Artículo de método

Imagen fluorescente cuantitativa de la infección por alphavirus para cribados antivirales

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DOI:

10.3791/69384

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14 de agosto de 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo robusto y adaptable para la visualización continua de infecciones por alfavirus. Este protocolo ofrece un enfoque para investigar la replicación de alfavirus y evaluar la eficacia de compuestos antivirales a nivel celular basado en imágenes de fluorescencia.

Resumen

La microscopía de fluorescencia ofrece un enfoque altamente sensible y versátil para investigar la infección por alfavirus a nivel celular. Al combinar virus marcados con fluorescencia con análisis cuantitativo de imágenes, este método permite una caracterización detallada espacial y temporal de la dinámica de la infección, incluida la detección de diferencias sutiles en la cinética de replicación y la diseminación de célula a célula. Un objetivo central de este protocolo es su aplicación en ensayos de cribado antiviral. La cuantificación basada en imágenes de la intensidad de fluorescencia proporciona un medio robusto y reproducible para evaluar la eficacia de compuestos antivirales, permitiendo la detección temprana y sensible de efectos inhibitorios en células infectadas. Esto facilita la identificación de candidatos antivirales prometedores y apoya la evaluación de respuestas dependientes de la dosis. El enfoque también es adecuado para estudios comparativos de diferentes cepas o mutantes de alfavirus, ya que las variaciones en el comportamiento de replicación y en los patrones de diseminación se vuelven fácilmente evidentes. Su flexibilidad, compatibilidad con múltiples líneas celulares y su integración sencilla en plataformas automatizadas de imágenes hacen que el método sea escalable y adecuado para campañas de cribado de alto rendimiento. En conjunto, este protocolo impulsa el descubrimiento y la evaluación de estrategias antivirales. Dado que varios alfavirus causan enfermedades importantes en humanos y animales, carecen de terapias antivirales aprobadas y continúan expandiéndose geográficamente con brotes emergentes, la identificación de nuevos antivirales sigue siendo una prioridad urgente. Por lo tanto, este flujo de trabajo basado en fluorescencia representa una contribución valiosa y oportuna a la investigación moderna de alfavirus.

Introducción

Los alfavirus son virus de ARN monocatenario de sentido positivo y envueltos, que pertenecen a la familia Togaviridae1,2,3. Principalmente se transmiten por mosquitos y son responsables de una variedad de enfermedades en humanos y animales. El género alfavirus incluye varios virus de importancia médica, como el virus del chikunguña (CHIKV), el virus Sindbis, el virus de la encefalitis equina del este y el virus de la encefalitis equina venezolana4,5. Estos patógenos causan síntomas que van desde enfermedad febril y erupciones cutáneas hasta complicaciones neurológicas graves6. Preocupantemente, el CHIKV ha resurgido como un problema importante de salud pública. Solo desde principios de 2025, se han notificado más de 220.000 casos en 14 países, lo que ha provocado al menos 80 muertes7. Aunque la tasa de mortalidad es baja, una proporción significativa de personas infectadas desarrolla dolor articular crónico, lo que puede provocar discapacidad a largo plazo y reducción de la movilidad8. Para desarrollar estrategias antivirales específicas, es esencial comprender mejor la replicación de los alfavirus y las interacciones entre el huésped y el patógeno. Mientras tanto, algunos alfavirus, como el virus de la selva de Semliki (SFV), presentan baja patogenicidad en humanos, a pesar de compartir una alta similitud genética y estructural con alfavirus más virulentos. Esto convierte al SFV en un modelo ideal para estudiar los alfavirus sin representar un alto riesgo para la salud humana9,10,11.

Los ensayos tradicionales, como los ensayos de placas, el ensayo de la dosis infectiva del 50 % en cultivo celular (TCID50) y el análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), son útiles para cuantificar títulos virales y la expresión génica, pero se limitan a mediciones puntuales y requieren la lisis o fijación celular. Como resultado, no pueden captar directamente la dinámica de la infección dentro de las mismas células a lo largo del tiempo12,13. Para abordar estas limitaciones, la imagenología fluorescente en tiempo real ofrece un enfoque potente y no destructivo para monitorear la cinética de infección en múltiples puntos temporales. El uso de virus marcados con fluorescencia, como el SFV etiquetado con mCherry, permite la visualización y cuantificación directas de la señal del virus reportero y su diseminación en células vivas14,15. Para los experimentos descritos aquí, se emplearon líneas celulares comúnmente utilizadas en la investigación de arbovirus. Las células U4.4, derivadas de larvas de Aedes albopictus, son células de mosquito que permiten una replicación eficiente de muchos arbovirus y facilitan estudios sobre las interacciones entre vector y virus16,17. Paralelamente, las células BHK-21, una línea celular mamífera de tipo fibroblástico originada a partir de tejido renal de hámster joven, proporcionan un sistema huésped vertebrado permisivo, frecuentemente utilizado para la propagación viral y ensayos de virología molecular18.

