Generación de un modelo basado en organoides prostáticos de ratón para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Summary

Este protocolo describe la generación de un modelo murino basado en organoides prostáticos cultivado en 2D. Incluye disociación de organoides, siembra celular, diferenciación, evaluación de la integridad epitelial e infección in vitro con Escherichia coli uropatógena. El modelo proporciona accesibilidad apical y es adecuado para estudiar las interacciones huésped-patógeno, superando las limitaciones de los sistemas organoides 3D tradicionales.

Abstract

Los hombres mayores están muy afectados por enfermedades prostáticas, como la hiperplasia benigna de próstata, la prostatitis y el cáncer de próstata. En conjunto, estas condiciones contribuyen significativamente a la carga sanitaria global y son una de las principales causas de enfermedad en los hombres. Los modelos organoides han transformado la modelización de enfermedades al permitir replicar características clave de la estructura y función epitelial in vitro. Sin embargo, la estructura de lumen cerrado de los organoides limita el acceso experimental a la superficie apical, dificultando los estudios de las interacciones huésped-patógeno. Para superar estos desafíos, generamos un sistema de cultivo fisiológicamente relevante en el que las células derivadas de organoides prostáticos de ratón se siembran como un modelo bidimensional (2D). Este enfoque mantiene características epiteliales esenciales al tiempo que proporciona acceso directo a la superficie apical. Este protocolo paso a paso describe la disociación de organoides prostáticos maduros de ratón y las condiciones óptimas de siembra para apoyar la adhesión, proliferación y diferenciación celular. La microscopía de inmunofluorescencia confirmó la expresión de marcadores específicos de próstata en el modelo basado en organoides y demostró una representación precisa de la organización celular del tejido prostático. Las mediciones TEER, junto con la F-actina y la tinción por unión estrecha, confirmaron aún más la diferenciación celular y la formación de barreras. La infección del modelo con Escherichia coli uropatogénica (UPEC) demostró su utilidad para investigar las interacciones huésped-patógeno. Este modelo proporciona una plataforma valiosa para investigar la biología epitelial prostática y los mecanismos de la enfermedad, y es especialmente adecuado para estudiar las interacciones huésped-patógeno y evaluar posibles estrategias terapéuticas.

Introduction

La glándula prostática es un órgano pequeño situado debajo de la vejiga, que rodea la uretra. Es un órgano esencial del tracto reproductor masculino, y su función principal es producir el líquido prostático. Este fluido representa hasta el 30% del plasma seminal, y es clave para nutrir y proteger el esperma durante su recorrido por el tracto reproductor^{femenino 1}. Las enfermedades de próstata, como la prostatitis, la hiperplasia benigna de próstata y el cáncer de próstata, son muy prevalentes y suponen una carga significativa para la atención sanitaria a nivel^mundial 2,3,4,5. Aunque la hiperplasia benigna de próstata y el cáncer de próstata se están estudiando extensamente, la prostatitis, y especialmente la prostatitis bacteriana, siguen siendo relativamente poco estudiadas. La prostatitis afecta hasta al 16% de los hombres^{a nivel mundial (6,7}), siendo las infecciones bacterianas aproximadamente el 10% de los casos. A pesar de su prevalencia, la prostatitis bacteriana sigue siendo poco comprendida. Las cepas de Escherichia coli (E. coli), específicamente la uropatógena E. coli (UPEC), son la principal causa de prostatitis^{bacteriana 8,9}.

La investigación sobre los mecanismos moleculares de la infección prostática sigue limitada por la ausencia de modelos in vitro fisiológicamente relevantes. La mayoría de los estudios sobre la enfermedad prostática se han basado tradicionalmente en líneas celulares o modelos animales. En particular, líneas celulares cancerosas o transformadas como LNCaP o RWPE-1 se han utilizado ampliamente para modelar la enfermedad prostática y la respuesta al^tratamiento 10,11,12,13. Sin embargo, estos modelos carecen de composición celular ni de la complejidad de un epitelio prostático sano o canceroso. Además, muchos otros estudios han empleado modelos animales (principalmente modelos de ratón) para estudiar diferentes hipótesis sobre la infección prostática, la respuesta inmune, el crecimiento tumoral prostático y la metástasis 14,15,16,17. Aunque estos modelos han sido los más avanzados e informativos hasta ahora, suelen plantear preocupaciones éticas, requieren tiempo y recursos considerables, y pueden ser costosos. Alternativamente, los explantes de tejidos ex vivo y los cultivos celulares primarios también se han utilizado para estudios a corto plazo de respuestas tisulares a fármacos o desarrollo de cáncer 18,19,20. Sin embargo, estos modelos tienen una vida útil limitada y la disponibilidad de tejido humano fresco suele estar limitada.

Los cultivos organoides tridimensionales (3D) derivados de células madre adultas han surgido como una alternativa prometedora para modelar tejidos epiteliales in vitro. A diferencia de las líneas celulares convencionales, los organoides conservan características clave del epitelio original, como la heterogeneidad celular, la arquitectura específica del tejido y las características^funcionales 21,22,23. A diferencia de los cultivos celulares primarios o explantaciones ex vivo, los cultivos organoides pueden expandirse y pasar durante un largo periodo de tiempo sin volverse senescentes. Estas propiedades hacen que los sistemas organoides sean especialmente adecuados para estudiar enfermedades e interacciones huésped-patógeno en un contexto fisiológicamente relevante. Los organoides prostáticos se han generado a partir de tejido humano sano y canceroso, así como de modelos murinos, y se han utilizado principalmente en la investigación sobre el cáncer de próstata 24,25,26. No obstante, para los estudios de infecciones, la estructura 3D de los organoides supone un desafío significativo, principalmente debido al acceso limitado a la superficie celular luminal. Tradicionalmente, los organoides 3D intactos se han infectado ya sea microinyectando el agente patógeno, o disociando primero el organoide en fragmentos o células individuales antes de incubarlo con el patógeno²³. Aquí, la variabilidad en tamaño y estructura 3D puede afectar a la reproducibilidad y al rendimiento. Como alternativa, los organoides apical-out proporcionan una forma de superar la limitación de la inaccesibilidad del lumen. El cultivo de organoides en suspensión, ya sea en placas de cultivo de tejido de ultra baja adherencia o en superficies recubiertas con tensioactivos no adhesivos, induce una inversión de la polaridad organoide. Como resultado, la superficie apical mira hacia afuera, permitiendo el acceso directo para estudios de infección por^{patógenos 27,28}. Sin embargo, estos cultivos no pueden mantenerse a largo plazo, y la variabilidad en el tamaño del organoide y el número de células complica la determinación de la multiplicidad de la infección (MOI). Además, los mecanismos subyacentes a la inversión de polaridad y sus efectos sobre las células organoides aún no se comprenden completamente. Para superar las limitaciones de los organoides como en los modelos de infección in vitro, se han desarrollado modelos organoides accesibles apicalmente utilizando organoides de órganos como el estómago, el intestino o el^{pulmón 29,30,31}. Estos sistemas preservan las principales características epiteliales y permiten una manipulación, obtención de imágenes y exposición controlada más sencillas a patógenos y/o medicamentos. Sin embargo, las condiciones de cultivo que permiten la diferenciación celular no siempre se traducen de los cultivos organoides a los modelos de cultivo 2D^31,32.

