Artículo de método

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

DOI:

10.3791/69371

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19 de diciembre de 2025

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la expresión y cuantificación de las subunidades neuronales de los receptores nicotínicos de acetilcolina utilizando la línea celular Neuro-2a de mamíferos. Las etiquetas fluorescentes sensibles al pH y la microscopía confocal permiten una evaluación precisa de la localización de receptores en la membrana plasmática frente a las expresadas en compartimentos intracelulares neutros en pH, facilitando el estudio del tráfico y la modulación farmacológica de nAChR.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cuantificación de los receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChR) expresados en la membrana plasmática de las células mamíferas es importante para el desarrollo de nuevas terapias selectivas por objetivo y para el estudio de proteínas chaperonas que modulan el tráfico de receptores. Este estudio presenta un conjunto sólido de metodologías para expresar tanto nAChR homoméricas como heteroméricas en células Neuro2a (N2a) de mamíferos y cuantificar su localización superficial frente a intracelular utilizando etiquetas fluorescentes sensibles al pH. pHuji y pHluorina supereclíptica (SEP) son proteínas sensibles al pH que pueden ser diseñadas para marcar proteínas recombinantes, permitiendo la visualización de la distribución espacial de las subunidades de nAChR. Estas etiquetas fluorescentes emiten a pH neutro pero se apagan en ambientes ácidos. Para rastrear la localización relativa de la membrana interna frente a la plasmática de las subunidades nAChR α7, α4 y β2, se adjunta pHuji o SEP al C-terminal de cada constructo de ADN. Para expresar α7-pHuji junto con su chaperona NACHO, o (α4-SEP; β2-pHuji) en células N2a, se utiliza un reactivo de transfección de ADN basado en lípidos. El reactivo de transfección y el ADN plasmido se incuban por separado en un medio sérico reducido a temperatura ambiente, y luego se combinan para formar complejos lipídio-ADN que facilitan la entrega de plásmidos a las células. Tras la incubación, las células se fotografían mediante microscopía confocal de células vivas en condiciones de pH alto y bajo o en presencia de un ligando fluorescente selectivo por subtipos. Las imágenes se analizan utilizando fluorescencia celular total corregida en los canales de fluoróforo relevantes, proporcionando información cuantitativa sobre la distribución de subunidades nAChR marcadas con fluorescencia entre la membrana plasmática y los compartimentos intracelulares. La imagen confocal de células vivas permite el seguimiento en tiempo real de la localización de la subunidad nAChR para distinguir diferencias entre poblaciones internas y de receptores superficiales. La expresión robusta de membrana plasmática de α7-pHuji o (α4-SEP; β2-pHuji) se logra en 24 horas a 37 °C. Este método puede adaptarse para incluir chaperonas adicionales, subunidades auxiliares o ligandos fluorescentes para el estudio del tráfico de nAChR, la modulación farmacológica y las alteraciones relacionadas con enfermedades en la expresión de nAChR.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChR) son canales iónicos transmembrana controlados por ligando, expresados en la membrana plasmática de muchos tipos celulares, incluyendo neuronas, células gliales y células inmunitarias. Estos receptores están compuestos por α subunidades (α2-α10) o β (β2-β4) que se ensamblan para formar subtipos homómeros o heteroméricos, siendo α7 y α4β2 los nAChRs los más abundantes en elcerebro 1,2. La desregulación de estos subtipos se ha asociado con la enfermedad de Alzheimer, trastorno por consumo de nicotina, epilepsia hipermotora relacionada con el sueño, enfermedad de Parkinson y trastorno depresivo mayor, entre otras condiciones neurológicas y psiquiátricas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Métodos rápidos y fiables para expresar y cuantificar las nAChR son esenciales para comprender los mecanismos de la enfermedad y desarrollar terapias selectivas por objetivos. Sin embargo, lograr una expresión robusta de estos receptores en la membrana plasmática suele ser un reto y llevar mucho tiempo. El método descrito aquí permite una fuerte expresión superficial de las nAChR en aproximadamente 24 horas tras la transfección de ADN y puede combinarse con ligandos o proteínas chaperonas que modulan el tráfico de receptores.