Este protocolo describe detalladamente el monitoreo de la expresión del gen reportero viral y la caracterización de compuestos antivirales, utilizando inhibidores de la furina como ejemplo. La furina es una convertasa de proproteínas presente en muchos eucariotas y desempeña un papel clave en la activación de precursores de factores de crecimiento, hormonas, metaloproteinasas de matriz, proteínas plasmáticas y receptores19,20. Muchos alfavirus aprovechan la furina para escindir y activar sus proteínas de superficie, un paso crucial para la replicación exitosa20. Los inhibidores de la furina son compuestos diseñados sintéticamente que bloquean la actividad de la furina, reduciendo así la replicación viral21,22,23. Dada la limitada disponibilidad de protocolos estandarizados para el análisis automatizado mediante microscopía de fluorescencia de infecciones por alfavirus utilizando un lector celular multipropósito con capacidad de imagen, se proporciona un flujo de trabajo detallado para la caracterización de compuestos antivirales en células aedinas. El protocolo describe los pasos para el cultivo celular, la producción de virus, la infección, el tratamiento con compuestos antivirales (inhibidor de la furina), la obtención de imágenes de fluorescencia y el análisis de imágenes. Sin embargo, los métodos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente a otros virus y etiquetas fluorescentes alternativas.

Protocolo

1. Seguridad biológica

NOTA: El virus Semliki Forest marcado con mCherry recombinante (SFV-mCherry) utilizado en este protocolo está genéticamente modificado24,25,26. La incorporación de un gen reportero fluorescente lo clasifica como un organismo genéticamente modificado, lo que implica requisitos adicionales de contención y regulaciones. El trabajo con otros alfavirus, particularmente virus más patógenos como CHIKV, puede requerir contención adicional y permisos.

  1. Limpie la cabina de seguridad biológica con un desinfectante adecuado y aplique luz ultravioleta durante al menos 30 min antes y después de realizar los ensayos virales.
  2. Deseche todo material contaminado de acuerdo con las regulaciones locales de bioseguridad. Recolecte los desechos sólidos y líquidos por separado en recipientes autoclavables y autóclavelos antes de su eliminación.

2. Preparación de compuestos antivirales

NOTA: Los inhibidores de furina MI-113027 (trans-4-(aminometil)ciclohexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobencilamida), MI-113127 (trans-4-(guanidinometil)ciclohexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobencilamida) y MI-114822,23 (4-(guanidinometil)bencilacil-arginina-terc.-leucina-arginina-4-amidinobencilamida) utilizados en este estudio son ejemplos de compuestos antivirales seleccionados para su evaluación. El inhibidor de furina MI-1148 se utilizó como control negativo en el ensayo de citotoxicidad y como control positivo en el ensayo antiviral.

  1. Disuelva los compuestos antivirales en un disolvente adecuado. Cuando sea posible, utilice agua estéril para evitar efectos citotóxicos. Se puede usar dimetilsulfóxido o metanol hasta un máximo del 2% (v/v). Se recomienda usar soluciones stock de 10 mM en agua estéril.
  2. Almacene las soluciones stock a -20 °C, según la estabilidad y solubilidad, a menos que el fabricante indique lo contrario.

3. Cultivo celular

  1. Cultive células U4.4 en medio Leibovitz L-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales MEM, 1% de caldo de triptosa fosfato, 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) (densidad de siembra: aprox. 1 × 106 células/frasco T25, volumen de cultivo: 5 mL). Mantenga las células a 28 °C. Pase las células U4.4 a una razón de 1:6 una vez por semana, pero ajuste las densidades de siembra según las necesidades experimentales.
    NOTA: Líneas celulares adicionales, como las células C6/36, también son compatibles con este protocolo. Pueden usarse medios y suplementos alternativos según corresponda. La inclusión de antibióticos es opcional y puede omitirse.
  2. Cultive células de riñón de hámster bebé (BHK-21) en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de FBS, 1% de glutamina o Equilibrio estático, ΣFx=0, gráfico, análisis de equilibrio de fuerzas, diagrama de estabilidad mecánica.‑alanyl‑Equilibrio estático, ΣFx=0, gráfico, análisis de equilibrio de fuerzas, diagrama de estabilidad mecánica.‑glutamina, y 1% de Pen/Strep (densidad de siembra: aprox. 1 × 106 células/frasco T75, volumen de cultivo: 10 mL). Mantenga las células a 37 °C en un incubador humedecido con 5% de CO2. Pase las células a una razón de 1:12 cada 4-5 días, con flexibilidad para modificar las densidades de siembra según sea necesario.
  3. Asegúrese de que las células permanezcan sanas y en proliferación activa.

