, concentración final: 1 μg/mL) directamente a cada pozo para activar las células T. Cultivar células en una incubadora humidificada mantenidas a 37 °C, 5% de CO2.
  2. Transducción de células T con vectores lentivirales (Día 1)
    1. Tras la estimulación nocturna, se recolectan y se cuentan los linfocitos T activados utilizando el ensayo de exclusión Trypan Blue para evaluar la viabilidad. Calcular 1 x 106 de celdas activadas viables para cada pozo de G-24 (área del pozo de 2cm 2), correspondiente a una densidad de siembra de 0,5 x 106 celdas/cm². Transfiere las células en un tubo y centrifuga a 300 x g durante 5 minutos.
    2. Preparar el medio de transducción para cada pozo combinando el volumen vectorial lentiviral adecuado, basado en la concentración (TU/mL) de la preparación del vector lentiviral (aquí, lentivirus CD19-CAR-BBζ obtenido del Hospital de Investigación InfantilSt. Jude 25; multiplicidad de infección (MOI) 20), con 5 μl del potenciador de transducción protamina sulfato (la solución de 8 mg/mL se obtiene disolviendo sulfato de protamina en 1x PBS y filtrada estéril usando un filtro de 0,2 μm; concentración final de 50 μg/mL). Utiliza medio de CM suplementado con un 5% de FBS sin añadir penicilina/estreptomicina para alcanzar un volumen final de 0,8 mL/pozo (0,4 mL/cm²). Para el control no transducido (UTD), prepara el medio de transducción descrito evitando la adición del vector lentiviral.
    3. Resuspende las células en pellet (paso 2.2.1) en 0,8 mL/pozo de medio de transducción y plaque-las en un nuevo pozo G-24. Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: Si se planea la transducción de varios pozos con el mismo vector lentiviral, prepare una mezcla maestra del medio de transducción que contenga el virus y el sulfato de protamina a la concentración deseada. Mezcla bien para asegurar la homogeneidad. Luego, se aplica 0,8 mL de esta mezcla maestra en cada tubo de células en pellets para garantizar condiciones de transducción consistentes en todas las muestras.
  3. Cultivo y expansión de células CAR-T (Día 2 a Día 9)
    1. En el segundo día, aumentar el volumen de cultivo a un volumen final de 8 mL/pozo añadiendo 7,2 mL de cCM-F fresco, suplementado con interleucina-7 humana (hIL-7) e interleucina-15 humana (hIL-15) a una concentración final de 10 ng/mL cada una (volumen de citocinas calculado considerando un volumen total de 8 mL por pozo).
    2. En el día 5, refresca el medio de cultivo retirando cuidadosamente 6 mL de medio acondicionado de cada pozo sin alterar las células del fondo y sustituyéndolo por 6 mL de cCM-F fresco complementado con hIL-7 y hIL-15 (concentración final: 10 ng/mL calculada considerando un volumen total de 8 mL por pozo). Si se trabaja con varios pozos, prepara una mezcla maestra de medios cCM-F complementados con citocinas hIL-7 y hIL-15 para asegurar una distribución uniforme de las citocinas.
    3. En el Día 9, las células CAR-T se expanden eficientemente y están listas para aplicaciones posteriores. Para extraer las células CAR-T, retira y desecha suavemente 5 mL de medio condicionado. Utilizando una pipeta de 1000 μL, resuspende las células CAR-T en los 3 mL restantes de medio y muévelas a un tubo de 15 mL. Cuenta las células CAR-T y comprueba su viabilidad usando el ensayo de exclusión Trypan Blue. Normalmente, se obtienen aproximadamente 3 x 10 célulasCAR-T 7 (3,24 ± 1,67 x 107 celdas) de cada pozo G-24 (Tabla Suplementaria 1).

