Aislamiento estandarizado y cebado de citocinas de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea murina para mejorar la inmunomodulación

Summary

Aquí demostramos un protocolo para aislar células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea del ratón junto con un método de cebado de citocinas para amplificar el efecto inmunosupresor de las BMSC sobre las células inmunitarias.

Abstract

Las células estromales mesenquimales (MSC) poseen una fuerte función regenerativa e inmunomoduladora. Estas propiedades convierten a los MSC en potentes fármacos celulares para tratar múltiples trastornos inmunitarios. La médula ósea es la fuente principal y más utilizada de las CMS. Los estudios mecanicistas preclínicos con modelos murinos son cruciales para conocer las estrategias óptimas de administración de fármacos para las CSM en ensayos clínicos en humanos. Por ello, la estandarización del proceso de fabricación de las MSC murinas también es fundamental para obtener mejores resultados terapéuticos. Un objetivo central de este protocolo es demostrar cómo el cebado controlado por interferón-gamma (IFN-γ) potencia las propiedades inmunosupresorias intrínsecas de los BMSC. Describimos la generación de medios condicionados (CM) a partir de BMSC no tratados o prelicenciados por IFN-γ y evaluamos su actividad biológica utilizando macrófagos peritoneales primarios. A través de ELISA y perfilado citométrico de flujo, el protocolo detalla cómo el secretoma derivado de BMSC —especialmente cuando está preparado con IFN-γ— impulsa la polarización antiinflamatoria de los macrófagos caracterizada por una producción elevada de IL-10 y marcadores superficiales asociados a M2. En conjunto, este protocolo establece un marco unificado para producir BMSC murinos funcionalmente consistentes y para evaluar su potencia inmunomoduladora. Al reducir la variabilidad técnica y proporcionar claridad visual y procedimental, favorece una mayor reproducibilidad en la investigación preclínica de MSC y facilita estrategias optimizadas de despliegue de MSC para estudios traslacionales.

Introduction

Las células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMSC) tienen aplicaciones generalizadas tanto en estudios preclínicos como clínicos. Su baja inmunogenicidad, fácil accesibilidad y capacidad de diferenciación multilineal hacen que los BMSC sean candidatos prometedores para su uso en entornos clínicos como fármacos ^{celulares 1,2,3}. Sus propiedades inmunosupresoras y regenerativas han sido ampliamente explotadas en estudios clínicos para tratar trastornos inflamatorios como la enfermedad del injerto contra huésped (GVHD)⁴,^{sepsis 5} y enfermedad inflamatoria intestinal (EII⁾⁶. El nicho estromalical de la médula ósea comprende una población celular estromalizada heterogénea. No obstante, todos los MSC cumplen con los criterios definidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), que incluyen: adherencia plástica, expresión superficial de receptores — CD73, CD90 y CD105 en humanos, y CD29, CD44 y CD90 en ratones — sin expresión de marcadores hematopoyéticos o endoteliales — CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, y la capacidad para la formación adipogénica, condrogénica, o diferenciación^{osteogénica 7}.

Las BMSC siguen funcionando mediante la liberación de factores paracrinos conocidos colectivamente como el secretoma, que incluye citocinas, quimioquinas, factores de crecimiento, vesículas extracelulares y diversas otras moléculas solubles y dependientes del^{contacto 8,9}. El secretoma de las CMS modula el nicho interactuando con elementos del sistema inmunitario innato de manera^{bidireccional 10}. Los factores liberados durante las interacciones entre las CMS y los macrófagos pueden desplazar los macrófagos hacia un fenotipo proinflamatorio^{o antiinflamatorio 11,12}. Por el contrario, el estado funcional de las CMM también está regulado por las células inmunitarias locales —especialmente los macrófagos— mediante mecanismos de retroalimentación¹¹. Esta diafonía entre MSC y macrófagos es indispensable para la funcionalidad inmunosupresora de las MSC. Las MSC transferidas adoptivamente solo reducen la inflamación tisular cuando hay macrófagos presentes, como se observa en modelos murinos con colitis. En cambio, la interacción de los CMEM con linfocitos B o T en ausencia de macrófagos es insuficiente para ejercer sus efectos^{terapéuticos 13}.