4. Producción de virus

  1. Preparación de stocks de SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) en células BHK-21.
    1. Cultive células BHK-21 (densidad de siembra: aproximadamente 1 × 105 células/pocillo, volumen de cultivo: 500 µL) en una placa de cultivo celular transparente de 24 pocillos bajo las condiciones descritas anteriormente.
    2. Cuando alcancen aproximadamente el 90 % de confluencia (confluencia objetivo: aproximadamente 2 × 105 células), transfecte las células BHK-21 con el plásmido SFV6-2SG-mCherry utilizando un reactivo de transfección en medio de infección (DMEM suplementado con 1 % de Pen/Strep y 0,2 % de albúmina sérica bovina). Para ello, diluya 1 µL del reactivo de transfección en 25 µL de medio con bajo contenido de suero.
    3. En un tubo aparte, diluya 0,5 µg de ADN plasmídico y 1 µL de un aditivo comercial en 25 µL de medio con bajo contenido de suero. Añada la solución de ADN diluida a la solución que contiene el reactivo de transfección diluido e incube durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, añada 50 µL del complejo resultante a las células.
      NOTA: Pueden utilizarse otros reactivos de transfección, siempre que sean compatibles con la línea celular específica, y las instrucciones pueden variar según el reactivo empleado.
    4. A las 48 h posteriores a la transfección, recoja el sobrenadante que contiene el virus mediante pipeta, alícuotas de 250 µL por tubo libre de ADN/ARN y almacene a -80 °C.
  2. Titulación mediante ensayo de TCID50.
    1. Cultive células BHK-21 (densidad de siembra: aproximadamente 2 × 104 células/pocillo, volumen de cultivo: 100 µL) en una placa de 96 pocillos de grado para imágenes negra bajo las condiciones descritas anteriormente.
    2. Deshiele un alícuota del virus, prepare diluciones seriadas diez veces del virus en medio de infección (15 µL de muestra de virus + 135 µL de medio de infección), deseche el medio antiguo y añada 100 µL de las diluciones a las células.
    3. Incube las células durante 1 h a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂ y sustituya posteriormente el inóculo por 100 µL de medio de infección fresco.
    4. A las 48 h postinfección (hpi), evalúe la replicación viral mediante medición de fluorescencia utilizando un lector multimodal de placas de imagen (descripción detallada en la sección 7) y determine el efecto citopático causado por la infección viral. Calcule el valor de TCID50 según el método de Reed-Muench28 y conviértalo en títulos virales estimados (PFU/mL) utilizando la aproximación estándar basada en la distribución de Poisson, según la cual 1 TCID50 equivale a 0,7 PFU.

5. Determinación de la citotoxicidad

  1. Cultive células U4.4 (densidad de siembra: aproximadamente 3 × 104 células/pocillo, volumen de cultivo: 100 µL) en una placa de cultivo celular transparente de 96 pocillos bajo las condiciones descritas anteriormente.
    NOTA: Los pocillos periféricos (filas A y H; columnas 1 y 12) se sembraron con células pero se excluyeron del análisis experimental para evitar efectos de borde, incluida la evaporación aumentada.
  2. Cuando alcancen una confluencia del 90 % (confluencia objetivo: aproximadamente 6 × 104 células), trate las células con 100, 50, 25 y 12,5 µM de los inhibidores de furina MI-1130 y MI-1131 en un volumen total de 100 µL. Añada MI-1148 (en las mismas concentraciones que MI-1130 y MI-1131), células no tratadas y células tratadas con agua como controles negativos, e ionomicina (100 µM en el ensayo) como control positivo de citotoxicidad.
  3. A las 48 h post-tratamiento (hpt), evalúe la viabilidad celular mediante un ensayo luminiscente basado en la cuantificación de ATP. Añada un volumen igual del reactivo del ensayo luminiscente a cada pocillo (1:1 respecto al medio de cultivo), agite la placa durante 2 min para asegurar la lisis celular e incube durante 10 min a oscuras antes de medir la luminiscencia.
    NOTA: También pueden utilizarse otros ensayos de viabilidad celular basados en diferentes principios de detección.
  4. Registre la luminiscencia en una placa negra o blanca de 96 pocillos utilizando un lector multimodal.