3. Expansión de CIK en vasos de cultivo G-24

  1. Activación de PBMCs (Día 0)
    1. Semilla 1 x 106 PBMCs recién aislados para cada pozo de un recipiente de cultivo G-24, que corresponde a una densidad de 0,5 x 106/cm2, en 8 mL de cCM suplementado con interferón-γ humano recombinante (rhIFN-γ, concentración final: 1000 IU/mL). Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2.
  2. Estimulación y expansión de células CIK (Día 1 a Día 14)
    1. El día 1, 22-24 horas después de la estimulación con rhIFNγ, añadir directamente a cada pozo 4 μL de anticuerpo anti-CD3 (concentración final: 50 ng/mL) y 4 μL de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2, concentración final: 500 IU/mL). Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2.
    2. Cada 3 a 4 días (en los días 5, 9 y 12 de cultivo celular), se sustituyen 6 mL de medio acondicionado por cCM fresco y rhIL-2 (concentración final: 500 IU/mL), calculando la concentración final de rhIL-2 en relación con el volumen completo de 8 mL.
    3. En el día 14, se extraen células CIK descartando 5 mL de medio condicionado y resuspendiéndolas en los 3 mL restantes de medio condicionado. Transfiere las células a un tubo de 15 mL y evalúa el número total de células y la viabilidad celular utilizando el ensayo de exclusión Trypan Blue. Normalmente, de cada pozo se obtienen unas 8 célulasCIK de 7 unidades (8,6 ± 4,58 x10 celdas de 7) (Tabla suplementaria 2).
      NOTA: Durante los cambios de medio, aspira cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la población de la capa celular ni entrar en contacto con la membrana permeable al gas. El daño a la membrana puede afectar el intercambio de gases y afectar negativamente a la viabilidad celular.

4. Fabricación a gran escala de células CAR-T y CIK

NOTA: Los protocolos de expansión de celdas CAR-T y CIK descritos en las Secciones 2 y 3 pueden escalarse fácilmente a dispositivos de cultivo G-Rex de mayor tamaño, concretamente el formato G-6M. Al pasar del formato G-24 (área superficial: 2cm 2) al dispositivo G-6M (área superficial: 10cm 2), todas las concentraciones y densidades se mantienen constantes, mientras que todos los volúmenes y cantidades absolutas aumentan proporcionalmente un factor de 5 para coincidir con el aumento de la superficie superficial. Esto significa que la densidad de siembra celular, las concentraciones de suplementación del medio y las concentraciones de citocinas permanecen sin cambios, pero los volúmenes totales de medios, el número de células sembradas y las cantidades absolutas de citocinas añadidas se escalarán proporcionalmente. Esta característica de escalabilidad permite una transición fluida de protocolos de investigación a pequeña escala a la fabricación preclínica o clínica temprana sin requerir modificaciones significativas en el protocolo, manteniendo así características consistentes de las células efectoras.

  1. Expansión de células CAR-T en dispositivos de formato G-6M
    1. Realizar la activación de los PBMCs en el día 0 y la transducción lentiviral en el día 1, tal como se describe en la Sección 1, manteniendo todas las concentraciones y densidades mientras se incrementan volúmenes y cantidades absolutas en un factor de 5 veces.
    2. En el segundo día, eleva el volumen de cultivo a un total de 100 mL usando medio cCM-F. Calcular y añadir hIL-7 y hIL-15 para lograr la concentración final de 10 ng/mL en consecuencia.
      NOTA: A diferencia del formato G-24, el diseño más alto del dispositivo G-6M permite un mayor volumen medio, lo que permite un suministro constante de nutrientes y citocinas durante todo el periodo de cultivo sin necesidad de reemplazo del medio (enfoque de "rellenar y olvidar"). Por lo tanto, no se requieren citocinas adicionales en el Día 5.
    3. Para extraer células CAR-T en el Día 9, descarta unos 90 mL de medio de cada pozo usando una pipeta serológica y resuspende las células en los 10 mL restantes. Transfiere las células a un tubo de 15 mL y úsalas para ensayos posteriores.
  2. Expansión de celdas CIK en dispositivos de formato G-6M
    1. Realizar la siembra de los PBMCs en el Día 0 siguiendo el protocolo descrito en la Sección 3 y escalar todos los volúmenes y reactivos en un factor de 5 para que coincidan con el formato de dispositivo más grande (G-6M).
    2. El primer día, ajusta el volumen de cultivo a un total de 100 mL con medio cCM. Añadir una concentración final de 500 UI/mL de rhIL-2 y 50 ng/mL de anti-CD3 en cada pozo.
    3. Suplementa 500 UI/mL de rhIL-2 cada 3-4 días (días 5, 9 y 13) en cada pozo sin cambio de medio.
    4. Extrae las células CIK en el día 14 eliminando unos 90 mL de medio de cada pozo con una pipeta serológica. Resuspende las células de los 10 mL restantes, muévelas a un tubo de 15 mL y úsalas para ensayos posteriores.