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo epitelial prostático apicamente accesible utilizando organoides prostáticos de ratón. Este modelo fue desarrollado y validado previamente en nuestro laboratorio, donde demostramos su fuerte parecido con el tejido prostático nativo y su relevancia para estudios de biología de infecciones que involucran la UPEC³². El sistema imita de cerca la composición celular y la polaridad del epitelio prostático, ofreciendo una mayor accesibilidad para la manipulación experimental. Además, demostramos su aplicabilidad para estudiar las interacciones huésped-patógeno en la próstata, proporcionando una alternativa más manejable a los modelos in vivo y un sistema fisiológicamente más relevante que las líneas celulares convencionales o los modelos organoides 3D.

Protocol

Declaración ética: Todos los procedimientos animales cumplieron con las directrices de cuidado y uso animal de la Universidad de Würzburg y fueron aprobados bajo las normativas institucionales y gubernamentales pertinentes. Solo se utilizaron ratones WT que habían sido eutanasiados en nuestro instituto por otros grupos de investigación con fines independientes en este estudio. No se sacrificaron animales específicamente para este trabajo, de acuerdo con los principios de las 3R (reemplazo, reducción y refinamiento).

NOTA: El protocolo presentado aquí se basa en un estudio previo publicado por los^{autores 32}. Todos los pasos descritos deben realizarse en un armario de bioseguridad estéril, utilizando las técnicas asépticas aplicables y el equipo de protección personal adecuado. Los organoides prostáticos murinos se generaron a partir de ratones C57BL/6 y se mantuvieron en cultivo 3D, como se describió^{anteriormente en 25,26}. Para seguir los principios de la 3R, la clínica veterinaria donó próstatas de ratón a partir de ratones WT ingenuos sin tratar (al menos de 6 meses) sacrificados por otros motivos. Brevemente, las próstas del ratón fueron picadas y digeridas en dos pasos usando colagnasa y la enzima TrypLE Express. Las células se sembraron en gotas de matriz extracelular (ECM) para generar los organoides 3D. Se añadió medio de cultivo y se reponía cada 3 días. Los cultivos organoides 3D se pasaban una vez por semana y se usaban para la siembra 2D a partir del pasaje 3. Se utilizaron organoides prostáticos de ratón de una semana de antigüedad para sembrar el modelo basado en organoides sobre una superficie 2D siguiendo el protocolo actual. No es necesario recubrir las placas de cultivo de tejidos con proteínas ECM para este protocolo.

1. Generación del modelo basado en organoides prostáticos

1. Aislamiento de organoides 3D
   1. Aspira el medio del número deseado de pozos de organoides 3D de una placa de 24 pozos. Sustituyéndolo por 500 μL de adDMEM/F12+/+ por pozo (véase Tabla de Materiales).
   2. Usa una pipeta P1000 para interrumpir mecánicamente la caída del ECM. Recoge la suspensión en un tubo cónico de 15 mL. Recoge solo un máximo de dos pozos por tubo.
   3. Recarga con adDMEM/F12+/+ hasta 10 mL. Con cuidado, invierte el tubo 3-4 veces para mezclar. Centrifugar a 450 x g durante 5 minutos a 4 °C.
2. Disrupción de organoides 3D en células individuales
   1. Aspira el sobrenadante. Resuspende el pellet en 2 mL de enzima TrypLE Express precalentada (37 °C) suplementada con 10 μM de RHOKi.
   2. Incuba en baño maria a 37 °C durante 15 minutos. Usa una pipeta P1000 para mezclar la suspensión de celdas cada 5 minutos.
      NOTA: Revisa la suspensión celular bajo un microscopio invertido usando un objetivo 4x para verificar que las células son mayormente solas. Pequeños grupos de 2-3 células son aceptables. Normalmente, 15 minutos de incubación son suficientes, pero esto puede extenderse si es necesario.
   3. Recarga con 10 mL de adDMEM/F12+/+. Con cuidado, invierte el tubo 3-4 veces para mezclar. Centrifugar a 450 x g durante 5 minutos a 4 °C.
3. Suspensión de una sola celda con chapa
   1. Aspira el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspende el pellet celular en un medio de cultivo suplementado con 10 μM de RHOKi (300 μL de medio de cultivo por pozo de organoides 3D utilizados en el paso 1.1.1).
      NOTA: El medio de cultivo está compuesto por: Advance Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acetilcisteína, medio acondicionado Noggin al 10%, 10% R-spondin 1 medio acondicionado, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihidrotestosterona (DHT), 0,2 μM TGFβi y 100 ng·^mL-1 Primocina (véase Tabla de Materiales). Para experimentos de infección, utiliza medio de cultivo sin Primocina.
   2. Cuenta el número de celdas en la suspensión usando una cámara de conteo Neubauer.
   3. Diluir la suspensión celular en un medio de cultivo suplementado con 10 μM RHOKi hasta una concentración de 62.500 células·^mL-1. Utilizar 200 μL de la suspensión de celda por pozo para sembrar en placas de 48 pozos (cultivo de tejido tratado del fabricante, véase Tabla de Materiales) o 300 μL por pozo en diapositivas μ con cámara (véase Tabla de Materiales). Coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C y 5% de_CO2.
      NOTA: Cada pozo de organoides 3D, utilizado en el Paso 1.1.1. normalmente produce aproximadamente 200.000 celdas.
   4. Tras un día, la mayoría de las celdas individuales están unidas a la superficie 2D. Cambia el medio de cultivo cada 2-3 días. La confluencia se alcanza en un plazo de 7 días.
      NOTA: Asegúrate de que RHOKi se añada solo para la siembra inicial y no para cambios posteriores de medio.
4. Diferenciando el modelo basado en organoides.
   NOTA: Siga los siguientes pasos para obtener un modelo diferenciado basado en organoides enriquecido con células luminales.
   1. Añade 10 nM de DHT a la suspensión de la celda (paso 1.3.3). Utiliza un medio de cultivo suplementado con 10 nM de DHT para los cambios posteriores de medio (cada 2-3 días).
      NOTA: Si no se añade DHT a la suspensión celular (y los cambios posteriores en el medio), el modelo basado en organoides se enriquecerá con células basales.

2. Mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

1. Siembra la suspensión de células organoides a una concentración de 62.500 células·^mL-1, usando 300 μL (obtenidos en el paso 1.3.3.) en una lámina PET μ de 8 pozos con 40 electrodos por pozo (véase Tabla de Materiales). Añadir 300 μL de medio de cultivo, descrito en 1.3.1, a uno de los pozos sin celdas.
   NOTA: El pozo sin celdas se utiliza como espacio en blanco para las mediciones.
2. Conecta la μ-portaobjetos al sistema de análisis celular basado en impedancia (véase Tabla de Materiales) con la estación de 16 pozos situada dentro de una incubadora de cultivo de tejidos. Mide el TEER a 400 Hz durante 7 días. Cambia el medio de cultivo cada 2-3 días.

3. Tinción por inmunofluorescencia

NOTA: Para este método, asegúrese de que las células se siembran en portaobjetos μ con cámara (véase Tabla de Materiales), que sean compatibles con aplicaciones de microscopía de alta resolución.