Existen varios enfoques para expresar nAChRs, incluyendo la transfección transitoria de ADN o la generación de líneas celulares estables que expresen el subtipo deseado. Aunque crear líneas celulares estables es útil para estudios a largo plazo que involucren el mismo subtipo de receptor, el proceso es laborioso y puede requerir varios meses. Una vez establecidas, estas líneas celulares pueden mostrar expresión variable de receptores a través de los conductos, pérdida de expresión con el tiempo o sesgo de selección para clones con función o densidad receptorsubóptima 13. Una reducción de la temperatura de incubación de 37 °C a 30 °C, la adición de chaperonas moleculares como la nicotina, o un tiempo de incubación prolongado pueden favorecer la expresiónsuperficial 13,14,15. Estas limitaciones son especialmente evidentes en los nAChR heteroméricos, que requieren un correcto ensamblaje y tráfico de subunidades, y en estudios centrados en la regulación de receptores asistidos por chaperonas. Por lo tanto, es necesaria una validación rutinaria de la expresión de subtipos de receptores a través de los conductos cuando se trabaja con líneas celulares estables que expresan nAChR.

A menudo, los investigadores se interesan por variantes de subunidades de nAChR y subunidades de chaperona o proteínas auxiliares, por lo que necesitan expresar una variedad de ADN en rápida sucesión para permitir una flexibilidad rápida en sus ensayos. La expresión transitoria de nAChRs es ventajosa en este sentido porque el proceso puede completarse rápidamente, permitiendo al investigador estudiar múltiples subtipos de receptores o condiciones experimentales sin esperar meses para generar líneas celulares estables. Un fenómeno común, incluso con expresión transitoria, es que muchos nAChR permanecen dentro de la celda 24 horas después de la inducción a 37 °C, requiriendo periodos adicionales de incubación de > 48h, 16,17. Por ejemplo, sin la proteína chaperona resistente a los inhibidores de la colinesterasa (RIC)-3, solo el ~1% de las α7 nAChR se expresan en la membrana plasmática de las células SHE-P demamíferos 18. Con la coexpresión de RIC-3, se detectan aproximadamente el 20% de α7 nAChR en la superficie. Aunque esto representa una mejora, la abundancia total de receptores sigue siendo baja. La coexpresión de α7 nAChRs con NACHO puede potenciar aún más la expresión superficial, aunque menos del 40% de la población total de receptores se traslada a lamembrana plasmática 19. Otro enfoque consiste en incubar células transfectadas a 30 °C para mejorar la expresión plasmáticade la membrana 20,21. Para α4β2 nAChRs, esta reducción de temperatura produce una regulación al alza de cinco veces en la densidad de receptores superficiales sin un aumento correspondiente en la subunidad total de proteína21. Sin embargo, esta mejora requiere al menos un día adicional y un mayor uso de consumibles, reactivos e instrumentación.

El trabajo presentado ofrece un conjunto de métodos optimizados para expresar y cuantificar subtipos específicos de nAChR en 24 horas tras la transfección en células N2a de mamíferos, logrando aproximadamente un 83% para α7, 77% para α4 y 56% para subunidades β2 localizadas en la membrana plasmática. En el caso de α7 nAChRs, la expresión plasmática de membrana puede cuantificarse usando α-bungarotoxina marcada fluorescentemente con α7 selectiva (αBTX) o mediante etiquetado fluorescente recombinante. Para marcar cada subunidad, las proteínas fluorescentes sensibles al pH pHuji y pHluorina supereclíptica (SEP)22,23,24 se modifican en el C-terminal de las subunidades individuales de nAChR25,26. pHuji y SEP son variantes sensibles al pH de proteínas fluorescentes rojas y verdes, respectivamente, que fluorescen a pH 7,4 pero se apagan en condiciones másácidas 27,28. Como la fluorescencia SEP y pHuji se suprime en pH < 6, cualquier señal intracelular observada refleja fluoróforos situados en compartimentos neutros en lugar de en la membrana plasmática. Cabe señalar que algunos orgánulos, como el aparato de Golgi, tienen un lumen ácido; por tanto, los fluoróforos adheridos a la región C-terminal de las subunidades de nAChR no se detectan mientras las subunidades transitan por la víasecretora 29. La diferencia entre la fluorescencia total a pH 7,5 y la de pH < 6 representa la señal generada por los nAChR situados en la membrana plasmática. La captura de imágenes mediante microscopía confocal de célula viva proporciona una alta resolución espacial, permitiendo la cuantificación precisa de la localización de subunidades. Además, realizar todos los experimentos en células vivas permite que cada célula actúe como su propio control, teniendo en cuenta la variabilidad en la expresión proteica entre células dentro de cada grupode tratamiento 30. Este método puede adaptarse aún más para incluir proteínas chaperonas adicionales, como NACHO u otras, para investigar el tráfico de nAChR. Otras aplicaciones incluyen la modulación farmacológica, la incorporación de subunidades auxiliares y el análisis de cambios asociados a la enfermedad en la expresión de nAChR.