5. Caracterización del fenotipo de células efectoras mediante citometría de flujo

NOTA: Al final del protocolo de expansión, se realiza un análisis de marcadores superficiales mediante citometría de flujo en células CAR-T y CIK para evaluar su fenotipo, incluyendo estados de diferenciación distintos, es decir, Naïve (CD45RA+CD62L+), Memoria Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memoria Efectora (EM, CD45RA-CD62L-) y Memoria Efectora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-; Figura suplementaria 1A-B).

  1. Recoge 3 x 10 celdasde 5 para cada tubo de tinción. Lava las células en 1x PBS con 1% de FBS (PBS-F), centrifuga a 300 x g durante 5 minutos y vuelve a suspender el pellet celular en 50 μL de solución de mezcla de anticuerpos preparada en tampón de tinción (1 parte de tampón de tinción brillante y 1 parte de PBS-F) según el panel de tinción deseado (Tabla 1 y Tabla 2).
  2. Incuba las células durante 20 minutos a 4 °C protegidas de la luz, luego lava las células teñidas y centrifuga. Si se requiere un segundo paso de tinción, realiza la tinción con la mezcla específica de anticuerpos, como se ha descrito antes (paso 5.1).
  3. Por último, lava las células y tiñe con un tinte de viabilidad, aquí Fixable Viability Stain 780 (FVS780), en 50 μL de 1x PBS, incubando durante 15 minutos a 4 °C protegido de la luz. No es necesario un paso de lavado tras la tinción de viabilidad. Tras la incubación, añadir 200 μL de 1x PBS a cada muestra y proceder con la adquisición citométrica en flujo. La estrategia detallada de gating se muestra en la Figura Suplementaria 1A-B.
BlancoClonFluorocromoConcentración/DiluciónPropósito
Primer paso de teñidorhCD19-His//2 μg/mLDetección de moléculas CAR
Incubación a 4 °C durante 20 minutos
Paso de lavado
Segundo paso de tinciónSuyosGG11-8F3.5.1PEI1/50Detección de moléculas CAR
CD3UCHT1BV5101/40Linaje
CD4SK3BV6501/40Linaje
CD8RPA-T8BV4211/20Linaje
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maduración
CD62LDREG-56FITC1/10Localización, activación
Incubación a 4 °C durante 20 minutos
Paso de lavado
Tercer paso de tinciónFVS780//1/5000Discriminación de células vivas/muertas
Incubación a 4 °C durante 15 minutos

Tabla 1: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de células CAR-T. Panel de tinción utilizado para evaluar la expresión de CAR, el fenotipo de células T y el estado de diferenciación. Se informan clones de anticuerpos, concentración y fluorocromo conjugado para cada objetivo de interés.

BlancoClonFluorocromoDiluciónPropósito
Primer paso de teñidoCD56HCD56PEI1/40Linaje
NKG2D1D11APC1/83Activación
CD3UCHT1BV5101/40Linaje
CD4SK3BV6501/40Linaje
CD8RPA-T8BV4211/20Linaje
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maduración
CD62LDREG-56FITC1/10Localización, activación
Incubación a 4 °C durante 20 minutos
Paso de lavado
Segundo paso de tinciónFVS780//1/5000Discriminación de células vivas/muertas
Incubación a 4 °C durante 15 minutos

Tabla 2: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de células CIK. Panel de tinción utilizado para evaluar subpoblaciones CIK, fenotipo y estado de diferenciación. Se informan clones de anticuerpos, concentración y fluorocromo conjugado para cada objetivo de interés.

6. Evaluación de la actividad citotóxica específica de las células CAR-T y CIK

NOTA: La actividad citotóxica de las células CAR-T y CIK se mide co-cultivándolas con células objetivo en la proporción efector-objetivo (E:T) deseada. El tipo de ensayo depende del tipo de células objetivo, ya sea que se deriven de tumores sólidos o de malignidades hematológicas. En este protocolo, describimos un ensayo de citometría de flujo basado en colorantes fluorescentes para células en suspensión y un ensayo de Análisis Celular en Tiempo Real (RTCA) basado en impedancia para células adherentes.

