Este protocolo describe la expresión y cuantificación de las subunidades neuronales de los receptores nicotínicos de acetilcolina utilizando la línea celular Neuro-2a de mamíferos. Las etiquetas fluorescentes sensibles al pH y la microscopía confocal permiten una evaluación precisa de la localización de receptores en la membrana plasmática frente a las expresadas en compartimentos intracelulares neutros en pH, facilitando el estudio del tráfico y la modulación farmacológica de nAChR.
Artículo de método
Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos
En este artículo
Resumen
Resumen
La cuantificación de los receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChR) expresados en la membrana plasmática de las células mamíferas es importante para el desarrollo de nuevas terapias selectivas por objetivo y para el estudio de proteínas chaperonas que modulan el tráfico de receptores. Este estudio presenta un conjunto sólido de metodologías para expresar tanto nAChR homoméricas como heteroméricas en células Neuro2a (N2a) de mamíferos y cuantificar su localización superficial frente a intracelular utilizando etiquetas fluorescentes sensibles al pH. pHuji y pHluorina supereclíptica (SEP) son proteínas sensibles al pH que pueden ser diseñadas para marcar proteínas recombinantes, permitiendo la visualización de la distribución espacial de las subunidades de nAChR. Estas etiquetas fluorescentes emiten a pH neutro pero se apagan en ambientes ácidos. Para rastrear la localización relativa de la membrana interna frente a la plasmática de las subunidades nAChR α7, α4 y β2, se adjunta pHuji o SEP al C-terminal de cada constructo de ADN. Para expresar α7-pHuji junto con su chaperona NACHO, o (α4-SEP; β2-pHuji) en células N2a, se utiliza un reactivo de transfección de ADN basado en lípidos. El reactivo de transfección y el ADN plasmido se incuban por separado en un medio sérico reducido a temperatura ambiente, y luego se combinan para formar complejos lipídio-ADN que facilitan la entrega de plásmidos a las células. Tras la incubación, las células se fotografían mediante microscopía confocal de células vivas en condiciones de pH alto y bajo o en presencia de un ligando fluorescente selectivo por subtipos. Las imágenes se analizan utilizando fluorescencia celular total corregida en los canales de fluoróforo relevantes, proporcionando información cuantitativa sobre la distribución de subunidades nAChR marcadas con fluorescencia entre la membrana plasmática y los compartimentos intracelulares. La imagen confocal de células vivas permite el seguimiento en tiempo real de la localización de la subunidad nAChR para distinguir diferencias entre poblaciones internas y de receptores superficiales. La expresión robusta de membrana plasmática de α7-pHuji o (α4-SEP; β2-pHuji) se logra en 24 horas a 37 °C. Este método puede adaptarse para incluir chaperonas adicionales, subunidades auxiliares o ligandos fluorescentes para el estudio del tráfico de nAChR, la modulación farmacológica y las alteraciones relacionadas con enfermedades en la expresión de nAChR.
Introducción
Los receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChR) son canales iónicos transmembrana controlados por ligando, expresados en la membrana plasmática de muchos tipos celulares, incluyendo neuronas, células gliales y células inmunitarias. Estos receptores están compuestos por α subunidades (α2-α10) o β (β2-β4) que se ensamblan para formar subtipos homómeros o heteroméricos, siendo α7 y α4β2 los nAChRs los más abundantes en elcerebro 1,2. La desregulación de estos subtipos se ha asociado con la enfermedad de Alzheimer, trastorno por consumo de nicotina, epilepsia hipermotor....
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Protocolo
NOTA: El siguiente procedimiento describe métodos que se han utilizado con éxito para transfectar transitoriamente la línea celular N2a con subunidades nAChR (Figura 1). Se logra una expresión robusta de membrana plasmática en 24 horas, como se captura con microscopía confocal de células vivas.
Figura 1: Presentación esquemática de los métodos individuales presentados en el protoc....
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Resultados
Siguiendo los procedimientos de transfección anteriores, las nAChRs α7 y la proteína chaperona NACHO se expresaron conjuntamente en células N2a. Tanto las células no transfectadas como las transfectadas fueron marcadas con αBTX-AF647 24 horas después de la transfección de ADN. Como αBTX no es permeable a la membrana, toda la fluorescencia detectada se origina en receptores presentes en la membrana plasmática. En la Figura 2A, A′, se observó .......