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Protocolo

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NOTA: El siguiente procedimiento describe métodos que se han utilizado con éxito para transfectar transitoriamente la línea celular N2a con subunidades nAChR (Figura 1). Se logra una expresión robusta de membrana plasmática en 24 horas, como se captura con microscopía confocal de células vivas.

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Figura 1: Presentación esquemática de los métodos individuales presentados en el protocolo. Las células se cultivan hasta estar en confluencia entre un 70% y un 80% en platos de imagen. Las células se tratan entonces con el reactivo de transfección y el complejo de ADN. (Arriba) 24 horas después, las células pueden tratarse con un ligando marcado con fluorescencia para marcar subunidades expresadas en la membrana plasmática y luego ser fotografiadas con un microscopio confocal. (Abajo) Alternativamente, para genes de subunidades nAChR que han sido modificados para ser marcados con una proteína sensible al pH 24 horas después de la transfección, se pueden fotografiar las células vivas usando un microscopio confocal para capturar la fluorescencia total de las células. El tampón de imagen de pH 7,4 se cambia entonces por el tampón de temple de pH 5,5. Esto detendrá la fluorescencia de las proteínas sensibles al pH marcadas a las subunidades nAChR situadas en la membrana plasmática de la célula, permitiendo que solo las subunidades internas permanezcan fluorescentes. Las mismas células vuelven a ser imágenes de la imagen. El análisis de imágenes se realiza utilizando ImageJ para cuantificar la expresión de subunidades internas y externas. Estos procedimientos pueden modificarse para incorporar chaperona y proteínas auxiliares. Creado en BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Transfección transitoria N2a nAChR

NOTA: La línea celular N2a fue elegida porque presenta un fenotipo neuronal y una baja expresión endógena de nAChRs. Los genes de la subunidad α7-pHuji, α4-SEP y β2-pHuji están alojados individualmente en el vector de expresión pcDNA3.1(+) de mamíferos. La proteína chaperona NACHO se extrae de pREP9 (generosamente donada por el Dr. R. Loring, de la Universidad Northeastern). En todos los pasos, utiliza técnicas estériles y trabaja dentro de un armario de bioseguridad. Lleva una bata limpia, gafas de seguridad y guantes. Limpia todos los materiales que entran o salen del armario de bioseguridad con etanol al 70%. Los siguientes pasos describen la transfección en un plato de fondo de vidrio recubierto de poli-D-lisina de 35 mm, adecuado para la imagen. Los volúmenes pueden ajustarse según sea necesario para diferentes embarcaciones de cultivo.