El primer ensayo clínico de fase III utilizando BMSC alogénicos fue realizado por Osiris Therapeutics en Estados Unidos para el tratamiento de la GVHD (NCT00366145)1 refractaria a esteroides^. Desde entonces, se han realizado numerosos estudios preclínicos y clínicos, aunque el éxito de los ensayos clínicos no ha cumplido con las expectativas basadas en los resultados preclínicos. Para mejorar la tasa de éxito de los ensayos clínicos basados en MSC, es esencial optimizar las estrategias de implantación de fármacos. Comprender la vía óptima de administración, la dosis de las células terapéuticas y el estado fisiológico de las células en el punto de atención es fundamental. Por ejemplo, en un modelo murino de colitis in vivo , estudios han demostrado que las CMEM criopreservadas o el parto intravenoso son métodos de administración^{subóptimos 14}.

Se han estudiado ampliamente diferentes enfoques, como la pre-licencia de citocinas, la modificación genética o el preacondicionamiento hipóxico, para mejorar la persistencia in vivo y la utilidad terapéutica de las^{MSC 15}. En el modelo de isquemia murina de la extremidad posterior, el preacondicionamiento de la hipoxia (2%_O2) mejoró la capacidad de proliferación y migración de las MSC mediante un aumento de la expresión de la proteína de choque térmico, la proteína regulada por glucosa de 78 kD (GRP78)¹⁶. La pre-licencia de IL-1β (Interleucina-1 beta) aumenta la capacidad de los MSC para emplear neutrófilos, monocitos, linfocitos y eosinófilos¹⁷. Tras la administración in vivo, las MSC se exponen a las células T y NK activadas de IFNγ, lo que potencia la producción de indolelamina 2,3-dioxigenasa (IDO) por las^{MSCs 18}. La IDO es un componente esencial en el secretoma de las MSC, que reduce la tasa de proliferación de células T. Curiosamente, la capacidad inmunosupresora de las CMM se reduce cuando se cocultivan con linfocitos T derivados de^{ratones de IFNγ-/- 19}. Los estudios han identificado que la prelicencia de IFN-γ reduce la tasa de apoptosis mediada por células T en las MSCs^{criopreservadas 13,20}. El cebado IFNγ mejora el resultado terapéutico de los^{BMSC 13}. Toda esta evidencia indica en conjunto el papel indispensable del IFNγ en la producción de CMM inmunosupresores más potentes.

Para determinar la modalidad de administración más eficaz de los MSC, se han utilizado ampliamente modelos animales por su accesibilidad ética. Para reducir la variabilidad en los resultados preclínicos, es fundamental establecer un método optimizado para el proceso de fabricación de los MSC que garantice alto rendimiento, viabilidad celular y consistencia a lo largo del^{tiempo 21}. El paso de los MSC es una variable importante que puede generar diferentes resultados terapéuticos. Durante el cultivo in vitro , el paso puede regular la caracterización y potencia de las CMS, y tras un cierto número de conductos, las células se vuelven^{senescentes 22}. Por ello, en cualquier estudio clínico o preclínico, es fundamental ser coherente con el uso del número de pasaje del MSC. De manera similar, la consistencia con un protocolo específico para el aislamiento de las MSC también es un factor clave para lograr la reproducibilidad en el resultado del uso de las MSC. Entre muchos enfoques, la clasificación celular basada en^{anticuerpos 23}, el método^{de selección negativa 24} y la digestión^{enzimática 25} son métodos populares de aislamiento de las MSC. Sin embargo, la aplicabilidad de estos métodos depende de la fuente, ya que un uso inadecuado reduce el rendimiento, la potencia y la capacidad de diferenciación trilineal.

Aquí presentamos un protocolo estandarizado para el aislamiento y caracterización de BMSC, enfatizando el número de pasajes preferido, la técnica de criopreservación y la recogida de medios de condición derivados del BMSC. También proporcionamos un protocolo para la cebado de MSC mediada por IFN-γ y finalmente demostramos un estudio comparativo de cómo los macrófagos peritoneales responden de forma diferencial a BMSC normales o γ IFN- pre-licenciados.