6. Infección viral y tratamiento con un compuesto antiviral

  1. Cultive células U4.4 (densidad de siembra: aproximadamente 3 × 104 células/pocillo, volumen de cultivo: 100 µL) en una placa de 96 pocillos negra para imágenes, bajo las condiciones descritas anteriormente.
    NOTA: Los pocillos periféricos (filas A y H; columnas 1 y 12) se sembraron con células pero se excluyeron del análisis experimental para evitar efectos de borde, incluida la evaporación aumentada.
  2. Infecte las células (confluencia objetivo: aproximadamente 6 × 104 células) con SFV-mCherry a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 en medio L-15 sin suplementar, utilizando un volumen de inoculación de 100 µL, e incube durante 1 h a 28 °C.
    NOTA: Se deben utilizar únicamente stocks de virus reporteros de bajo pase, especialmente al trabajar con MOIs muy bajos e infecciones de varios días.
  3. Diluya los inhibidores de furina MI-1130, MI-1131 y MI-1148 a concentraciones finales de 100, 50, 25 y 12,5 µM en una placa separada de 96 pocillos con fondo en V, utilizando medio L-15 suplementado. Prepare 110 µL por pocillo para permitir un exceso del 10 %, y transfiera 100 µL (volumen final) sobre las células. Como controles, utilice células infectadas tratadas con el disolvente de los compuestos antivirales y células infectadas con el virus únicamente como control negativo. También deben agregarse células no infectadas y no tratadas para medir la fluorescencia de fondo.
  4. Tras el período de infección de 1 h, retire el inóculo y transfiera 100 µL de los inhibidores de furina diluidos desde las placas de fondo en V a las placas negras para imágenes.
  5. Incube las células a 28 °C.

7. Imagenes de fluorescencia en células vivas, análisis cuantitativo de imágenes y presentación de datos

  1. Medición de la expresión del reportero viral mediante microscopía de fluorescencia (consulte Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6, and Supplementary Figure 7 para la configuración del programa).
    1. A las 24 y 48 hpi, tiña los núcleos celulares añadiendo 8 µL de una solución de contratiñido nuclear permeable a la célula por pocillo. Incube durante 30 min a 28 °C.
      NOTA: La infección puede monitorizarse en múltiples puntos temporales. Sin embargo, las mediciones a las 48 h post-infección proporcionan la señal más intensa (consulte Supplementary Figure 8) y permiten evaluar los efectos antivirales de forma más confiable. Las lecturas a las 24 h o en puntos temporales intermedios son factibles, pero prolongar la incubación más allá de las 48 h aumenta el riesgo de sobrecrecimiento celular. Seleccione una confluencia celular adecuada al inicio del experimento para asegurar que las células no alcancen sobrecrecimiento en el momento elegido para la lectura. Esto evitará la obstrucción de un recuento celular preciso.
    2. Tras la incubación (y además de la tapa transparente), agregue una lámina sellante transparente que cubra la parte superior de la placa para garantizar la seguridad.
      NOTA: Al utilizar un dispositivo de imagen, es esencial seleccionar el tipo correcto de placa. La iluminación, el tiempo de integración y los ajustes de ganancia variarán según el gen reportero. Se recomienda encarecidamente realizar mediciones preliminares para determinar los parámetros óptimos. Los ajustes iniciales de iluminación, integración y ganancia utilizados para establecer el protocolo bajo las condiciones dadas se proporcionan en la Supplementary Figure 2, donde se describe detalladamente la configuración del programa.
    3. Adquiera imágenes completas de cada pocillo utilizando ensamblaje de imágenes (cuatro campos por pocillo con aumento de 4x) mediante el lector multimodal.
    4. Mida la intensidad de fluorescencia roja utilizando un cubo de filtros Texas Red (Excitación: 586/15 nm; Emisión: 647/57 nm).
    5. Determine el recuento total de células utilizando el canal DAPI con los siguientes ajustes (Excitación: 377/50 nm; Emisión: 447/60 nm).
  2. Análisis cuantitativo de imágenes (consulte Supplementary Table 1 para los datos brutos).
    NOTA: Para las mediciones de fluorescencia, se utilizó un lector de microplacas con capacidad de imagen. Los parámetros detallados empleados en este ensayo se encuentran en la Supplementary Figure 2.
    1. Procese las imágenes utilizando software de imagen adecuado.
    2. Mediante el panel de reducción de datos, seleccione el ensamblaje de imágenes para los canales DAPI y Texas Red con el fin de crear una única imagen por pocillo.
    3. Agregue Estadísticas de Imagen y seleccione Intensidad total en el canal Texas Red Ensamblado. Aplique Preprocesamiento de Imagen para eliminar el ruido de fondo del canal DAPI Ensamblado.
    4. Realice un Análisis Celular en el canal DAPI Ensamblado Preprocesado.
    5. Calcule la intensidad media de fluorescencia roja por célula restando la fluorescencia media de los pocillos control no infectados y no tratados de cada pocillo tratado, y luego divida el resultado por el recuento total de células en el pocillo correspondiente.
  3. Solución de problemas
    1. Supervise la estabilidad del enfoque durante la medición, especialmente en mediciones de imagen prolongadas o al usar placas sensibles a la temperatura.
    2. Active el enfoque automático y aumente su frecuencia si se observa deriva del enfoque. Reduzca la velocidad de adquisición o permita que las placas se equilibren a la temperatura del instrumento antes de la imagen si la deriva persiste.
    3. Utilice placas de calidad para imagen para asegurar una calidad de señal constante durante la adquisición. Evite el paso cruzado (bleed-through) y la sobreexposición evitando una iluminación excesiva y tiempos largos de integración.
    4. Reduzca la intensidad de excitación, acorte el tiempo de integración o disminuya la ganancia hasta evitar la saturación de la señal. Verifique que los canales del fluoróforo estén bien separados y ajuste los filtros según sea necesario.
      NOTA: El paso cruzado entre DAPI y mCherry generalmente es bajo, pero depende del constructo reportero utilizado (por ejemplo, GFP).
    5. Evite la sobreconfluencia celular para mantener una cinética de infección adecuada y la sensibilidad del ensayo. Si ocurre sobreconfluencia, reduzca el tiempo de incubación antes de la medición.
    6. Supervise los efectos del colorante sobre la viabilidad celular y la calidad de la señal, especialmente a concentraciones altas. Reduzca la concentración del colorante o acorte los tiempos de incubación si se observa toxicidad relacionada con el colorante o un fondo excesivamente saturado.
    7. Prepare y almacene los colorantes según las recomendaciones del fabricante para mantener la estabilidad de la señal.