  1. Cultivar células N2a en un matraz de cultivo tisular T25 (o similar) que contenga el Medio Esencial Mínimo (EMEM) de Eagle, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y, si es necesario, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ hasta que las células alcancen un ~90% de confluencia. Visualiza usando un objetivo de microscopio óptico 4x.
  2. Monitoriza la confluencia diariamente con un microscopio óptico y cambia el medio de crecimiento cada 1-2 días para mantener condiciones óptimas. Cuando las células alcanzan una confluencia del ~90%, están listas para ser trasladadas a las placas de imagen.
  3. Precalienta todos los reactivos a 37 °C en un baño marea. Limpia el armario de bioseguridad y todos los materiales con etanol al 70% antes de comenzar el procedimiento.
    PRECAUCIÓN: El etanol al 70% es un líquido y vapor altamente inflamables que puede causar irritación ocular grave. Mantente alejado del calor, chispas, llamas abiertas y otras fuentes de ignición. Guárdalos en un lugar bien ventilado con recipientes bien cerrados. Lleva guantes protectores y protección para los ojos y la cara al manipularlos. En caso de contacto con la piel o los ojos, enjuágalo inmediatamente con agua y busca atención médica si persiste la irritación. En su lugar, puede utilizarse un desinfectante alternativo, como una solución de lejía al 5%-10%.
  4. Aspira el medio viejo del matraz y lava las células con 5 mL de PBS. Añade 1 mL de tripsina al frasco y haz girar suavemente. Incuba hasta que las células se levanten (<5 minutos). Para evitar la sobredigestión, añade inmediatamente 4 mL de medio de crecimiento EMEM y pipetea suavemente para crear una suspensión unicelular.
  5. Utilizando un hemocitómetro, determina la concentración celular y calcula el volumen requerido de medio de crecimiento EMEM para ajustar la suspensión de modo que 1 mL contenga 0,5-2 células 10⁵.
  6. Placar 1 mL de suspensión de celda por plato de 35 mm y añadir suficiente medio de crecimiento EMEM para llevar el volumen total a 2 mL. Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂. Las células están listas para la transfección con una confluencia del 70%-80%.
  7. El día de la transfección, precalienta los reactivos a 37 °C, descongela completamente los ADN de la subunidad nAChR y lleva el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Limpia todos los reactivos con etanol al 70% antes de colocarlos en el armario de bioseguridad.
  8. Para extraer α7 nAChRs: En un tubo de microcentrífuga, diluye 4 μg de ADN plasmídico de α7 (1 μg/μL) y 1 μg de ADN plasmídico de NACHO (1 μg/μL) gota a gota en un medio sérico reducido (sin antibióticos) hasta un volumen final de 250 μL. Mezcla suavemente pipeteando después de añadir ADN.
    1. Para extraer α4β2 nAChRs: Diluir 4 μg de cada ADN subunitario en un total de 250 μL de medio sérico reducido. Mezcla suavemente pipeteando. Ajustar la proporción de cada subunidad para optimizar la expresión de isoformas específicas de receptores.
    2. Para expresar α4β2 nAChRs con un plásmido adicional, añadir cantidades iguales de ADN de cada plásmido. La proteína fluorescente azul mTagBFP2³¹ en pcDNA3.1(+) actúa como plásmido de control y puede ser reemplazada por cualquier chaperona α4β2.
  9. Mezcla suavemente el reactivo de transfección de ADN antes de usarlo. En un tubo microcentrífuga separado, se diluyen 8 μL de reactivo de transfección gota a gota en 250 μL de medio sérico reducido. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pasa al siguiente paso en 25 minutos.
  10. Tras 5 minutos, combina el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido (total = 500 μL) gota a gota. Mezcla suavemente pipeteando y incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos ADN-lípidos permanecen estables hasta 6 horas.
  11. Mientras se forman los complejos, retira los platos de cultivo de la incubadora y sustituye el medio por 1 mL de EMEM sin suero (sin antibióticos).
  12. Añadir 500 μL del complejo de reactivo de transfección de ADN en gota a cada plato (volumen final = 1,5 mL). Mezcla suavemente balanceando el plato para asegurar una distribución uniforme por el plato, especialmente sobre la superficie de cristal. Incubar a 37 °C durante 24 horas y luego volver a colocar el medio tras 4-6 horas para promover la salud celular.

2. Marcado de células vivas de α7 nAChRs expresados por membrana plasmática usando αBTX Alexa Fluor 647

NOTA: El siguiente procedimiento generalmente se realiza 24 horas después de la transfección. Proteger αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) de la luz para evitar la fotodestrucción del fluoróforo.