Protocol

El presente estudio se realizó con la aprobación y siguiendo las directrices del comité de ética animal del ICMR-Instituto Nacional de Investigación en Salud Reproductiva e Infantil (Proyecto IAEC nº 09/23) y del Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Wisconsin-Madison. En el presente estudio se utilizaron ratones C57Bl/6J de entre 6 y 8 semanas, criados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

NOTA: Seguimos los protocolos de bioseguridad determinados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) mientras trabajamos en los estudios in vivo o in vitro . En resumen, para el estudio en animales mantuvimos un manejo suave para reducir el estrés y el riesgo de lesiones. Usamos EPI adecuado, como gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, mascarilla y una gorra bouffante desechable. Para reactivos químicos de riesgo biológico como el DMSO, utilizamos un armario de bioseguridad para manejar los productos químicos. Utilizamos el contenedor específico de residuos para desechar reactivos biopeligrosos u objetos punzantes.

1. Aislamiento de células estromales mesenquimales de la médula ósea murina

NOTA: Tras la recogida de las extremidades posteriores, el resto de los pasos deben realizarse en una campana de cultivo de tejido de flujo laminar, y en técnicas asépticas^{estériles 26}.

1. Eutanasiar al ratón mediante dislocación cervical, seguido de un enjuague exhaustivo con etanol al 70%. Con pinzas oftálmicas, toca suavemente la piel abdominal entre las dos articulaciones de las caderas del ratón y corta cuidadosamente la piel con tijeras.
2. Separa la piel tirando suavemente hacia el pie. Corta las articulaciones de las caderas y el tobillo para liberar ambas extremidades traseras.
3. Transfiere rápidamente las extremidades traseras en DMEM helado suplementado con 1x penicilina/estreptomicina y 2% de FBS para evitar daños tisulares hasta el proceso posterior de disección.
4. Toma cada extremidad trasera en una placa de Petri que contiene el medio helado. Retira cuidadosamente el músculo y el tejido conectivo del fémur y la tibia raspando suavemente la diáfisis del hueso. Transfiere el hueso limpio a una nueva placa de Petri que contenga el medio helado.
5. Desprenda el fémur y la tibia, seguido de hacer un corte en los extremos de la tibia y fémur justo debajo del final de la cavidad de la médula. Protege la cavidad de la médula lo máximo posible durante el procedimiento de disección del fémur y la tibia.
6. Toma una jeringuilla estéril de 1 mL con una aguja de 21 g y extrae el medio de la placa de Petri. Con pinzas estériles, sujeta el fémur extirpado e introduce la aguja suavemente en la cavidad de la médula. Enjuaga la cavidad de la médula ósea para obtener la médula ósea. Repite este paso hasta que el hueso esté blanco. Enjuaga la tibia de la misma manera.
7. Pipetea suavemente dentro y fuera para dispersar los grumos celulares en la placa de Petri. Utilizando una malla filtrante de 70 mm, filtra la suspensión de la celda para eliminar cualquier partícula ósea. Recoge el filtrado y centrígalo a 230 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet con medio completo (DMEM, FBS al 10%, 5% L-glutamina, penicilina y estreptomicina). Mide el rendimiento y la viabilidad de las células mediante la exclusión y el conteo de azul de Trypan en un hemocitómetro.
9. Siembra las células en un matraz tratado con cultivo de tejidos de 75^cm 2 con una densidad celular de 5000 células/^{cm 2} en medio^{DMEM completo 13}. Eliminar las células hematopoyéticas no adherentes tras 48 horas de cultivo cambiando el medio. Sustituye el soporte por material nuevo cada dos días o cada 3-4 días.
   NOTA: Utiliza un matraz de cultivo celular en lugar de un recipiente para evitar contaminaciones. No saques el matraz de la incubadora con frecuencia para revisar las células, ya que interrumpe el crecimiento celular.
10. Para desprender las células adheridas, lava las células 1 vez con PBS, añade 0,25% de tripsina-EDTA y mantén las células en tripsina durante 5 minutos. Esto ayuda a desprender las células del pozo.
11. Añade el medio completo, vuelve a suspender y centrifuga a 230 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante. Añadir medios DMEM completos al pellet, volver a suspender y volver a sembrar las células a una densidad de 5.000 células/^cm2.
12. Expulsa las células semanalmente cambiando el medio cada 3-4 días. Tras el tercer pasaje, analizar el cultivo de la MSC mediante análisis citométrico de flujo como se describe en el paso 6. Usa las celdas del paso 3-5 para cualquier experimento.
    NOTA: Para criopreservar las células para futuros experimentos, centrifugar las células al volumen deseado, volver a suspender las células en medio congelante, almacenar 1 x 10⁶ células en 1 mL de medio congelante en cada criovial a -80 °C durante la noche, y luego transferir las células al nitrógeno para su uso a largo plazo.
    Composición del medio congelante: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Preparación de medio acondicionado a partir de MSCs cultivados