Resultados

En este trabajo, se presenta un protocolo detallado para monitorear la diseminación de alfavirus y evaluar compuestos antivirales (por ejemplo, inhibidores de furina) mediante microscopía de fluorescencia en formato de placa de múltiples pocillos. Para demostrar la visualización de los efectos inhibitorios sobre la expresión del reportero viral, se seleccionaron tres inhibidores de furina sintetizados previamente para su evaluación en la línea celular aedina U4.4: MI-1148, MI-1130 y MI-1131. En Figura 1 se ilustra una visión general del flujo experimental.

Antes de evaluar la eficacia antiviral, es esencial analizar la citotoxicidad para asegurarse de que cualquier reducción en la replicación viral no se deba a la muerte celular causada por el compuesto. Por lo tanto, las células U4.4 se trataron al 90 % de confluencia con los inhibidores a concentraciones de 100, 50, 25 o 12,5 µM. Las células no tratadas y las células tratadas con agua (control de disolvente) sirvieron como controles negativos, mientras que la ionomicina se utilizó como control positivo. La viabilidad celular se evaluó a las 48 h posteriores al tratamiento mediante un ensayo luminiscente basado en la cuantificación de ATP. Para los inhibidores de furina evaluados, no se observó una reducción significativa en la viabilidad celular (Figura 2).

Dado que no hubo citotoxicidad, los compuestos se evaluaron posteriormente por su actividad antiviral. Por este motivo, las células U4.4 fueron infectadas con SFV-mCherry durante 1 h, seguido de tratamiento con los mismos inhibidores de furina en las mismas concentraciones. Las células infectadas sin tratar y las células infectadas tratadas con agua sirvieron como controles negativos para la actividad antiviral, mientras que las células no infectadas sin tratar se utilizaron para evaluar la fluorescencia de fondo. A las 48 h posteriores al tratamiento, la expresión del reportero viral se cuantificó mediante microscopía de fluorescencia. Antes de la adquisición de imágenes, se añadieron 8 µL de una solución de tinción nuclear permeable a las células a cada pocillo y se incubaron durante 30 min para teñir los núcleos celulares. La señal de fluorescencia roja correspondiente a la expresión del reportero viral y el número total de núcleos se cuantificaron a partir de imágenes de fluorescencia procesadas. Entre los inhibidores ensayados, MI-1148 demostró una actividad antiviral potente, reduciendo significativamente la expresión del reportero viral de manera dependiente de la dosis (Figura 3). En contraste, MI-1130 y MI-1131 no mostraron inhibición observable de la expresión del reportero viral en ninguna de las concentraciones ensayadas. Los datos brutos y el análisis del ensayo antiviral se proporcionan en Tabla Suplementaria 1.

Los resultados representativos demuestran que el protocolo identifica de manera confiable compuestos con actividad antiviral, como se observa en la fuerte reducción de la señal del reportero obtenida con MI-1148. En contraste, los inhibidores MI-1130 y MI-1131 no disminuyeron la expresión del reportero, lo que indica que su potente inhibición de la furina, reflejada por constantes de inhibición en el rango de picomoles, no se tradujo en actividad antiviral bajo estas condiciones (Figura 4). Estos hallazgos destacan la capacidad del ensayo para distinguir compuestos activos de los inactivos y para apoyar la identificación de estructuras líder potentes y relevantes.