  1. Ensayo de citometría de flujo basado en colorantes fluorescentes
    NOTA: La citotoxicidad específica de antígenos frente a malignidades hematológicas puede evaluarse mediante un ensayo de citometría de flujo basado en colorantes de células fluorescentes. Antes del cocultivo, las células objetivo se marcan con un colorante fluorescente para facilitar su identificación. Tras el cocultivo con células efectoras, la muerte celular objetivo se evalúa mediante tinción con un colorante de viabilidad. El análisis citométrico de flujo permite cuantificar la eliminación específica de antígenos, basada en la proporción de células fluorescentes positivas para colorantes no viables.
    1. Para cada condición de cocultivo, se recogen 2 x 10 célulasde 5 diana y se resuspenden en 400 μL de medio de cultivo completo para lograr una concentración final de 5 x 105 células/mL. Añadir tinte fluorescente a una concentración final de 5 μM (aquí Cell Trace Violet dye, CTV). Incubar durante 30 minutos a 37 °C, protegido de la luz. Tras la incubación, lava las células una vez con medio completo y vuelve a suspender el pellet a una concentración final de 4 x 105 células/mL.
    2. Dispensar 500 μL de la suspensión de celda objetivo teñida (aquí 2 x 105 de celdas Raji como modelo de celda objetivo de suspensión CD19+ ) en tubos limpios de 5 mL según la configuración experimental. Confirma la tinción exitosa mediante citometría de flujo identificando las células objetivo como células positivas al colorante fluorescente (SSC-A frente a CTV). Se recomienda alrededor del 98% de las células fluorescentes positivas para colorantes.
    3. En paralelo, contar y preparar las células efectoras (aquí 5 x 106 de células CAR-T CD19) para cada condición de cocultivo. Lava las células y vuelve a suspenderlas en un medio de cultivo completo a la concentración adecuada para igualar la relación efector-objetivo (E:T) deseada. Añadir 500 μL de la suspensión de celda efectora a cada tubo correspondiente que contenga las celdas objetivo.
      1. Para lograr una relación E:T de 25:1, añadir 5 células CAR-T CD19 de 106 efectores a 2 celdas objetivo de 10de 5 Raji en cada tubo, y preparar tantos tubos como requiera el diseño experimental.
    4. Incubar los cocultivos durante 6 horas a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Incluye una condición de control que contenga únicamente células objetivo para medir la muerte celular espontánea. Este control es importante para distinguir la muerte de fondo de la citotoxicidad específica de la célula efectora.
    5. Lava las células cocultivadas y tiñelas con el tinte vitalidad FVS780 diluido en 1x PBS (dilución final 1:5000). Incubar durante 15 minutos a 4 °C, protegido de la luz. Lava las células y vuelve a suspender el último pellet celular en 600 μL de tampón PBS-F. Proceder con la adquisición de citometría de flujo para evaluar la citotoxicidad específica de la célula efectora.
      1. Realizar la estrategia de gating del citómetro de flujo de la siguiente manera: identificar las células objetivo como células positivas al colorante fluorescente (SSC-A frente a CTV) y, luego, dentro de esta población, calcular el porcentaje de células objetivo muertas (SSC-A frente a FVS780, Figura suplementaria 1C). Calcular la Lisis Específica restando la muerte celular objetivo espontánea (%FVS780+ dentro de CTV+ en la condición solo objetivo) de la citotoxicidad específica de la célula efectora (%FVS780+ dentro de CTV+ en la condición de cocultivo efector-objetivo).
  2. Análisis celular en tiempo real (RTCA) ensayo
    NOTA: El ensayo RTCA es un método para evaluar la actividad citotóxica de las células efectoras frente a las células objetivoadherentes 26. La muerte de la célula objetivo se detecta como una diferencia en la señal de impedancia debido al desprendimiento de las células del pozo de la placa E activadas en el dispositivo xCELLigence. Realizar el ensayo RTCA siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante para garantizar un rendimiento óptimo y una reproducibilidad.
    1. Subcultivar las células objetivo un día antes del ensayo (Día -1) para asegurarse de que alcanzan una confluencia del 60%-80% para el Día 0. Este paso es fundamental para mantener las células en proliferación activa al inicio del experimento. Se prefiere usar celdas objetivo entre los conductos 5-20, con un mínimo de 1 semana (3-4 pasajes) tras el deshielo para asegurar un rendimiento óptimo de las células.
    2. El día 0, añade cuidadosamente 50 μL de medio de cultivo a cada pozo de la E-Plate, acopla la placa dentro del dispositivo y adquiere la señal de fondo. Luego, transfiere la placa de nuevo a la capucha para el paso de siembra de celdas.
    3. Cuenta las celdas objetivo y transfiere el número total necesario a un tubo limpio. Resuspende las células en un volumen adecuado de medio de cultivo para alcanzar la concentración deseada para la siembra en la E-Plate, y transfiere 100 μL de células objetivo a cada pozo (aquí 4 x 104 de células MCF-7 como modelo de línea celular tumoral adherente). Mantén la placa dentro de la campana a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para asegurar una fijación uniforme de las celdas objetivo. Acopla la placa dentro del dispositivo a 37 °C en una incubadora deCO2 y comienza la adquisición en tiempo real (intervalo de adquisición de 15 minutos durante 22 horas).
      NOTA: Realice la titulación de la célula objetivo antes de usar una nueva línea celular objetivo, tal y como sugiere el fabricante.
    4. El Día 1 (unas 20-22 horas tras la siembra de la célula objetivo), cuenta las células efectoras y resuéltalas en un medio de cultivo fresco, ajustando la concentración celular para lograr la relación efector-objetivo (E:T) deseada. Por ejemplo, para lograr una relación E:T de 10:1, añadir 4 celdas CIK de5 efectores de 10 a 4 celdasobjetivo de 4 de 4 MCF-7 para cada pozo.
    5. Prepara cada condición de tratamiento en duplicados técnicos usando una placa estéril de fondo en U de 96 pozos y equilibra durante 15 minutos a 37°C. Dispensar 50 μL de la suspensión de la celda efectora para cada condición usando una pipeta multicanal. Coloque la placa E de nuevo en el instrumento y continúe con la adquisición en tiempo real (intervalo de adquisición de 15 minutos durante 24 horas). Calcula la Lisis Específica usando la siguiente ecuación:
      Ecuación 1