1. Siembra las células a una densidad de 5000 células/^cm/2 en 6 pozos. Cultiva los MSC hasta un 80% de confluencia.
2. Recoge el medio acondicionado de la placa de cultivo celular y centrífuga a 230 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, filtra y úsala para el tratamiento.

3. Preparación de un medio condicionado cebado con IFNγ a partir de MSCs cultivados

1. Siembra las células en placas de 6 pozos con una densidad de 5000 células/^cm2. Trata las células con 25 ng/mL de IFNγ durante 48 horas. Realizar un estudio dependiente de la dosis para obtener el efecto óptimo de IFNγ en las MSC. Para este experimento, selecciona un rango de concentraciones de IFNγ, 5, 10, 10, 25, 50, 100 ng/mL, para prelicenciar los MSC. Las concentraciones de 5 y 10 ng/mL fueron significativamente menos efectivas en la polarización de los macrófagos, y se identificó 25 ng/mL como la concentración óptima (Figura suplementaria 1).
2. Después de decantar el medio que contiene γ IFN, lava el pozo dos veces con PBS para asegurar la eliminación completa del IFN-γ. Cualquier IFN-γ residual puede interferir con el resultado del estudio.
3. Incubar las células durante otras 24 horas en medio DMEM normal a 37 °C. Tras 24 horas, recoge el material condicionado siguiendo el paso 2.

4. Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la cavidad peritoneal

1. Inyectar 5 mL de PBS helado (con 3% de FBS) en la cavidad peritoneal de ratones, seguido de un suave masaje abdominal.
2. Recupera la solución de PBS usando una jeringuilla estéril. Recolectar en un tubo de 10 mL. Centrifuga la solución a 300 x g durante 5 minutos.
3. Quita el sobrenadante. Disuelve el pellet en medio RPMI completo (RPMI, 10% FBS, 1x penicilina y estreptomicina). Placar las células a 5000 células/^cm2.
4. Retirar las células no adherentes tras 24 horas y cultivar hasta la confluencia. Utiliza las células para procedimientos experimentales adicionales según sea necesario.

5. Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas

1. Para detectar IL-10 derivada de macrófagos tratados con BMSC-CM, siga los pasos siguientes.
   1. Trata los macrófagos con BMSC-CM durante 24 horas y recoge el sobrenadante al día siguiente.
   2. Mide la cantidad de IL-10 usando el kit IL-10 ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Para detectar CCL2 derivado de BMSC o BMSC tratados con IFNγ, utilice el kit ELISA CCL2 siguiendo las instrucciones del fabricante.