1. En el momento seleccionado, retira el medio y lava las celdas 3 veces con 1x PBS. Fija las células con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente (evita la exposición a la luz).
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído al 4% puede causar una reacción alérgica cutánea, daños oculares graves y se sospecha que puede causar cáncer. Utiliza siempre el equipo de protección individual (EPP) adecuado. Evita inhalar polvo, vapores, gases, nieblas, vapores o sprays. Lleva guantes protectores y asegúrate de que la ropa contaminada permanezca en el laboratorio hasta que se desinfecte correctamente. Elimina el contenido y los contenedores a través de una instalación aprobada para la eliminación de residuos.
2. Después de la fijación, lava las células 3 veces con 1 PBS (5 minutos cada una). Permeabiliza las células con 0,5% de Triton X-100 (véase Tabla de Materiales) durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El Triton X-100 causa irritación cutánea y daños oculares graves. Es muy tóxico para la vida acuática con efectos duraderos y puede causar alteraciones endocrinas en el entorno. Al manipularlo, lleva guantes protectores, protección ocular y facial. Elimina el contenido y los contenedores a través de una instalación aprobada para la eliminación de residuos. Evita liberarte en el ambiente.
3. Lava las células dos veces con 1 PBS (5 minutos cada uno). Bloquea las celdas con buffer bloqueante (1% de BSA en PBS, véase la Tabla de Materiales) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Diluye los anticuerpos primarios en el tampón bloqueador (1% de BSA en 1x PBS) e incuba con las células durante la noche a 4 °C sobre una plataforma de balanceo. Al día siguiente, incuba 1 hora a temperatura ambiente. (véase la Tabla de materiales para diluciones de anticuerpos).
   NOTA: Para la tinción de F-actina con faloidina o membrana plasmática con CellMask (véase Tabla de Materiales), salte el paso 3.4.
5. Lava las celdas 3 veces con 1 PBS (5 minutos cada una). Diluir los anticuerpos secundarios, falloidina o CellMask (véase Tabla de Materiales) en un tampón bloqueante (1% de BSA en 1x PBS) e incubar con las células 1 hora a temperatura ambiente.
6. Lava las celdas 3 veces con 1 PBS (5 minutos cada una). Incuba las células durante 15 minutos a temperatura ambiente con Hoechst (véase la Tabla de Materiales) diluido en 1x PBS para teñir los núcleos.
7. Lava las celdas 3 veces con 1x PBS (5 min cada una) y deja las celdas con 1x PBS. Guárdalos a 4 °C.
8. Imagina las láminas de μ láminas con cámara (véase la Tabla de Materiales) en una microscopía confocal de barrido láser o un microscopio de fluorescencia.
   NOTA: Las imágenes generales podían obtenerse utilizando un objetivo de 20x en un microscopio de fluorescencia para evaluar la eficiencia y distribución general de la infección. Se obtuvieron imágenes de mayor resolución utilizando un microscopio confocal equipado con un objetivo de inmersión en agua de 40x para visualizar bacterias individuales adheridas o internalizadas dentro de las células epiteliales. Los fluoróforos se excitaban usando líneas láser a 405, 499, 590 y 653 nm, dependiendo de los fluoróforos utilizados. La emisión se detectó con ventanas de emisión ajustadas a 415 a 516 nm para Hoechst, 509 a 573 nm para GFP o Alexa 488, 600 a 651 nm para mcherry o Alexa 594, y 663 a 720 nm para Alexa 647. Se adquirieron pilas Z con un tamaño de paso de 0,5 μm y cubriendo todo el grosor de la capa epitelial. Las imágenes se adquirían con una resolución de 1024 por 1024 píxeles, con una frecuencia de escaneo de 400 Hz y un promedio de fotogramas en 4, lo que proporciona buena calidad de imagen. La potencia láser y la ganancia del detector se mantuvieron constantes en todas las condiciones dentro del mismo experimento. Todos los parámetros de imagen, incluyendo la potencia del láser, la ganancia del detector, la velocidad de escaneo y el promedio, deben optimizarse y ajustarse según sea necesario según el microscopio confocal utilizado.

4. Infección bacteriana por E. coli uropatogénico (UPEC)

NOTA: Asegúrese de utilizar un modelo basado en organoides mantenido durante 7 días sin Primocina (véase Tabla de Materiales) para los siguientes pasos.

En este estudio se utilizó la cepa uropatógena de E. coli UTI89, que expresa constitutivamente una proteína mCherry del plásmido pFPV-mCherry (resistente a la ampicilina).

PRECAUCIÓN: Al manipular patógenos infecciosos (Nivel de Bioseguridad 2), lleva guantes y protección ocular y facial adecuada. Lleva siempre una bata de laboratorio completamente abotonada. Realiza todos los procedimientos dentro de un gabinete certificado de seguridad biológica. Descontamina las superficies de trabajo y lávate bien las manos después de manipular materiales biológicos. Recoger los residuos BSL-2 en contenedores designados para riesgos biológicos adecuados para autoclave. Descontamina los materiales de desecho antes de su eliminación mediante autoclave u otro método adecuado de descontaminación.

1. Tres días antes del experimento de infección, se desploma la cepa UPEC en una placa de agar LB suplementada con el antibiótico correspondiente (se utilizó ampicilina 100 μg·^mL-1 en este protocolo) e incubar entre 16 y 24 horas a 37 °C.
   PRECAUCIÓN: Algunos antibióticos pueden causar reacciones alérgicas o irritación al contacto y contribuir a la resistencia antimicrobiana si se descartan incorrectamente. Prepara y añade siempre antibióticos dentro de un armario de seguridad biológica mientras llevas el equipo de protección individual adecuado (guantes y protección ocular). Eliminar las soluciones que contengan antibióticos como residuos químicos a través de una instalación aprobada para la eliminación de residuos.
2. Dos días antes del experimento de infección, inocular 3 mL de caldo LB suplementado con el antibiótico correspondiente (ampicilina 100 μg·^mL-1) utilizando una sola colonia UPEC de la placa de agar (paso 4.1). Incubar estáticamente a 37 °C durante 12-16 horas.
3. Un día antes del experimento de infección, haz un vórtice del cultivo bacteriano del paso 4.2 y mide su OD₆₀₀. Calcular el volumen de este cultivo necesario para inocular 3 mL de caldo LB suplementado con ampicilina (100 μg·^mL-1) hasta un OD_inicial de 0,05 usando la siguiente fórmula: Volumen (μL) = (0,05 * 3.000 μL) / OD_{medido 600}. Suma el volumen calculado de la cultura desde el paso 4.2. al caldo fresco de LB y incubar estáticamente a 37 °C durante 24 horas.
   NOTA: El OD₆₀₀ del cultivo nocturno del paso 4.2 debería estar entre 1,7 y 2,2.
4. El día de la infección, haz un vórtice del cultivo bacteriano del paso 4.3 y mide su OD₆₀₀. Cosecha OD_600-1 del cultivo y luego centrifuga a 12.000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Quita el sobrenadante.
5. Resuspender en 1 mL de medio de cultivo organoide libre de primocinas sin DHT. Diluye a un MOI de 100.
   NOTA: Cada pozo en una placa de 48 pozos se considera que tiene aproximadamente 150.000 celdas en el día 7. Esta estimación se obtuvo contando células en un bien antes de la infección a través de múltiples experimentos. Para ajustar con precisión el MOI, se recomienda sembrar un pozo extra para contar células antes de la infección. Para determinar el volumen de suspensión bacteriana (paso 4.4) requerido, multiplica el número de células por pozo por el MOI para obtener el número total de bacterias necesarias por pozo, y luego divide este número por la concentración bacteriana (8 × 10⁵ bacterias/μL) para obtener el volumen en μL.
6. Sustituir el medio de cultivo del modelo a base de organoides por un medio de cultivo que contenga bacterias. Ajusta el volumen según la superficie de cultivo: utiliza 200 μL por pozo para placas de 48 pozos y 300 μL por pozo para μ-deslizamientos. Incubar durante 1 hora en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C y 5% de_CO2.
7. Tras el periodo de incubación, aspira el medio que contiene bacterias del modelo basado en organoides. Lava el pozo 3 veces con adDMEM/F12+/+ para eliminar bacterias extracelulares.
8. Añadir un medio de cultivo que contenga 50 μg·^mL-1 gentamicina para eliminar bacterias extracelulares. Incubarla durante 30 minutos.
   NOTA: Puede ser necesario ajustar la concentración de gentamicina dependiendo de la cepa bacteriana utilizada. Si se utiliza una concentración superior a 50 μg·^mL-1, se recomienda comprobar la citotoxicidad celular.
9. Retirar el medio y sustituir por un medio fresco suplementado con 10 μg·^mL-1 gentamicina durante el tiempo restante de infección.
   Procesar las células infectadas para la tinción por fluorescencia, siguiendo la sección 3, o para cuantificación mediante citometría de flujo, siguiendo la sección 5.