Resultados

El protocolo descrito aquí proporciona un flujo de trabajo eficiente y robusto para la expansión e ingeniería ex vivo de células efectoras a partir de PBMCs aisladas, concretamente las células CAR-T y CIK. Este método requiere una manipulación celular mínima y aprovecha la capacidad de intercambio de gases de los dispositivos G-Rex, proporcionando una disponibilidad de nutrientes y oxigenación superiores en comparación con los sistemas convencionales de cultivoestático 23,24. Una ventaja clave de este protocolo es su escalabilidad inherente desde dispositivos de 24 pozos a pequeña escala (G-24), adecuados para estudios preclínicos, hasta dispositivos 6M más grandes (G-6M), compatibles con necesidades de fabricación traslacional o clínica, sin necesidad de cambios en el protocolo más allá de la escala proporcional.

Utilizando este protocolo, tanto las células CAR-T como CIK se expandieron con éxito en paralelo a partir de PBMCs de donantes sanos en los formatos G-24 y G-6M, tal como se describe en las Secciones 2-4. Al final del periodo de cultivo, ambos tipos celulares mostraron una alta expansión de plegamiento y viabilidad, con proliferación comparable entre los dos formatos de dispositivos (Figura 2, Tabla Suplementaria 1, Tabla Suplementaria 2), lo que pone de manifiesto la reproducibilidad del protocolo a diferentes escalas de cultivo.

Para validar la escalabilidad de los dispositivos de cultivo, se caracterizaron aún más las células efectoras fenotípicamente y funcionalmente. Para las células CAR-T CD19, cuantificamos la expresión de CAR y evaluamos los subconjuntos CD4+ y CD8+, observando una predominancia de células T CD19 CAR+ CD8+ (Figura 3A-B, Tabla suplementaria 1). Para las células CIK, evaluamos la frecuencia de las poblaciones de T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) y CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), así como la expresión del receptor activador NKG2D (Figura 3E, Tabla suplementaria 2). Además, observamos fenotipos y expresión globalmente comparables de marcadores poblacionales específicos entre los formatos de cultivo G-24 y G-6M tanto para células CAR-T como CIK. El estado de diferenciación tanto de los productos celulares CD19 CAR-T como CIK se analizó mediante tinción CD62L y CD45RA (Figura 3C-F, Tabla suplementaria 1, Tabla suplementaria 2), revelando fenotipos similares de memoria y efector entre células cultivadas en formatos G-24 y G-6M. Estos hallazgos demuestran que ampliar el proceso no compromete la integridad fenotípica ni el estado de diferenciación de las poblaciones ampliadas de células efectoras.