6. Análisis de citometría de flujo para MSCs y fenotipado de macrófagos

1. Siembra las células en placas de 6 pozos y haz que confluiga. Lava 1 vez con PBS (1 mL) seguido de tripsinización. Añade tripsina al 0,25% e incuba durante 5 minutos en tripsina para levantar completamente las células de la placa.
2. Añadir medios para desactivar la actividad de tripsina. Recoge las células en un tubo de poliestireno de 10 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C para macrófagos y 230 x g durante 5 minutos a 4 °C para BMSC.
3. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender las células en 2 mL de tampón de tinción (PBS bien frío con 2% FBS y 0,05% azida). Centrifuga a 230 x g durante 7 minutos. Decanta y desorganiza la bola. Añade 1 mL de tinte Ghost Red 780 viability y 50 mL de buffer FACS, resuspende y colócalo en el tubo de flujo. Mancha en la oscuridad durante 30 minutos.
4. Después de 30 minutos, lava las células con 1 mL de tampón de tinte. Decanta y desorganiza la bola. Añade el volumen deseado de anticuerpos o control isotipo. Incubar otros 30 minutos en la oscuridad. Lava las células con tampón de tinte, decanta y vuelve a suspender en 400 mL de tampón de tinte. El tubo de muestra está listo para la adquisición.
5. Para preparar el control de la tinción con muertos vivos, tras tripsinización y centrifugación, se disuelve el pellet en 2 mL de tampón de tinción. Saca 1 mL de otro tubo de microcentrífuga y a esto añade 10 mL de DMSO para matar las células. Haz un vórtice e incuba durante 10 minutos. Ahora mezcla esto con los otros 1 mL de la solución que contiene la celda en un tubo de flujo.
6. Añade 1 mL de tampón de tinte y centrifuga a 230 x g durante 7 minutos. Decanta y desorganiza la bola. Añade 1 mL de tinte Ghost Red 780 viability y 50 mL de buffer FACS, resuspende y colócalo en el tubo de flujo. Mancha en la oscuridad durante 30 minutos. Después de 30 minutos, lava las células con 1 mL de tampón de tinte. Decanta y desorganiza la bola. Resuspende en 400 mL de tampón de tinte. La muestra teñida de carne viva está lista para su adquisición.
   NOTA: Para la tinción de macrófagos en ratones, debe añadirse un paso adicional de tinción antes del protocolo estándar de tinción. Para evitar inexactitudes en los datos de flujo, el bloqueo del receptor FC es un paso crítico, que impide la unión de anticuerpos inespecíficos a los receptores Fc en las células. Para bloquear el receptor Fc, añade 1 mL de reactivo bloqueador de Fc (anticuerpo purificado anti-ratón CD16/CD32) a la suspensión celular e incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Realiza los pasos restantes de tinción de anticuerpos de flujo sin lavar el reactivo bloqueador de Fc.
7. Para analizar los datos de flujo, al principio deben seleccionarse celdas individuales en función de los parámetros de dispersión directa y de dispersión lateral. Este paso es crucial para eliminar escombros y agregados celulares. Después, las células individuales serán bloqueadas basándose en la tinción de vivo-muerto. Realizar análisis adicionales basados en la población de células vivas (Figura suplementaria 2).

Results

El esquema experimental general se describe en la Figura 1. La médula ósea del ratón se recogió tanto del fémur como de la tibia, se sintillan, se transmitió y se caracterizó por citometría de flujo (Figura 1A). Se recogieron los medios de condición de BMSC (BMSCS-CM) con o sin pre-licencia IFNγ, y se almacenaron algunos viales de BMSCS-CM a -80 °C para futuras necesidades experimentales (Figura 1B).

Las células derivadas de la médula ósea fueron contadas mediante hemocitómetro (Figura 2A) y sembradas a una densidad de 5000 células/^cm2 en medio DMEM completo. Tras 48 horas, se cambiaba el primer medio y luego el medio cada 3/4 días, hasta la confluencia total. Evacuamos las células cuando alcanzaron el 80% de confluencia (Figura 2B). En el pasaje 4, caracterizamos las células en función de la expresión de marcadores específicos de MSC. Las células fueron CD44, CD29 y CD90 positivas, y negativas para CD45, CD11b y CD34 (Figura 2C). Los BMSC pueden diferenciarse en linajes adipogénicos, osteogénicos y^{condrogénicos} 14,27,28,29. Esto mantiene las directrices de identidad de la Sociedad Internacional de Terapia Celular.