5. Cuantificación de la infección mediante citometría de flujo

1. Aspira el medio de cultivo y lava las células 3 veces con 1 PBS. Utiliza 100 μL de enzima expresa de triple para desprender las células. Incuba durante 5-10 minutos hasta que todas las células estén separadas.
   NOTA: Un pozo de una placa de 48 pozos es suficiente por condición.
2. Recoge la suspensión de la celda y transfierela a un pozo de una placa de 96 pozos (fondo cónico). Añade 100 μL de buffer de citómetro de flujo (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) por encima para inactivar la enzima TrypLE Express.
3. Centrifuga la placa de 96 pozos a 450 x g durante 5 minutos a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 150 μL de buffer de citómetro de flujo.
4. Adquirir y cuantificar las células infectadas utilizando el citómetro de flujo (véase Tabla de Materiales).
   NOTA: La citometría de flujo se realizó utilizando un láser de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 615/20 nm para la detección de células mCherry-positivas. Los datos se adquirieron a un caudal elevado (66 μL·min⁻¹), recogiendo al menos 10.000 eventos por muestra e incluyendo solo eventos con valores de altura de dispersión hacia adelante superiores a 80.000. Las células infectadas se identificaron basándose en la fluorescencia de mCherry en comparación con un control no infectado (ingenuo), tras la exclusión de restos y dobletes. Se puede incluir un marcador de viabilidad (por ejemplo, yoduro de propidio u otras tinciones vivas/muertas) en la estrategia de acceso para evaluar la viabilidad celular. Esto puede ser especialmente útil al trabajar primero con el modelo para asegurar que la disociación celular no afecte negativamente a las células.

Results

Este protocolo describe la generación de un modelo basado en organoides del epitelio prostático del ratón que recapitula el tipo celular y la expresión transcripcional del compartimento epitelial del tejido nativo. Este modelo se genera utilizando organoides 3D de células madre adultas generados a partir de tejido prostático de ratón adulto. Estas culturas organoides se mantienen luego en cultivo y se transmiten semanalmente. Para el modelo basado en organoides, el primer paso en el flujo de trabajo (Figura 1A) comienza usando organoides 3D de hace 7 días. Este periodo de tiempo es necesario para que alcancen un tamaño y densidad celular adecuados para su posterior siembra sobre una superficie 2D. Tras el paso, pequeños fragmentos de organoides (Figura 1B, Día 0) se sembraron en ECM y se dejaron crecer. Con el tiempo, crecen hasta convertirse en grandes estructuras esféricas con un lumen interior definido para el día 7 (Figura 1B). Tras disociar los organoides de 7 días en células individuales, las células se siembraron sobre una placa tratada con cultivo de tejido (Figura 1C, Día 0) utilizando el mismo medio de cultivo que para los cultivos organoides 3D (1nM DHT) para formar una monocapa. Para el primer día, las células adheridas habían comenzado a proliferar. En los días siguientes, la monocapa se expandió y alcanzó la confluencia entre el día 3 y el día 5, observada por microscopía de campo claro (Figura 1C). Para caracterizar los cambios morfológicos a lo largo del tiempo y monitorizar el momento en que el modelo basado en organoides alcanza la confluencia, teñimos la membrana plasmática con CellMask y realizamos imágenes de fluorescencia en múltiples momentos temporales (Figura 1D).

Dado que la señalización del receptor de andrógenos (AR) es un regulador clave de la diferenciación celular en la próstata, y se demostró que la modulación de la concentración de testosterona (o DHT) en el medio de cultivo organoide dirigió la diferenciación de las células madre en células basales o^luminales, ajustamos los niveles de DHT en el medio de cultivo para promover el enriquecimiento de células luminales (DHT 10 nM) o basales (sin DHT, Control; Método1, Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2 (B-F), no se observaron diferencias importantes en el crecimiento o confluencia celular. Como era de esperar, en la condición de control (medio de cultivo organoide sin DHT), la mayoría de las células expresaron citoqueratina 5 (KRT5), un marcador de células madre basales prostáticas (Figura 2B,E). En contraste, solo unas pocas células expresaron niveles bajos de CD24a, un marcador de células prostáticas luminales diferenciadas (Figuras 2B,F).

La suplementación con 1 nM de DHT, como describimos^{anteriormente, 32}, resultó en una población mixta que contenía tanto células basales como luminales. Sin embargo, la expresión de CD24a se mantuvo baja, lo que indica una diferenciación incompleta en células luminales (Figura 2C,F³²). Aumentar la DHT a 10 nM promovió la diferenciación completa de las células luminales mientras se mantenían algunas células basales tras 7 días de cultivo (Figura 2D-F). La diferenciación de los modelos basados en organoides también puede evaluarse mediante microscopía de campo claro. Aunque las diferencias entre las condiciones no son muy claras cuando las células son escasas (Día 0 - 5, Figura 1C, Figura Suplementaria 1A), la morfología y apariencia celular se vuelven claras y notables entre las tres condiciones de cultivo mediante microscopía de campo claro en el Día 7 (Figura 1C, Figura Suplementaria 1A,B). En ausencia de DHT, las células aparecían más planas y de forma más irregular, mientras que en DHT de 10 nM, las células estaban compactas con una disposición poligonal, que se asemejaba a una morfología de adoquines (Figura suplementaria 1B).

Cabe destacar que los cultivos organoides 3D también experimentaron cambios morfológicos al ser cultivados a diferentes concentraciones de DHT. Específicamente, se observó un claro aumento dependiente de la dosis en el tamaño de los organoides, formándose los organoides más grandes en presencia de 10 nM de DHT (Figura 1B, Figura suplementaria 2A,B). Estos resultados indican que la vía AR es crítica no solo para la diferenciación celular, sino también para modular la dinámica de crecimiento de los organoides prostáticos de ratón.