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Discusión
Las metodologías presentadas para expresar y cuantificar subunidades de nAChR en células de N2a en mamíferos abordan desafíos de larga duración para lograr una expresión rápida (~24 horas) y abundante de nAChR (> 60%) en la membrana plasmática para estudios de descubrimiento, localización y tráfico de fármacos. Una fortaleza clave de este conjunto de protocolos es su adaptabilidad tanto para nAChRs homoméricos (α7) como heteroméricos (α4β2), y probablemente sea aplicable a otros subtipos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a James Janoso por su experiencia en microscopía técnica y al Centro para la Investigación Transformadora en Metabolismo (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número P20GM130443) por apoyar el Núcleo de Microscopía en la Universidad de Alaska Fairbanks. Los esfuerzos de LW contaron parcialmente con financiación del Fondo de Inversión en Educación Superior, proporcionado por el estado de Alaska a través de la Universidad de Alaska. Los esfuerzos de SMS contaron con el apoyo del Premio al Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional d....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | Reactivo de desprendimiento celular |
| Alfa-Bungarotoxina Alexa Fluor 647 | Invitrogen | B35450 | Conjugado de alfa-bungarotoxina |
| Gabinete de Bioseguridad de nivel 1 BSL & nbsp; | Nuaire | NU-425-400 | Área de trabajo de cultivo celular estéril |
| Cloruro de calcio | Aventor/VWR | BDH9224 | Componente búfer |
| D-(+)-glucosa | MilliPore Sigma | G8270 | Componente búfer |
| EMEM con L-glutamina | ATCC | 30-2003 | Medio celular |
| ADN libre de endotoxinas | Fabricado en casa usando kits Zymo | No aplicable | ADN nAChR para uso en transfecciones transitorias celulares |
| Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 0,5 mL | Aventor/VWR | 89000-010 | ADN y preparación por transfección |
| Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 1,5 mL | Aventor/VWR | 20170-038 | ADN y preparación por transfección |
| Suero fetal bovino | Aventor/VWR | 97068-085 | Suplemento sérico |
| Fluoview FV10i | Olimpo | FV10i | Microscopio Confocal |
| Platos de cristal con fondo MatTek | MatTek | P35GC-0-10-C | Antenas de imagen |
| GraphPad Prism v. 10 | GraphPad Prism | https://www.graphpad.com/features | Software de análisis de datos |
| HEPES | MilliPore Sigma | H3375 | Componente búfer |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668019 | Reactivo de transfección |
| Cloruro de magnesio hexahidrato | Termociencia | 413410025 | Componente búfer |
| MES hidrato | MilliPore Sigma | M5287 | Componente búfer |
| mTagBFP2-pBAD | AddGene | 54572 | ADN de control para transfección transitoria celular |
| Células Neuro 2 A (N2a) | Colección de Cultura de Tipo Americano | CCL-131 | Células utilizadas para transfecciones de ADN y expresión de nAChR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | Medio sérico reducido |
| Penicilina/Estreptomicina | Aventor/VWR | K952-100mL | Antibiótico |
| Bomba de peristalsis | Gilson | MiniPuls3 | El buffer cambia al hacer imagens |
| Solución salina tamponada con fosfato | Calidad Biológico | 119-069-131 | Amortiguador salino |
| Pipete Aid | Drummond y Drummond; | 140084 | Transferencia precisa de líquidos |
| Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 1000 μL) | Rainin | 30389216 | Transferencia precisa de líquidos |
| Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 20 μL) | Rainin | 30389229 | Transferencia precisa de líquidos |
| Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 250 μL) | Rainin | 30389246 | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipettes, P10 | Rainin | L-10XLS | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipettes, P100 | Rainin | L-100XLS | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipettes, P1000 | Rainin | L-1000XLS | Transferencia precisa de líquidos |
| Cloruro de potasio | MilliPore Sigma | P3911 | Componente búfer |
| Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 10 ML) | Aventor/VWR | 89130-898 | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 25 mL) | Aventor/VWR | 89130-900 | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 5 mL) | Aventor/VWR | 76201-710 | Transferencia precisa de líquidos |
| Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 50 mL) | Aventor/VWR | 75816-088 | Transferencia precisa de líquidos |
| Cloruro de sodio | Aventor/VWR | BDH9286 | Componente búfer |
| Matraz de cultivo de tejidos | Halcón | 353109 | Cultivo de platos |
| Kit de plásmidos ZymoPure II Maxiprep | ZYMO INVESTIGACIÓN | D4203-A + D4203-B | Producción de ADN libre de endotoxinas |
| &alfa; 4-SEP | Servicios de síntesis genética de ThermoFisher Scientific GeneArt | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html | Servicios personalizados de síntesis génica |
| &alfa; 7-pHuji | Twist Bioscience | https://www.twistbioscience.com/ | Servicios personalizados de síntesis génica |
| β 2-pHuji | Servicios de síntesis genética de ThermoFisher Scientific GeneArt | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html | Servicios personalizados de síntesis génica |
Referencias
- Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
- Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann Ne....
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