Proceso de cribado antiviral; cultivo celular, infección viral, tratamiento con compuestos; gráfico de análisis de datos.
Figura 1: Flujo experimental. Una descripción esquemática del procedimiento experimental utilizado para evaluar la actividad antiviral de inhibidores de la furina en la línea celular aedina U4.4. El flujo de trabajo incluye la preparación del compuesto, siembra celular, infección con el virus de Semliki Forest marcado con mCherry, tratamiento con compuestos, microscopía de fluorescencia para visualización en tiempo real y cuantificación de la expresión del reportero viral. Esta ilustración fue creada con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de viabilidad celular, comparación de concentración de fármaco; tratamientos con MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Figura 2: Efectos citotóxicos de los inhibidores de furina en células U4.4. Cuando alcanzaron aproximadamente el 90 % de confluencia, las células U4.4 fueron tratadas con MI-1148, MI-1130 y MI-1131 a concentraciones de 100, 50, 25 y 12,5 µM. Las células no tratadas y las tratadas con agua sirvieron como controles negativos, mientras que la ionomicina (100 µM) se utilizó como control positivo. A las 48 h posteriores al tratamiento, se evaluó la viabilidad celular mediante la cuantificación de ATP. Los datos se normalizaron respecto al control no tratado y se expresaron como porcentaje (%). Se muestra la viabilidad celular media (n=3), y las barras de error representan el coeficiente de variación. La línea punteada representa el umbral de citotoxicidad establecido en el 80 %. n.d. = no detectable. La representación de los datos se realizó con GraphPad Prism v9.5.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de la intensidad roja celular frente a la concentración del fármaco; análisis estadístico de los compuestos de la serie MI.
Figura 3: Actividad antiviral de inhibidores de la furina frente al virus Semliki Forest (SFV) marcado con mCherry en la línea celular aedina U4.4. Cuando alcanzaron aproximadamente el 90 % de confluencia, las células fueron infectadas con SFV-mCherry durante 1 h, seguido del tratamiento con MI-1148, MI-1130 y MI-1131 a concentraciones de 100, 50, 25 y 12,5 µM. A las 48 h posteriores al tratamiento, se cuantificó la expresión del gen reportero viral mediante microscopía de fluorescencia. Antes de la adquisición de imágenes, se añadieron 8 µL de una solución de tinción nuclear permeable a las células a cada pocillo y se incubaron durante 30 min para teñir los núcleos celulares. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron utilizando un filtro Texas Red para la señal viral y un filtro DAPI para los núcleos. Se realizó un análisis de imágenes para cuantificar la intensidad total de fluorescencia roja (indicativa de la replicación viral) y el número total de células por pocillo. Los datos (n = 4) se presentan como intensidad roja total por célula (señal total del virus / recuento total de células). Las barras de error representan la desviación estándar. La significancia estadística frente al control infectado con SFV se evaluó mediante ANOVA de un solo factor y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: **** = P<0,0001; ns = P>0,05. La representación de datos y el análisis estadístico se realizaron con GraphPad Prism v9.5.1. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Imagen de microscopía de cultivos celulares infectados con SFV a diferentes concentraciones, que muestra los niveles de infección.
Figura 4: Imágenes de fluorescencia representativas que muestran la actividad antiviral de inhibidores de la furina frente al virus Semliki Forest marcado con mCherry (SFV) en la línea celular aedina U4.4. Las células, con una confluencia aproximada del 90 %, fueron infectadas con SFV-mCherry durante 1 h, seguido del tratamiento con MI-1148, MI-1130 y MI-1131 a concentraciones de 100, 50, 25 y 12,5 µM. Las células infectadas sin tratar y las infectadas tratadas con agua sirvieron como controles negativos, mientras que las células no infectadas sin tratar se incluyeron como controles de fondo. La señal del reportero se evaluó a las 48 h posteriores al tratamiento mediante microscopía de fluorescencia utilizando un filtro Texas Red para captar la señal de mCherry. Barra de escala = 2000 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Datos brutos de la intensidad total de la señal del virus y el recuento de células. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Pasos del procedimiento utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. Primero, un ajuste de temperatura (rojo) que coincide con las condiciones de cultivo de las células U4.4. Luego, tres pasos independientes de adquisición de imágenes (naranja) para las mediciones de DAPI, Texas Red y campo claro. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Configuración de imagen en los pasos del procedimiento utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. Las primeras configuraciones que deben modificarse son: aumento (4x) y tamaño de la imagen (Campo completo). Debe seleccionarse el fluoróforo que se va a medir, y los parámetros de iluminación, tiempo de integración y ganancia deben ajustarse en consecuencia. Por último, deben seleccionarse la montura de imagen (2x2) y el traslape (30 µm x 30 µm). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Pasos de reducción de datos utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. El primer paso es la unión de imágenes (azul) para los canales DAPI y Texas Red. En segundo lugar, las estadísticas de imagen (morado) proporcionan la medición de la intensidad total. Luego, se requiere el paso de preprocesamiento de la imagen (verde) para eliminar el ruido de fondo del canal DAPI. Finalmente, se realiza el análisis celular (amarillo) en la imagen unida y preprocesada del canal DAPI. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Empalme de imágenes en los pasos de reducción de datos utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. La configuración más relevante es la reducción del tamaño de la imagen final (80%), ya que si es menor, afecta la resolución de la imagen y, por lo tanto, la medición final de los parámetros. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: Estadísticas de la imagen en los pasos de reducción de datos utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. Es importante seleccionar el canal correcto (Stitched: Fluorophore), elegir un umbral mínimo (2500) y, finalmente, el parámetro que se va a medir (Total Intensity). Para una medición más precisa, se puede crear un Image Plug. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 6: Preprocesamiento de imágenes en los pasos de reducción de datos utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. La configuración más relevante es el parámetro de bola rodante (30 µm), que da prioridad a resultados finos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 7: Análisis celular en los pasos de reducción de datos utilizados en el lector de imágenes para los resultados representativos. Es importante elegir el canal que tenga la imagen preprocesada. Seleccione dividir los objetos que se tocan y rellenar los huecos con máscaras. Es fundamental elegir el rango correcto de selección de objetos (5-50 µm). Finalmente, para obtener resultados más precisos, se puede crear un complemento de imagen. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 8: Actividad antiviral de inhibidores de furina frente al virus Semliki Forest (SFV) marcado con mCherry en la línea celular aedina U4.4. Cuando alcanzaron aproximadamente el 90 % de confluencia, las células fueron infectadas con SFV-mCherry durante 1 h, seguido del tratamiento con MI-1148, MI-1130 y MI-1131 a concentraciones de 100, 50, 25 y 12,5 µM. A las 24 h (barras rojas) y 48 h (barras verdes) posteriores al tratamiento, se cuantificó la expresión del gen reportero viral mediante microscopía de fluorescencia. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 4). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La capacidad de observar la replicación de alfavirus en tiempo real ofrece una perspectiva secuencial y acumulativa sobre las pruebas convencionales de punto final. Este protocolo de microscopía en células vivas en múltiples tiempos es un modelo útil para estudiar los alfavirus, ya que proporciona una plataforma dinámica para observar la diseminación viral.