Por último, para evaluar la potencia funcional, empleamos ensayos de citotoxicidad específica por objetivo. Tanto las células CAR-T CD19 como las CIK expandidas en cualquiera de los dispositivos mostraron una potente actividad citolítica, confirmando el mantenimiento de las propiedades funcionales a escala (Figura 4). En general, estos resultados respaldan la idoneidad de los productos ampliados para aplicaciones posteriores en modelos preclínicos y, potencialmente, ensayos clínicos.

Figura 2
Figura 2: Proliferación y viabilidad de las células CAR-T y CIK CD19. Las células CAR-T (n = 5) y las células CIK (n = 6) expandidas a partir de PBMCs en placas G-24 y G-6M se recogieron en el día 9 y día 14 de expansión, respectivamente, para realizar el recuento celular y evaluar el aumento de pliegue (A-C) y el porcentaje (B-D) de células viables. Los histogramas representan la expresión media ± desviación estándar (DS), y los puntos indican donantes individuales (véase la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para valores individuales). Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos colas emparejada (A-C) o la prueba de rango de múltiples pares emparejados de Wilcoxon de dos colas (B-D), con corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: La evaluación del fenotipo de las células CAR-T y CIK CD19 se amplió en dispositivos G-24 y G-6M. La expresión de moléculas CAR en células CAR-T CD19 (n = 5) fue analizada mediante citometría de flujo para evaluar (A) la eficiencia de transducción en los protocolos de expansión G-24 y G-6M, así como la expresión de (B) CD4+/CD8+ y (C) subpoblaciones naïves/memoria en el subconjunto CD3+CAR+. El fenotipo de las células CIK a granel (n = 6) fue analizado mediante citometría de flujo para investigar (D) el porcentaje de CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) y T (CD3+CD56-), así como la expresión de (E) NKG2D y (F) subpoblación ingenua/de memoria en el subconjunto CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Ingenua (CD45RA+CD62L+), Memoria Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memoria Efectora (EM, CD45RA-CD62L-) y Memoria Efectora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-). Los histogramas representan la expresión media ± SD, y los puntos indican donantes individuales (véase la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para valores individuales). Los datos se analizaron mediante la prueba t pareada múltiple de dos colas (B-C-D-F) o la prueba de rango emparejada de Wilcoxon de dos colas (A-E), con corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Evaluación de la citotoxicidad de células CAR-T y CIK CD19. (A) La lisis específica de células CAR-T CD19 (naranjas, n = 5) o células no transducidas (UTD) (gris, n = 5) contra la línea celular Raji para linfoma de Burkitt (como modelo de línea celular en suspensión) se realizó mediante un ensayo de muerte basado en citometría de flujo de 6 horas. Los resultados se muestran como la línea media específica de la lisis ± SD. (B) La citotoxicidad de las células CIK cultivadas en G-24 (azul claro, n = 7) o G-6M (azul oscuro, n=6) contra la línea celular MCF-7 del cáncer de mama (como modelo de línea celular adherente) se monitorizó cada 15 minutos durante 24 horas mediante un analizador celular en tiempo real. Los resultados se muestran como la media específica de la lisis ± SEM. Los datos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney y corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Estrategia de gating utilizada para análisis de citometría de flujo. Gráficos representativos que ilustran las estrategias de gating para (A) la caracterización fenotípica de células CAR-T y (B) células CIK, y (C) el ensayo de citotoxicidad basado en colorantes fluorescentes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Crecimiento, viabilidad y fenotipo de cultivos de células CAR-T CD19 de donantes individuales. Se muestran el número total de células, el aumento de pliegues, la viabilidad y la caracterización fenotípica de las células T CD19-CAR extraídas en el día 9 de cultivo en dispositivos G-24 y G-6M para cada donante. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Crecimiento, viabilidad y fenotipo de cultivos celulares CIK de donantes individuales. Se muestran el número total de células, el aumento de pliegues, la viabilidad y la caracterización fenotípica de las células CIK recolectadas en el día 14 de cultivo en dispositivos G-24 y G-6M para cada donante. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo describe la implementación de una plataforma eficiente y escalable para la generación de dos productos ACT diferentes, a saber, las células CAR-T y CIK, a partir de PBMCs que utilizan sistemas de cultivo G-Rex. Implementamos ensayos funcionales y fenotípicos de prueba de concepto para validar la escalabilidad del enfoque. Demostramos que tanto el fenotipo como la actividad de las células expandidas se mantienen durante la ampliación, asegurando la idoneidad del sistema para aplicaciones de investigación y traducción clínica directa. De hecho, demostramos con éxito que tanto las células CAR-T como CIK pueden expandirse eficientemente con un alto rendimiento celular, manteniendo un fenotipo funcional del efector y una citotoxicidad potente específica de antígenos en diferentes dispositivos de cultivo.