  1. Precalentar todos los reactivos a 37 °C y descongelar la solución de stock αBTX-AF647 (2,3 μM). Limpia con etanol al 70% y colócala en el armario de bioseguridad.
  2. Recupera el plato que contiene las células transfectadas con ADN α7 y NACHO de la incubadora, limpia el exterior con etanol al 70% y colócalo en el armario de bioseguridad.
  3. Desecha el medio antiguo por aspiración al vacío. Para lavar las células, añade 2 mL de medio de crecimiento EMEM fresco.
  4. Retira el medio de lavado mediante aspiración al vacío. Añade 2 mL de medio de crecimiento EMEM a los platos.
  5. Sustituye la cantidad adecuada de medio por αBTX-AF647 para lograr una concentración final de 80 nM. Incubar durante la noche a 37 °C.
  6. Por la mañana, calienta previamente PBS o un medio de imagen preferido y limpia con etanol al 70%. Transfiere al gabinete de bioseguridad.
  7. Retira las células transfectadas de la incubadora, límpialas y colócalas en el armario de bioseguridad.
  8. Retira el medio viejo que contiene αBTX-AF647 y colócalo en un contenedor de residuos adecuado.
  9. Lava las células con 2 mL de PBS durante 3 veces, cada 10 minutos cada una, a temperatura ambiente. Los enjuagues eliminan ligandos y restos sueltos, y el tiempo puede modificarse para adaptarse a las necesidades del investigador. Retira el PBS después de cada lavado.
  10. Añade 2 mL de PBS o un medio de imagen preferido y procede a la imagen de las células usando un microscopio confocal.

3. Imagen de células vivas de nAChRs α7-pHuji totales e internos

NOTA: El siguiente procedimiento utiliza un plásmido α7-pHuji pcDNA3.1 fabricado internamente cotransfectado con la chaperona NACHO. Se utilizó un protocolo similar para expresar α4-SEP y β2-pHuji en pcDNA3.1 con el plásmido de control mTagBFP2 pcDNA3.1, como se describe en la sección de Resultados. Protege las muestras de la luz durante todo el procedimiento para evitar la fotodestrucción del fluoróforo.

  1. Preparar el tampón de imagen de pH 7,4 (Tabla 1) y el tampón de temple de pH 5,5 (Tabla 2) según lodescrito 23.
  2. Precalentar los reactivos a 37 °C, limpiarlo con etanol al 70% y transfiértelo al gabinete de bioseguridad. Retira las células transfectadas de la incubadora, limpia con etanol al 70% y colócalas en el armario de bioseguridad.
  3. Quita el medio antiguo por succión. Enjuaga el plato con 2 mL de PBS durante 3 veces, 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Añade 2 mL de buffer de imagen pH 7,4.
  4. Lleva el plato al microscopio confocal. Inserta la placa de imagen con buffer de pH 7,4 en el portaláminas y coloca el soporte en la cámara ambiental precalentada del microscopio confocal.
  5. Conecta el tubo de la bomba peristáltica al soporte de la placa de imagen y cierra la cámara.
  6. Abre el software de imagen y selecciona láseres para los fluoróforos de interés (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm y mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Escanea la antena para localizar células para obtener imágenes usando un objetivo de 10x-60x. Aumenta la ampliación si lo deseas y ajusta la profundidad de enfoque según sea necesario.
  8. Ajusta la intensidad del láser y la sensibilidad del detector para visualizar la fluorescencia sin una señal de fondo. Ajusta la apertura para aumentar la señal de fluorescencia, si es necesario.
  9. Selecciona la resolución preferida y captura la imagen única usando el objetivo deseado (por ejemplo, 60x).
  10. Registra la ubicación en el mapa de la antena para reubicar las mismas celdas tras el cambio del tampón a un tampón de temple de pH 5.5.
  11. Repite el proceso de imagen en varias áreas del plato, registrando cada nueva ubicación. Utiliza los mismos ajustes de captura para todas las imágenes (experimentales y grupos de control) para permitir comparaciones válidas.
  12. Manteniendo solo la línea de salida conectada a la bomba peristáltica, succiona lentamente el tampón de pH 7,4 de la antena hacia un contenedor de residuos.
  13. Cuando se retire la mayor parte del tampón (sin secar las células), transfiere la línea de entrada al tampón de temple de pH 5,5.
  14. Enciende la bomba peristáltica para añadir un tampón de pH 5,5 lentamente (1,5 mL/min) al plato, asegurando que las células permanezcan adheridas.
  15. Haz funcionar la bomba durante 20 minutos, observando que el amortiguador fluye correctamente hacia dentro y fuera de la antena.
  16. Apaga la bomba e incuba las células con el tampón de temple de pH 5,5 durante 20 minutos adicionales para permitir el equilibrio.
  17. Para repetir la imagen, carga las ubicaciones guardadas de la sesión anterior para que vuelvan a las mismas regiones.
  18. Confirma que la profundidad y posición focal son correctas, ya que pueden desplazarse tras el intercambio de buffers.
  19. Repite la imagen en todos los lugares guardados usando la condición de apagado con pH.
ReactivoConcentración (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
D-glucosa1
Ajusta la solución a pH 7,4