Para comprender el efecto inmunosupresor de las CM-CM, tratamos macrófagos derivados de la cavidad peritoneal (PMφ) y los tratamos con CM-CM (Figura 3A). Realizamos un análisis de citometría de flujo de macrófagos tratados con BMSC-MC (Figuras 3B, C). Macrófagos adaptados al cultivo residentes en cavidad peritoneal fueron teñidos con marcadores superficiales específicos para M1 y M2. Evitamos la unión de anticuerpos inespecíficos incubando macrófagos con anti-ratón purificado CD32/CD16 (Mouse Fc Block antes de añadir anticuerpos de tinción), antes de la tinción real de los marcadores celulares. Se estudió la expresión de los marcadores específicos de M1, CD86 e iNOS, y de los marcadores específicos de M2, CD206 y CD163. Las células fueron inicialmente seleccionadas en base al marcador hematopoyético CD45.2 (para C57BL6). IL-10 es la citocina característica del fenotipo M2. La IL-10 liberada por los macrófagos tratados con MSC-CM fue medida mediante un estudio ELISA (Figura 3D). Dado que el LPS/IFNg induce la polarización^{M1 30}, este tratamiento sirvió como control negativo.

CCL2 es una de las citocinas emblemáticas identificadas en el secretoma de las CMS, que desencadena la polarización¹³ de los macrófagos. El CCL2 liberado por las MSC fue detectado por ELISA (Figura 3E). Para confirmar el papel de CCL2 en la polarización de los macrófagos, pretratamos los macrófagos con un inhibidor de CCR2 seguido de tratamiento con MSC-CM (Figura 3F), y la polarización de los macrófagos fue nuevamente detectada mediante el estudio ELISA de IL-10 (Figura 3F).

Nuestros resultados demuestran claramente que el secretoma de las CMM puede inducir la polarización antiinflamatoria de los macrófagos, como lo demuestra el aumento de la producción de IL-10 en macrófagos derivados del intestino tras el tratamiento con medios condicionados (Figura 3).

Figura 1: Diagrama de flujo del estudio. (A) Se sacrificaron ratones C57BL/6. La médula se limpió tanto de los fémures como de la tibia, se centrifugó y se cultivó durante una semana, cambiando el suyo cada 3 días. Los MSC fueron pasados y en el paso 4 se caracterizaron por citometría de flujo y estudio de adipogénesis. (B) Los MSC del paso 4 se sembraron en placas de 6 pozos, en un conjunto con IFNγ añadido a una concentración de 25 ng/mL, y en otro conjunto, sin tratar. Después de 48 horas, sustituyal por medios DMEM frescos y completos normales. Después de 24 horas, recoge el medio de la placa, la centrífuga y el filtro. Guarda el medio en estado a -80 °C para uso futuro. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Caracterización fenotípica. (A) Las células derivadas de médula ósea fueron contadas mediante un hemocitómetro antes de la siembra. (B) Se dejó que las células crecieran hasta un 80% de confluencia antes de cada pasaje. (C) Las células del paso 4 se caracterizaron mediante análisis de citometría de flujo con marcadores específicos de MSC en ratones. La barra de escala representa 100 mM. La Figura 2C ha sido modificada respecto a^{la 14}. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis del secretoma BM-MSC. (A) Esquema de los experimentos. (B) Análisis citométrico representativo de diagramas para flujo de PMφ tratado con MSC-CM. Las células derivadas del peritoneo fueron seleccionadas en función de la población positiva de marcadores hematopoyéticos CD45,2. La población seleccionada fue además teñida por marcadores específicos de M1 CD86 o iNOS, marcadores específicos de M2 CD206 o CD163, junto con doble tinción de CD11b en cada caso. (C) Se cuantificó el porcentaje de población de células M1 o M2. Una población celular tratada con LPS/IFNγ sirvió como control negativo. (D) Se realizó ELISA para cuantificar la IL-10 liberada por el PMφ tratado con MSC-CM. ELISA se realizó para cuantificar (E) CCL2 liberado por MSC-CM, (F) IL-10 emitido por PMφ. Como se indica en la figura, se realizó un conjunto de experimentos en presencia de un antagonista de CCR2. Las barras de error representan la media ± SEM. Datos representativos de 3 experimentos independientes con 3 muestras de MSC por grupo. El test t de Student se utilizó para realizar análisis estadísticos de todos los experimentos. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. La Figura 3B-F ha sido modificada desde^{la 13}. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Los BMSC tenían prelicencia con 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg. Los macrófagos fueron tratados con MSCs-CM prelicenciados con IFNγ. Se realizó ELISA para cuantificar IL-10 liberado por PMφ tratado con MSC-CM. Las barras de error representan la media ± SEM. Datos representativos de 3 experimentos independientes con 3 muestras de MSC por grupo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: (A-C) Se seleccionaron celdas individuales en función de los parámetros de dispersión hacia adelante y de dispersión lateral. (D) Las células individuales se bloquearon basándose en la tinción de muertos vivos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea del ratón es una técnica fundamental para comprender las propiedades inmunosupresoras y regenerativas intrínsecas de las CMM en modelos animales in vivo . Aunque el método parece sencillo y fácil de seguir, deben ejecutarse varios pasos con precisión para evitar la contaminación bacteriana y asegurar un rendimiento celular óptimo. Cada paso del procedimiento debe realizarse de forma aséptica en un entorno ultra limpio.