El éxito de este protocolo depende de varios parámetros. En primer lugar, es importante evaluar la citotoxicidad de los compuestos antes de realizar un ensayo antiviral para descartar resultados falsos positivos debidos a la muerte celular. Una vez realizada la evaluación de los efectos citotóxicos, se puede proceder a evaluar la actividad antiviral de los compuestos. Para los compuestos en prueba, no se observó citotoxicidad. MI-1130 y MI-1131 no mostraron un impacto significativo en la expresión del reportero viral, mientras que MI-1148, utilizado como control positivo, la suprimió eficazmente. Además, el momento de la infección en relación con la siembra celular es crucial. Las células deben alcanzar una confluencia adecuada para garantizar una infección reproducible sin sobrecrecimiento. También es importante optimizar la multiplicidad de infección según la línea celular, con el fin de observar una infección progresiva sin comprometer la viabilidad celular. Finalmente, la frecuencia de adquisición de imágenes debe determinarse cuidadosamente para permitir la visualización de la expresión gradual del reportero viral sin saltos grandes. Para la mayoría de las aplicaciones, adquirir imágenes cada ocho horas, por ejemplo, proporciona un equilibrio efectivo entre el detalle temporal y la integridad de la muestra.

La principal ventaja de este protocolo es su adaptabilidad. En este experimento, utilizamos SFV-mCherry y células U4.4 para demostrar el monitoreo de la expresión del reportero viral y su inhibición tras el tratamiento con inhibidores de furina. Sin embargo, el protocolo puede optimizarse para el análisis fluorescente de virus alternativos con diferentes marcadores reporteros, como GFP, así como para otros tipos de células hospederas, incluyendo células primarias y líneas celulares diferenciadas. Aunque el protocolo se centra en el tratamiento con compuestos tras la infección, el flujo de trabajo también puede adaptarse fácilmente para experimentos de tiempo de adición, incluyendo pretratamiento, cotratamiento, tratamiento inmediato tras la infección o tratamiento diferido, con el fin de explorar más a fondo el mecanismo de acción antiviral. El protocolo se utilizó inicialmente para comparar la funcionalidad de la maquinaria de ARNi en células C6/36 y U4.414. Posteriormente se amplió para examinar cómo el ARNdc que dirige directamente al virus inhibe la expresión del reportero viral15.

Existen desafíos potenciales que pueden surgir al utilizar este protocolo. Los virus marcadores, aunque muy útiles para numerosas aplicaciones in vivo29 y in vitro30, también pueden presentar menor virulencia31 e inestabilidad genética de los genes marcadores32. La desprendimiento celular causado por la sobreconfluencia puede obstaculizar la visualización y el registro de imágenes claras, afectando así el recuento celular. La exposición prolongada a colorantes para células vivas (por ejemplo, Hoechst 33342 para los núcleos) puede alterar el comportamiento o la viabilidad celular15. Además, los experimentos que involucran alfavirus altamente patógenos, como el CHIKV, pueden requerir medidas de bioseguridad más estrictas y adaptaciones del protocolo correspondientes. Asimismo, en algunos casos puede observarse desenfoque debido a la variabilidad de las placas, así como al uso de placas diferentes. Por ejemplo, las señales de fluorescencia en placas de cultivo celular transparentes pueden difuminarse desde los pocillos hacia los adyacentes, y las placas blancas pueden provocar sobreexposición. En ambos casos, se verá afectada la precisión de la medición de la señal fluorescente.