Tabla 1: Receta de tampón de imagen. Se añadieron los siguientes reactivos y la solución se ajustó a pH 7,4.

ReactivoConcentración (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
D-glucosa1
Ajusta la solución a pH 5,5

Tabla 2: Receta para apagar el buffer. Los siguientes reactivos se mezclaron y la solución resultante se ajustó a un pH de 5,5.

4. Cuantificación de imágenes

NOTA: Este procedimiento explica cómo analizar imágenes celulares utilizando ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) y el método32 de fluorescencia celular total corregida (CTCF).

  1. Abre ImageJ y abre la imagen que va a analizar. La imagen aparecerá como una pila con cada canal capturado separado dentro del mismo fotograma.
  2. Navega al canal de Fase. Si la imagen es demasiado brillante (algo común en zonas en blanco o de fondo), selecciona Procesar > Mejorar contraste y luego haz clic en OK.
  3. Usando la lupa, haz zoom (+) en una celda. Usando la herramienta de selección a mano alzada, traza el contorno de la celda en el canal de fase.
  4. Cambia al canal fluorescente correspondiente al fluoróforo de interés. Configura las mediciones deseadas seleccionando Analizar > Establecer Medidas. Asegúrate de que se comprueben el Área, el Valor Gris Medio y la Densidad Integrada .
  5. Para medir la región seleccionada, elige Analizar > Medir o pulsa Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Toma tres mediciones de fondo trazando áreas vacías cerca de la celda. Repite los pasos para el número deseado de celdas.
  7. Los datos de medición aparecerán en una ventana de Resultados separada en ImageJ. Copia y pega estos datos en Excel para su análisis.
  8. Calcula la media de fondo a partir de las tres mediciones de fondo.
  9. Calcula el valor CTCF de cada celda usando la siguiente fórmula:
    CTCF=Densidad integrada−(Área de la celda x Fluorescencia media de fondo)
  10. Repite este proceso para varias células e imágenes para cada grupo experimental (y condición de pH, si procede). Exporta todos los resultados a un software de análisis de datos para su procesamiento estadístico.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siguiendo los procedimientos de transfección anteriores, las nAChRs α7 y la proteína chaperona NACHO se expresaron conjuntamente en células N2a. Tanto las células no transfectadas como las transfectadas fueron marcadas con αBTX-AF647 24 horas después de la transfección de ADN. Como αBTX no es permeable a la membrana, toda la fluorescencia detectada se origina en receptores presentes en la membrana plasmática. En la Figura 2A, A′, se observó ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las metodologías presentadas para expresar y cuantificar subunidades de nAChR en células de N2a en mamíferos abordan desafíos de larga duración para lograr una expresión rápida (~24 horas) y abundante de nAChR (> 60%) en la membrana plasmática para estudios de descubrimiento, localización y tráfico de fármacos. Una fortaleza clave de este conjunto de protocolos es su adaptabilidad tanto para nAChRs homoméricos (α7) como heteroméricos (α4β2), y probablemente sea aplicable a otros subtipos...