Combinado con la tecnología de membrana permeable al gas de los dispositivos de cultivo, este protocolo de expansión conduce a una cinética de expansión más rápida, reduce el manejo manual y permite rendimientos altos y consistentes entre donantes. Estas características hacen que el protocolo sea altamente reproducible y menos laborioso en comparación con los sistemas de cultivoestándar 20,21, que a menudo implican múltiples intercambios de medios y un mayor riesgo de pérdida y contaminación celular.

Además, este protocolo permite una transición fluida a través de escalas de fabricación: desde sistemas abiertos a pequeña escala (G-24, adecuado para investigación preclínica y cribado, por ejemplo, de constructos CAR, combinaciones de citocinas o variabilidad del donante) a sistemas abiertos a mayor escala (G-6M, para validación previa a GMP), y finalmente a sistemas cerrados a mayor escala (para producción GMP). Como se describe en este estudio, la progresión de sistemas abiertos a pequeña escala a mayor escala requiere únicamente ajustes proporcionales de volúmenes y entrada de celdas en relación con el tamaño del dispositivo, lo que representa una ventaja práctica significativa. Del mismo modo, la única implementación necesaria para la transición de sistemas abiertos a cerrados para la fabricación de GMP, y por tanto para adaptar el protocolo G-6M a la producción a gran escala de GMP, es utilizar reactivos de grado GMP apropiados y dispositivos de sistema cerrado (G-10M-CS con una superficie de 10 cm2, correspondiente a un solo pozo G-6M, o G-100M-CS con una superficie de 100 cm², correspondiente al equivalente abierto G-100M) sin ninguna modificación adicional del propio protocolo. Estos dispositivos cerrados se diferencian de sus homólogos abiertos en la integración de conexiones estériles de tubos para el manejo automatizado de medios, que funcionan en conjunto con una bomba de manipulación de líquidos (GatheRex) para crear un entorno completamente cerrado. Este enfoque de sistema cerrado elimina los intercambios manuales de medios y reduce los riesgos de contaminación, lo que lo hace ideal para entornos de fabricación conformes con GMP donde la esterilidad y la reproducibilidad son primordiales. Cabe destacar que la escalabilidad representa una característica fundamental para tender puentes entre el descubrimiento en etapas tempranas y la traducción clínica, especialmente en entornos académicos o biotecnológicos tempranos con recursos limitados.

La implementación adicional de este protocolo hacia el cumplimiento total de las GMP debería considerar la transición de medios que contengan FBS a formulaciones libres de suero o xeno, alineándose con las tendencias regulatorias actuales de la FDA y la EMA, con el fin de eliminar la variabilidad de lote a lote, eliminar posibles riesgos de contaminación xenogénica y mejorar el cumplimientonormativo 27.

Además, la mínima intervención requerida por el sistema de expansión propuesto proporciona una plataforma ideal para implementar el perfilado fenotípicomultidimensional 28, reduciendo artefactos inducidos por el procedimiento que podrían confundir el análisis fenotípico durante los procedimientos de fabricación. Además, más allá de las células CAR-T y CIK, el sistema podría ser altamente adaptable a otras poblaciones de linfocitos y células inmunitarias modificadas, ampliando su utilidad en el desarrollo de inmunoterapia29,30.