Para evaluar la integridad epitelial y la polarización de los modelos, realizamos mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en el modelo basado en organoides cultivado con DHT nula o 10 nM. Los valores de TEER aumentaron con el tiempo en ambas condiciones, pero fueron sustancialmente más altos en presencia de 10 nM de DHT (Figura 3A), lo que indica una función mejorada de la barrera epitelial. Estos resultados se confirmaron mediante la tinción con faloidina de filamentos de actina, que normalmente se organizan en un anillo apical en las uniones célula-célula de las células epiteliales prostáticas luminales. En la condición DHT de 10 nM, el anillo de actina apareció más definido en comparación con la condición de control, consistente con un aumento de la polaridad celular y la organización epitelial (Figura 3B). Además, la inmunotinción para zonula ocludens 1 (ZO-1) reveló un aumento de las uniones estrechas en la condición de DHT de 10 nM (Figura 3C), reforzando aún más la integridad de la barrera epitelial y la diferenciación hacia un fenotipo luminal. Las proyecciones ortogonales revelan que los organoides cultivados con DHT de 10 nM presentan una polaridad epitelial bien definida (Figura suplementaria 3A). Las células basales KRT5⁺ se encuentran en la parte inferior, y las células luminales CD24a⁺ se distribuyen a lo largo de la capa epitelial, mostrando una mayor intensidad de tinción hacia el lado apical. Esta arquitectura es similar a la observada en el tejido prostático de ratón (Figura suplementaria 3B). Cabe destacar que los datos del Atlas de Proteínas Humanas muestran que estos marcadores tienen una localización comparable en el tejido prostático humano, con células basales KRT5⁺ bajo una capa luminal CD24a⁺ (Figura suplementaria 3C)³³. En cambio, las células cultivadas bajo condiciones controladas o DHT de 1 nM no muestran una separación espacial clara entre marcadores basales y luminales, y la altura de la célula fue mucho menor que en la condición de 10 nM (Figura suplementaria 3A). Esto indica que la suplementación con DHT de 10 nM promueve la diferenciación y polarización epitelial en el modelo 2D de una manera comparable al epitelio prostático nativo. Dado que el modelo basado en organoides cultivado con DHT de 10 nM se asemeja mucho al epitelio prostático nativo del ratón (Figura 2D, Figura suplementaria 3A,B), sirve como una plataforma relevante para investigar las interacciones huésped-patógeno. Para demostrar la aplicabilidad del modelo, usamos infecciones con UPEC, específicamente la cepa UTI89, una de las cepas UPEC más utilizadas en el campo genitourinario, como ejemplo. Como se muestra en la Figura 4A, las bacterias se cultivaron en caldo LB durante 24 horas (como se describe en el Método 4) y se incubaron con las células durante una hora. Las bacterias extracelulares fueron eliminadas con gentamicina para cuantificar la invasión y la replicación intracelular. Tras la infección del modelo basado en organoides, la UPEC se adhirió a las células epiteliales en gran número (0 hpi; Figura 4B, panel izquierdo; Figura 4C). Luego, y tras el tratamiento con gentamicina (1 hpi), el número de células positivas para UPEC disminuyó significativamente, debido a la muerte de bacterias extracelulares (Figura 4B, panel central; Figura 4C). A 24 hpi, el número de células infectadas permaneció sin cambios (Figura 4C), sin embargo, la microscopía confocal mostró que las bacterias intracelulares continuaron replicándose, formando estructuras similares a las descritas previamente en el epitelio de la vejiga (Figura 4B, panel derecho). Las células infectadas fueron identificadas por fluorescencia de mCherry utilizando controles no infectados (ingenuos) como referencia, tras la exclusión de residuos y dobletes (Figura suplementaria 4).