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a James Janoso por su experiencia en microscopía técnica y al Centro para la Investigación Transformadora en Metabolismo (Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número P20GM130443) por apoyar el Núcleo de Microscopía en la Universidad de Alaska Fairbanks. Los esfuerzos de LW contaron parcialmente con financiación del Fondo de Inversión en Educación Superior, proporcionado por el estado de Alaska a través de la Universidad de Alaska. Los esfuerzos de SMS contaron con el apoyo del Premio al Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo la subvención número P20GM103395. La investigación reportada en esta publicación contó con el apoyo del Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud (MMW por número de premio R03MH135358) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (MMW por el número de premio R16GM150455) de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% Tripsina-EDTA (1X) Gibco25200-056Reactivo de desprendimiento celular
Alfa-Bungarotoxina Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Conjugado de alfa-bungarotoxina
Gabinete de Bioseguridad de nivel 1 BSL & nbsp;NuaireNU-425-400Área de trabajo de cultivo celular estéril
Cloruro de calcioAventor/VWRBDH9224Componente búfer
D-(+)-glucosaMilliPore Sigma G8270Componente búfer
EMEM con L-glutaminaATCC30-2003Medio celular
ADN libre de endotoxinasFabricado en casa usando kits ZymoNo aplicableADN nAChR para uso en transfecciones transitorias celulares
Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 0,5 mL Aventor/VWR89000-010ADN y preparación por transfección
Tubos microcentrífugas libres de endotoxinas, 1,5 mL Aventor/VWR20170-038ADN y preparación por transfección
Suero fetal bovinoAventor/VWR97068-085Suplemento sérico
Fluoview FV10iOlimpoFV10iMicroscopio Confocal
Platos de cristal con fondo MatTekMatTekP35GC-0-10-CAntenas de imagen
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismhttps://www.graphpad.com/featuresSoftware de análisis de datos
HEPESMilliPore Sigma H3375Componente búfer
Lipofectamina 2000Invitrogen11668019Reactivo de transfección
Cloruro de magnesio hexahidratoTermociencia413410025Componente búfer
MES hidratoMilliPore Sigma M5287Componente búfer
mTagBFP2-pBADAddGene 54572ADN de control para transfección transitoria celular  
Células Neuro 2 A (N2a)Colección de Cultura de Tipo AmericanoCCL-131Células utilizadas para transfecciones de ADN y expresión de nAChR
Opti-MEMGibco31985-070Medio sérico reducido
Penicilina/EstreptomicinaAventor/VWRK952-100mLAntibiótico
Bomba de peristalsisGilsonMiniPuls3El buffer cambia al hacer imagens 
Solución salina tamponada con fosfatoCalidad Biológico119-069-131Amortiguador salino
Pipete AidDrummond y Drummond;140084Transferencia precisa de líquidos
Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 1000 μL)Rainin30389216Transferencia precisa de líquidos
Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 20 μL)Rainin30389229Transferencia precisa de líquidos
Puntas de pipete (estériles y libres de endotoxinas, 250 μL)Rainin30389246Transferencia precisa de líquidos
Pipettes, P10Rainin L-10XLSTransferencia precisa de líquidos
Pipettes, P100Rainin L-100XLSTransferencia precisa de líquidos
Pipettes, P1000Rainin L-1000XLSTransferencia precisa de líquidos
Cloruro de potasioMilliPore Sigma P3911Componente búfer
Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 10 ML)Aventor/VWR89130-898Transferencia precisa de líquidos
Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 25 mL)Aventor/VWR89130-900Transferencia precisa de líquidos
Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 5 mL)Aventor/VWR76201-710Transferencia precisa de líquidos
Pipetas serológicas (estériles y libres de endotoxinas, 50 mL)Aventor/VWR75816-088Transferencia precisa de líquidos
Cloruro de sodioAventor/VWRBDH9286Componente búfer
Matraz de cultivo de tejidosHalcón353109Cultivo de platos
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Referencias

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