Aunque el protocolo es robusto y no requiere modificaciones, algunos pasos son especialmente críticos para el éxito. Para la expansión de las células CIK, el momento de la adición de citocinas es esencial para asegurar una diferenciación y expansión óptimas. Para las células CAR-T, la transducción debe producirse 24 horas después de la activación para maximizar la eficiencia, y las alicotas lentivirales solo deben descongelarse una vez, ya que los ciclos repetidos de congelación-descongelación reducen significativamente la eficiencia de latransducción 31.

La variabilidad biológica entre las preparaciones celulares primarias contribuye naturalmente a las diferencias en las tasas de expansión y la actividad funcional, reflejando la diversidad de los donantes. Esta inevitable e intrínseca variabilidad puede gestionarse eficazmente realizando expansiones paralelas de múltiples donantes, asegurando resultados robustos y reproducibles entre experimentos.

En conclusión, este protocolo permite una expansión rápida, escalable y fiable de los linfocitos efectores funcionales directamente a partir de los PBMC, ofreciendo flexibilidad tanto para la investigación en fases tempranas como para la traducción clínica a gran escala. Este sistema puede adaptarse fácilmente a diversos tipos celulares y modificaciones genéticas, proporcionando una plataforma versátil para el desarrollo de inmunoterapia.

Agradecimientos

La construcción CAR fue proporcionada bajo MTA por el Hospital de Investigación Infantil St. Jude. Este trabajo contó con el apoyo de la ScaleReady G-Rex Grant 2025; Universidad de Padua - SOMMAGGIO_BIRD24_01; Fundación AIRC bajo el programa 5x1000 2019 - ID. 22759; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Esta investigación recibió financiación "Ricerca Corrente" del Ministerio de Salud italiano para cubrir los costes de publicación. Las figuras se crearon con el software GraphPad Prism 9 y BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Brillante Amortiguador de ManchasBD Biociencias566349
Anticuerpo CD28, antihumanoMiltenyi Biotech130-093-375Clon 15E8
Anticuerpo CD3, antihumanoMiltenyi Biotech130-093-387Clon de OKT3
CD3 BV510BD Biociencias740147Clon UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Bioleyenda320808Clon 1D11
CD4 BV650BD Biociencias563875Clon SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD Biociencias563429Clon HI100
CD56 PEBioleyenda318306Clon HCD56
CD62L FITCBD Biociencias555543Clon FREG-56
CD8 BV450BD Biociencias562428Clon RPA-T8
Kit de proliferación de células violetas CellTraceThermoFisher científicoC34557
Dimetilsulfóxido (DMSO)ThermoFisher científicoD2650
Dulbecco y prime; s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS)Sigma AldrichD5652
Placa E 16Agilent5469813001
Suero Fetal Bovino (FBS), ValorThermoFisher ScientificA5256701
Tinte de Viabilidad Reparable 780 (FVS780)BD Biociencias565388
Placa G-Rex de 24 pozos  Wilson Wolf80192M
Placa de pozo G-Rex 6M  Wilson Wolf80660M
Solución de tampón HEPESLonzaECM0180D
Su anticuerpoMiltenyi Biotech130-120-718
Albúmina humana 20%CSL Behring
Proteína recombinante IL-15 humanaPeproTech200-15
Proteína recombinante IL-7 humanaPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD Biociencias
LymphoprepTecnologías STEMCELL18060
MCF-7ATCCHTB-22Línea celular de cáncer de mama y nbsp;
Penicilina y estreptomicinaLonzaECB3001D
Solución fisiológica (0,9% cloruro de sodio)Monico
Protamina sulfatoSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Línea celular de linfoma de Burkitt y nbsp;
IFN-gamma humano recombinanteR& Sistemas D285-IF-100/CF
IL-2 recombinante (Proleucina)Novartis
rhCD19-HisInvitrogenA42607
Instituto Conmemorativo Roswell Park 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
L-Glutamina estableLonzaECB3004D
Solución Trippan-BlueSigma AldrichT8154
Análisis de celdas en tiempo real xCELLigenceAgilent
Medio Celular Hematopoyético sin suero X-VIVO 15Lonza02-053Q

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