Figura 1: Visión general del flujo de trabajo y la evolución morfológica de los organoides prostáticos y los modelos basados en organoides a lo largo del tiempo. (A) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental (Método 1). (B) Imágenes de campo claro que muestran el desarrollo morfológico de los organoides prostáticos complementadas con DHT de 1 nM, capturadas en los días 0, 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (C) Imágenes de campo claro del modelo basado en organoides complementadas con DHT de 1 nM, capturadas en los días 0, 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (D) Imágenes representativas de microscopía de inmunofluorescencia del modelo basado en organoides suplementadas con 1 nM de DHT y teñidas con CellMask (rojo), en los días 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Los núcleos se contratincionaron usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3) Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: La DHT modula la diferenciación de linaje en el modelo basado en organoides. (A) Representación esquemática de las diferentes condiciones utilizadas para la diferenciación. (B-D) Imágenes microscopías de inmunofluorescencia representativas del modelo basado en organoides cultivadas durante 7 días en ausencia (Ctrl) o presencia de (C) 1 nM o (D) 10 nM de DHT. Las imágenes se capturaron en los días 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Los modelos basados en organoides se teñieron para CD24a (marcador celular luminal, verde) y KRT5 (marcador basal celular, magenta). Los núcleos se contratincionaron usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 4). (E,F) Cuantificación de imagen de células (E) KRT5⁺ y (F) CD24a⁺ en el modelo basado en organoides cultivadas sin DHT (Ctrl), 1nM o 10nM. Los datos se muestran como porcentaje de celdas positivas por campo de visión. Prueba estadística: ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: El modelo basado en organoides diferenciado con 10 nM de DHT muestra una mayor polarización celular en comparación con el control. (A) Análisis TEER del modelo basado en organoides cultivado durante 7 días en ausencia (Ctrl; rosa) y presencia de DHT (10 nM; verde). Las barras de error representan la SD (n = 3). Prueba estadística: ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. (B,C) Imágenes representativas de microscopía de inmunofluorescencia del modelo basado en organoides cultivadas durante 7 días sin (Ctrl; arriba) o con 10 nM de DHT (abajo) y teñidas para (B) F-actin (rojo) y (C) ZO-1 (rojo). Los núcleos se contratincionaron usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3) Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Análisis de la dinámica de la infección en el modelo basado en organoides. (A) Representación esquemática del protocolo de infección (sección 4). (B) Imágenes microscopíacas de inmunofluorescencia representativas que muestran el modelo organoide infectado a 0, 1 y 24 horas después de la infección (hpi; de izquierda a derecha). UPEC se visualiza en rojo. Los núcleos se contratincionaron usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3). (C) Análisis de citometría de flujo de células UPEC-positivas (células infectadas positivas a mCherry) a 0, 1 y 24 hpi. La estrategia de gating se muestra en la Figura Suplementaria 4. Las barras de error representan el SEM (n = 3). Prueba estadística: ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Evolución morfológica del modelo basado en organoides a lo largo del tiempo. (A,B) Imágenes de campo claro del modelo basado en organoides en la ausencia (A) (Ctrl) y (B) presencia de 10 nM DHT, capturadas en los días 0, 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Barra de escala: 200 μm. (n = 3) Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: La concentración de DHT afecta al crecimiento de organoides prostáticos en 3D. (A) Imágenes de campo claro del modelo basado en organoides en ausencia (Ctrl; arriba) y presencia de 10 nM DHT (abajo), imágenes en los días 0, 1, 3, 5 y 7 (de izquierda a derecha). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (B) Cuantificación del tamaño de organoide 3D en el día 7 cultivado bajo las tres condiciones diferentes: sin DHT (Ctrl; rosa), 1 nM DHT (morado) y 10 nM DHT (verde). Prueba estadística: ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey (n = 3). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Caracterización de la morfología de organoides prostáticos y polaridad epitelial. (A) Proyecciones ortogonales de pilas z confocales que ilustran la organización epitelial y la polaridad apical-basal bajo diferentes concentraciones de DHT (Ctrl, 1 nM y 10 nM DHT). Las células basales se tintaron para KRT5 (magenta) y las células luminales para CD24a (verde). Barra de escala: 50 μm.(B) Tinción por inmunofluorescencia del tejido prostático de ratón incrustado en OCT mostrando marcadores epiteliales basales (KRT5, magenta) y luminales (CD24a, verde). Los núcleos se contrateñen con DAPI (azul). Barra de escala: 50 μm. En resumen, los fragmentos de tejido de ratón se fijaron con un 4% de PFA, se deshidrataron durante la noche con 30% de sacarosa y se incrustaron^{en OCT con 32}. Las láminas se rehidrataron en PBS durante 10 minutos y se inmunetizaron tras la sección 3. (C) Análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas CD24a y KRT5 en tejido prostático humano (el Panel C ha sido extraído de la Base de Datos del Atlas de Proteínas Humanas (versión 25.0; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Estrategia de citometría de flujo para identificar células infectadas. Las celdas se configuraron inicialmente en función de la altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a la altura de dispersión directa (FSC-H) para excluir los residuos, seguidas de la compuerta en SSC-H frente al área de dispersión lateral (SSC-A) para seleccionar celdas individuales. Posteriormente, se identificaron células mCherry-positivas (infectadas) usando Counts frente a fluorescencia PE-Texas Red-H (histograma). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Diversas enfermedades pueden afectar a la próstata, incluyendo hiperplasia prostática benigna, prostatitis y cáncer de próstata. Estas enfermedades son muy prevalentes y afectan significativamente la calidad de vida de los^{pacientes 2}. A pesar de su impacto significativo en la atención sanitaria, nuestra comprensión de estas enfermedades, especialmente de los mecanismos subyacentes y las respuestas del huésped en condiciones no cancerosas, sigue siendo limitada. Esto se debe en gran parte a la falta de modelos experimentales fisiológicamente relevantes. Por un lado, las líneas celulares inmortalizadas no capturan la complejidad ni el estado de diferenciación del epitelio prostático normal. Por otro lado, los modelos animales, principalmente los roedores, plantean preocupaciones éticas y no son rentables. Un enfoque alternativo es el uso de células primarias humanas o explantaciones tisulares derivadas del paciente. Sin embargo, la limitada disponibilidad de tejido prostático fresco limita su aplicación generalizada. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de otros sistemas in vitro que sean fisiológicamente relevantes, fáciles de usar y manejables experimentalmente. En este contexto, la tecnología de organoides de células madre adultas ha transformado la modelización de enfermedades. Estas culturas 3D tienen la capacidad de autoorganizarse, preservando la identidad epitelial y la diversidad celular^epitelial 23,34,35,36,37,38. Aunque su arquitectura 3D ha permitido aplicaciones en investigación oncológica, pruebas de fármacos y medicina^{regenerativa 23,34,35,36,37,38,39,40,41}, su estructura cerrada, con la superficie apical orientada hacia dentro, plantea desafíos prácticos para el acceso experimental, especialmente en el caso de in vitro modelos de infección. Los organoides apical-out abordan esta limitación invirtiendo la polaridad epitelial, exponiendo la superficie apical para estudios de infección^{directa 27,28}. Sin embargo, su eficacia como modelo de infección puede estar limitada por la variabilidad en su tamaño, la exposición desigual a patógenos y la fragilidad durante la infección a largo plazo.

Aquí presentamos un protocolo para generar un modelo de próstata de ratón basado en organoides que recapitula la composición celular epitelial y el perfil transcripcional del epitelio murino nativo, proporcionando al mismo tiempo un fácil acceso a la superficie apical. Optimizado en nuestro trabajo^{previo, 32}, este modelo permite un control preciso sobre variables experimentales clave, incluyendo la densidad de siembra, la exposición uniforme a estímulos, las proporciones definidas bacterias-células (MOI) y parámetros de imagen de alto rendimiento que a menudo son difíciles de estandarizar en sistemas organoides 3D convencionales.

En línea con el principio 3R (Reemplazar, Reducir, Refinar) para la experimentación^{animal 42}, los organoides utilizados como fuente de células primarias para este modelo derivan de ratones ingenuos de tipo salvaje que fueron sacrificados para fines no relacionados, como la cría. La próstata se obtiene mediante donaciones de instalaciones veterinarias cercanas, reduciendo así la necesidad de sacrificar animales adicionales específicamente para este protocolo.

La diferenciación robusta y fiable de organoides y modelos basados en organoides es fundamental para replicar fielmente la composición celular y las características funcionales del tejido nativo, asegurando su relevancia como modelos in vitro. La diferenciación celular dentro de los organoides está fuertemente influenciada por la composición específica del medio de cultivo, incluyendo las concentraciones precisas de factores de crecimiento y agentes farmacológicos (es decir, inhibidores de fármacos). Manipular estos factores permite una diferenciación directa hacia linajes celulares específicos, como se demuestra en varios sistemas organoides. Por ejemplo, en organoides intestinales, la eliminación de la WNT promueve la diferenciación de enterocitos, que puede potenciarse aún más mediante el interferón gamma (revisado en³⁸). La diferenciación en células caliciformes puede lograrse mediante la eliminación de inhibidores de p38 y nicotinamida o mediante inhibición de Notch mediante DAPT/DBZ (revisado en³⁸). También se ha demostrado que IGF-1 y FGF-2 apoyan la expansión a largo plazo de cultivos enriquecidos con células^{secretorias 43}. Además, la IL-22 potencia la diferenciación de las células Paneth, y las células enteroendocrinas surgen mediante la inhibición de vías como Notch y BMP³⁸. De manera similar, los organoides gástricos y las monocapas basadas en organoides muestran diferenciación hacia las células fosetais cuando se extrae WNT del medio de cultivo, mientras que añadir nicotinamida al medio dirige las células hacia un fenotipo de glándula (cuello y células ^principales)31,44,45.