Este protocolo ofrece varias ventajas sobre los ensayos virológicos convencionales. Por ejemplo, los ensayos de placas y los ensayos de TCID50 proporcionan datos puntuales sobre los títulos virales12. Además, la qPCR permite la detección sensible del ARN viral, pero no puede distinguir entre virus con capacidad de replicación y partículas virales no infecciosas o ácidos nucleicos residuales. En contraste, este tipo de imagenología fluorescente en tiempo real permite una evaluación continua y no invasiva de la progresión viral, la diseminación y los efectos del tratamiento dentro de la misma población de células a lo largo del tiempo.

Más allá del examen de inhibidores de furina como compuestos antivirales, nuestro protocolo puede adaptarse para otras aplicaciones. Es especialmente adecuado para la selección de fármacos antivirales, permitiendo la cuantificación de respuestas dependientes de la dosis frente a diversos compuestos. Proporciona una plataforma para estudiar las interacciones entre el huésped y el patógeno, incluyendo el momento y la localización de la entrada viral, la replicación y la diseminación. Puede utilizarse para comparar virus marcadores, diferentes cepas o distintos alfavirus. Además, puede combinarse con enfoques como la inhibición génica mediante siRNA o ARNds. Por lo tanto, este sistema puede ayudar a identificar y validar dianas críticas y compuestos antivirales para la replicación viral. Sin embargo, este ensayo basado en fluorescencia representa un enfoque inicial de cribado y no un método confirmatorio independiente; serán necesarias investigaciones adicionales, incluyendo ensayos con virus silvestres, para respaldar los resultados del cribado.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al Prof. Dr. Andres Merits, Universidad de Tartu, Estonia, y al Prof. Dr. Andreas Pichlmair, Universidad Técnica de Múnich, Alemania, por proporcionar el plásmido pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Agradecemos a la Prof. Dra. Stefanie Becker, Universidad de Medicina Veterinaria, Hannover, Alemania, por las células C6/36. Agradecemos al Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, Universidad de Marburgo, Marburgo, Alemania, por proporcionar los inhibidores de furina. Este trabajo fue financiado por el programa Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz del Ministerio de Educación Superior, Investigación y Artes de Hesse a través del Centro LOEWE para Genómica de Biodiversidad Traductiva (LOEWE-TBG) con el código de financiación: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, y por el BMFTR (Proyecto ASCRIBE-Número de subvención 01KI2024).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Albúmina bovina fracción V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
DMEM BenchStableThermo Fisher ScientificA4192101
Células BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemania603126
FRASCO DE CULTIVO CELULAR, 50 mL, 25 cm2, PS, tapón roscado con filtro rojo, transparente, CELLSTAR, TC, estérilGreiner Bio-One690175
Microplaca para cultivo celular, 24 pocillos, PS, fondo F, (pocillo tipo chimenea), transparente, CELLSTAR, TC, tapa con anillos anticondensación, estérilGreiner Bio-One662160
Microplaca para cultivo celular, 96 pocillos, PS, fondo F, (pocillo tipo chimenea), µCLEAR, negro, CELLSTAR, TC, tapa con anillos anticondensación, estérilGreiner Bio-One655090
Microplaca para cultivo celular, 96 pocillos, PS, fondo F, (pocillo tipo chimenea), transparente, CELLSTAR, TC, tapa con anillos anticondensación, estérilGreiner Bio-One655180
Microplaca para cultivo celular, 96 pocillos, PS, fondo V, transparenteGreiner Bio-One651101
raspador celularVWR734-2602
Ensayo luminiscente de viabilidad celular CellTiter-GloPromegaG7573
Lector multimodal de imágenes celulares Cytation 5Biotek
Cubo de filtro DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM con GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Suero bovino fetalFisher Scientific11550356
Inhibidor de furina MI-1130Este estudio
Inhibidor de furina MI-1131Este estudio
Inhibidor de furina MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Software Gen5 PrimeBiotek
Sal de ionomicina con calcio, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Medio Leibovitz L-15, suplemento GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Reactivo de transfección Lipofectamina 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Ácidos aminoácidos no esenciales MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Microplaca, PS, 96 pocillos, fondo F, (pocillo tipo chimenea), negro, Fluotrac, unión mediaGreiner Bio-One655076
Reactivo NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Universidad de Tartu, Estonia) y Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Universidad Técnica de Múnich, Alemania)
Cubo de filtro Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Caldo de triptosa fosfato Thermo Fisher Scientific18050039
Células U4.4Instituto Friedrich-Loeffler, Instituto Federal de Investigación para la Salud Animal, Greifswald, Alemania
Sellador Viewseal, transparenteGreiner Bio-One676070

Referencias

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