En la próstata, el receptor de andrógenos (RA) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis^tisular 46,47,48,49. La testosterona, producida por las células de Leydig en los testículos, se convierte en DHT en las células epiteliales prostáticas mediante la 5α-reductasa. La DHT activa la AR, que se dimeriza, se transloca al núcleo y se une a los elementos de respuesta andrógeno para regular los genes implicados en la diferenciación celular y la^{homeostasis 50}. Estudios previos han demostrado que la suplementación de 1 nM en organoides prostáticos de ratón 3D es suficiente para lograr la diferenciación celular en células^{luminales 51}. Otros también han demostrado que la suplementación con vitamina D (específicamente 1,25-dihidroxivitamina D) promovió el crecimiento de organoides prostáticos humanos y aceleró la diferenciación al inhibir la actividad canónica de WNT y suprimir el miembro de la familia WNT^{DKK3 52}. Sin embargo, en estos estudios solo se utilizaron organoides 3D. Nuestro trabajo^{previo, 32} y otros⁵³, demostraron que la suplementación con 10 nM de DHT en organoides 3D no es suficiente para lograr una diferenciación completa. En cambio, usar el modelo 2D descrito aquí, es decir, sembrar las células en 2D con 10 nM de DHT, es suficiente para diferenciar el modelo a un estado similar al tejido^{nativo 32}. Para entender esta diferencia entre los modelos 3D y 2D, será necesario más trabajo, pero podría explicarse por las diferentes señales mecano-físicas entre los sistemas o por la presencia de ECM que contienen factores de crecimiento en el modelo 3D.

En el tejido prostático adulto se pueden encontrar tres tipos principales de células epiteliales: células luminales, basales y neuroendocrinas. De estos, solo las células luminales y basales están presentes en todos los modelos organoides publicados hasta ahora. La ausencia de las raras células neuroendocrinas sugiere que los protocolos organoides actuales podrían no estar completamente optimizados. Entre las células luminales y basales, una población de células intermedias prostáticas también ha sido descrita como un estado de transición que expresa tanto marcadores luminales (es decir, CD24a) como basales (es decir, SCA-1)^18,51. Esta subpoblación se encuentra a menudo en la región periuretral de la próstata, por lo que se les denomina frecuentemente células luminales^{periuretrales 54}. Aunque esto se ha reportado en algunos sistemas organoides 3D bajo condiciones específicas de diferenciación o^{señalización 53,55}, no observamos una separación clara entre las células luminales e intermedias en nuestro^{sistema 32}. Una posible explicación es que durante la generación de organoides 3D no distinguimos entre diferentes regiones prostáticas y, para evitar la contaminación con células uretrales, eliminamos el tejido directamente adyacente a la conexión uretra-próstata. Por lo tanto, los cultivos organoides derivados de regiones proximales o adyacentes a la uretra probablemente sean más capaces de generar células intermedias.

La integridad de la barrera se considera una característica distintiva de un epitelio maduro y diferenciado, proporcionando una barrera protectora contra toxinas y microbios que lleguen al tejido subyacente. Las uniones estrechas (ricas en proteínas ZO-1⁵⁶) desempeñan un papel vital en la regulación de la permeabilidad paracelular y en el mantenimiento de la integridad de la barrera^{epitelial 57}. A medida que las células epiteliales se diferencian, la maduración de estas uniones intercelulares refuerza la^{barrera 58}. Por tanto, evaluar la integridad de la barrera es una lectura importante para un modelo epitelial in vitro . En este protocolo, mostramos tres métodos complementarios para evaluar la integridad de la barrera: medición TEER, inmunotinción con ZO-1 y tinción con F-actina. Aunque los tres métodos evalúan eficazmente la integridad de las barreras, difieren significativamente en el equipamiento y los recursos necesarios. Las mediciones TEER proporcionan un valor cuantitativo que puede rastrearse a lo largo del tiempo, ofreciendo una visión dinámica de la función de la barrera; sin embargo, esta técnica requiere hardware y software especializados que pueden no estar disponibles en todos los laboratorios. En cambio, la tinción con anticuerpos anti-ZO-1 o falloidina es mucho más manejable en cuanto a tiempo y coste (por ejemplo, la tinción con faloidina puede realizarse en unas 3 horas - sección 3).

Este protocolo describe cómo utilizar organoides prostáticos de ratón 3D para generar un modelo 2D accesible apicalmente. Varias revisiones han destacado las ventajas y desventajas de los organoides y los sistemas basados en organoides en el estudio de las interacciones huésped-patógeno 23,36,59. En los estudios de infección, es fundamental considerar el lugar natural de interacción entre los patógenos y el epitelio del huésped. En la próstata, las células luminales suelen ser el primer punto de contacto y, por tanto, el acceso a la superficie apical es esencial para modelar con precisión la dinámica de la infección. En los organoides prostáticos 3D convencionales, la superficie apical está orientada hacia la luz organoide y no es directamente accesible. En estos, la exposición a patógenos puede lograrse mediante microinyección, que es de bajo rendimiento y técnicamente desafiante, o mediante la alteración de los organoides, lo que compromete la polaridad epitelial y resulta en sitios de interacción^{no fisiológicos 23}. En cambio, el modelo 2D accesible apicalmente presentado en este protocolo ofrece acceso directo a la superficie luminal. Esto permite una exposición controlada y fisiológicamente relevante a patógenos, una regulación precisa del MOI y compatibilidad con plataformas de imagen de alta capacidad y alta resolución o de células vivas. Aquí mostramos el uso de este modelo como sistema de infección in vitro utilizando la cepa de referencia UPEC UTI89, una referencia ampliamente utilizada que representa a las principales especies bacterianas responsables de la prostatitis^{bacteriana 9}. Sin embargo, este modelo puede adaptarse fácilmente para estudiar otros patógenos prostáticos como Enterococcus faecalis o Pseudomonas aeruginosa, lo que lo convierte en una plataforma versátil para la biología de la infección en la próstata.

La disociación de organoides 3D es un paso fundamental para el establecimiento exitoso del modelo basado en organoides. No disociar completamente los organoides 3D, que resulta en fragmentos grandes, puede afectar la adhesión celular a la superficie del cultivo, mientras que la exposición prolongada al reactivo de disociación durante más de 30 minutos reduce la viabilidad celular. Además, mantener un intervalo de paso constante de aproximadamente siete días antes de la disociación y la siembra es esencial, ya que el estado fisiológico de los organoides influye fuertemente en su capacidad para adherirse y diferenciarse. Otra variable crítica que influye en el desarrollo exitoso del modelo basado en organoides prostáticos es la densidad de siembra. La concentración de siembra utilizada aquí se optimizó para la diferenciación durante 7 días. Aumentar o disminuir esta concentración probablemente resultaría en diferentes tiempos de diferenciación. Además, una resuspensión celular inadecuada antes del chapado puede provocar una distribución desigual de las células entre pozos, resultando en densidades celulares variables que, a su vez, influyen tanto en la proliferación como en la diferenciación. Además, como en otros modelos organoides, diferentes lotes de ECM o factores de crecimiento pueden influir en la capacidad de crecimiento y diferenciación. Por lo tanto, es importante verificar que el modelo basado en organoides mantenga un fenotipo consistente tras cualquier cambio en el número de lote o lote del factor de crecimiento.

Una vez establecido el modelo basado en organoides, los parámetros de infección deben optimizarse cuidadosamente. A menudo se requieren diferentes MOI para alcanzar niveles de infección robustos y reproducibles dependiendo de la cepa bacteriana y del resultado elegido. Para la cepa UPEC UTI89 (usada aquí y en^{la 32}) y para varios aislados de^{prostatitis 32}, un MOI de 100 fue suficiente para obtener un número fiable de células infectadas en los tiempos de adhesión, invasión y replicación. Sin embargo, si la incubación de células con bacterias debe extenderse más allá de 1 hora, se debe utilizar un MOI más bajo para evitar el sobrecrecimiento extracelular de UPEC en el medio y la posterior toxicidad para las células. En este protocolo, la infección se evaluó mediante dos métodos: I) citometría de flujo para cuantificar la proporción de células infectadas, y II) microscopía confocal para evaluar la localización bacteriana. Sin embargo, también se pueden emplear otros enfoques, como ensayos unitarios formadores de colonias para medir la bacteria³², inmunotinción para detectar el huésped o marcadores^{bacterianos 32}, o análisis transcriptómicos para perfilar las respuestas del huésped.

Aunque el modelo basado en organoides prostáticos proporciona un sistema fisiológicamente relevante, deben considerarse varias limitaciones al aplicarlo a la investigación de infecciones. Una limitación importante de este modelo es la ausencia de células inmunitarias residentes o periféricas, lo que limita su capacidad para capturar completamente la respuesta del huésped a la infección (por ejemplo, reclutamiento de células inmunitarias o eliminación mediada por el sistema inmune). Otros componentes esenciales que faltan en el modelo incluyen la vasculatura, el estroma y los nervios, todos los cuales pueden influir en las interacciones huésped-patógeno. Incorporar tipos celulares adicionales, como fibroblastos estromales, células inmunitarias y células endoteliales, ayudaría a recrear un microambiente tisular más completo. Sistemas avanzados de cocultivo o plataformas microfluídicas de órganos en chip podrían apoyar aún más interacciones celulares complejas y permitir estudios dinámicos de infecciones. Además, al utilizar organoides derivados de modelos animales, deben considerarse diferencias específicas de cada especie, especialmente al estudiar patógenos específicos de humanos. Aunque nuestro trabajo^{previo 32} mostró que los hallazgos del modelo de organoides próstáticos murinos podían reproducirse en tejido humano, la variación interespecie en la regulación génica, la expresión de receptores o las respuestas hormonales puede limitar aún la relevancia directa del modelo para la fisiología humana. Incorporar organoides de origen humano, cuando sea posible, aumentaría el valor traslacional al permitir el estudio de las interacciones y respuestas de patógenos específicos del ser humano. Aunque estas incorporaciones podrían fortalecer los modelos basados en organoides como herramientas poderosas para estudiar la biología prostática, la patogénesis de infecciones y el desarrollo terapéutico, el modelo puramente epitelial que presentamos ofrece un sistema simplificado y compartimentado. Esto permite una investigación enfocada de las interacciones epitelial específica entre huésped y patógeno sin interferencia de otros componentes tisulares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 48 pozos	Sarstedt	83.3923	Forma del fondo: plano
5&alfa;-Androstán-17β-OL-3-Una dihidrotestosterona	Sigma-Aldrich	A8380	Se designó como DHT. Solución original 10 y mu; M en etanol 100%
Portaobjetos PET de 8 pozos con 40 electrodos por pozo y nbsp;	Biofísica Aplicada	8W10E+	Diapositivas utilizadas para mediciones TEER
Placas de 96 pozos	Sarstedt	82.1583	Forma inferior: cónica
Advance Dulbecco' s Eagle Medium/F12  modificado	Thermo Fisher Scientific	12634028	Se designó como adDMEM/F12+/+ cuando se complementó con 10 mmol L y menos; 1 HEPES y 1x GlutaMAX
Ampicilina	Roth	K029.2	Stock de concentración 100 mg/mL
Anticuerpo anti-CD24a	Proteintech	10600-1-AP	Anticuerpos primarios; dilución 1:100 en 1x PBS 1%BSA
Anti-Citoqueratina 5 Alexa Fluor 647 anticuerpo	Abcam	ab193895	Anticuerpos primarios; dilución 1:100 en 1x PBS 1%BSA
anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  anticuerpo	Invitrogen	A21441	Anticuerpos secundarios; dilución 1:500 en 1x PBS 1%BSA
Anticuerpo policlonal anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticuerpos primarios; dilución 1:750 en 1x PBS 1%BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V, NZ-Origin	Roth	8076.3	Componente del buffer de bloqueo usado al 1% en 1x PBS
pozos de micro y diapositiva 8	Ibidi	80806	Modificación de la superficie: ibiTreat
Tubo cónico (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	El fondo plano es mejor para pellets pequeños.
Etilendediamina, tetraacetato 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Casero: 93,0 g en 400 mL de H2O, ajustar el pH a 8,0, ajustar el volumen con H2O hasta 500 mL; 0,5 M EDTA; Componente del buffer de citómetro de flujo
Solución salina equilibrada de Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
Microscopio ECHO Revolve	ECHO
ECIS  Z-Theta -  Sistema de análisis de celdas basado en impedancias	Biofísica Aplicada	ECIS  Z-Theta	El sistema incluye: estación de 16 y/o 96 pozos; módulo de control externo; PC portátil; software de control, adquisición y visualización ECIS; módulo de campo elevado para migración y electroporación automática de celdas
Suero Fetal Bovino (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Componente del buffer de citómetro de flujo; componente del medio de cultivo de la línea celular 293T; componente del medio de cultivo HEK293T línea celular
Flash Phalloidin Red 594	Bioleyenda	424203	Dilución 1:250 en 1x PBS 1%BSA
Buffer de citómetro de flujo			1 PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicina y Gentamicina;	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	Dipéptido L-alanil-L-glutamina, componente de adDMEM/F12+/+
Medidor de densidad celular Harvard Biochrom Ultrospec 10	Fisher Scientific	10704417
Tinte rojo profundo HCS CellMask	Tecnologías de la vida	H32721	Dilución 1:1.000 en 1x PBS 1%BSA
HEK293T línea celular transfectada con vector de expresión Noggin-Fc en ratón	Línea celular del Prof. Dr. Clevers		Se usaba para producir Noggin; medio de cultivo: 500 ml DMEM, glucosa alta, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 ml FBS; Farin et al. Gastroenterología 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Componente de adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Tecnologías de la vida	H3570	Dilución 1:5.000 en 1x PBS
Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) y nbsp;	Peprotech	AF-100-15	Stock de concentración 500 y micro; g/mL
Bucles de inoculación	Sarstedt	86.1567.010
Tubos de inoculación	Sarstedt	62.515.006
Microscopio confocal Leica Stellaris 5	Leica
Caldo Luria Bertani (caldo LB)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Matriz extracelular (ECM)
N-acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Material de concentración 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Citómetro de flujo
Paraformaldehído (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	se usó al 4% en 1x PBS, 4% de sacarosa
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-micro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	Inhibidor de RhoA/ROCK; Stock de concentración 10 mM
R-spodin1 CM
Línea celular R-Spondin1 que expresa 293T	Sigma Aldrich	SCC111	Se utilizó para producir R-spo1 CM; medio de cultivo: 500 ml DMEM, alta glucosa, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966) + 60 ml FBS
TGF y beta; i (A-83-01)	Tocris	2939	Inhibidor ALK4/5/7; Stock de concentración 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	se usó un 0,5% diluido en PBS 1x
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028	Agente enzimático de disociación celular para digerir organoides prostáticos de ratón en 3D
Cepa uropatógena Escherichia coli cepa UTI89	Cepa WT del Prof. Dr. Dobrindt		transformado con pFPV-mCherry (addgene #20956)