Para evitar un bajo rendimiento de células, selecciona ratones en el grupo de edad de 6 a 8 semanas. Al cortar los extremos del fémur y la tibia, la cavidad medular debe protegerse tanto como sea posible, y el proceso de lavado debe ser firme pero suave para asegurar la extracción completa de la médula. Las células aisladas deben incubarse bajo una concentración adecuada de CO₂ y en condiciones de humidificación. Durante los cambios de medio, es esencial lavar suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de reemplazar el medio para eliminar las células hematopoyéticas contaminantes. Para evitar la contaminación celular hematopoyética, en el momento de la re-pasación, la tripsinización no debe superar los 5 minutos. En el pasaje inicial, el cambio en el medio no debe ser demasiado rápido, ya que el cambio frecuente puede causar contaminación bacteriana.

En cada pasaje, es necesario criopreservar las células en varios lotes para mantener la consistencia y disponibilidad. Para el cebado de IFN-γ, debe realizarse un experimento dependiente de la dosis para determinar las condiciones previas más eficaces a la licencia para los medios condicionados por MSC. En nuestros experimentos, probamos una variedad de concentraciones de IFNγ, es decir, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, para prelicenciar MSCs. Después, se identificó 25 ng/mL como la concentración óptima.

Para preservar la integridad de los datos, las células de un número de paso específico deben usarse de forma consistente en todos los ensayos experimentales. Para la caracterización citométrica de flujo de las CMM, deben utilizarse células del paso 3 o superior para asegurar una detección fiable de la expresión superficial de los receptores. La discriminación de células vivas/muertas durante la tinción por citometría de flujo es esencial, ya que reduce la probabilidad de resultados falsos negativos.

Los resultados representan un mecanismo clave mediante el cual las BMSC administradas exógenamente atenuan la inflamación intestinal durante la colitis. El cebado IFN-γ potencia el efecto de los medios condicionados por MSC sobre la polarización de los macrófagos. CCL2 liberado por los BMSC es una quimioquina crítica que actúa sobre los macrófagos para inducir la polarización M2. Nuestros hallazgos previos demostraron que las quimiocinas CCL2 y CXCL12 actúan de forma cooperativa sobre los macrófagos para promover su polarización. Este evento es esencial para propagar la señalización antiinflamatoria mediante la modulación posterior de los fenotipos¹³ de células T y células B.

En nuestro estudio, seguimos específicamente un protocolo sencillo para el aislamiento de BMSC, basado en la propiedad de adhesión plástica de las MSC. La clasificación por citometría de flujo o la clasificación inmunomagnética pueden utilizarse para aislar BMSC basándose en marcadores superficiales específicos de MSC. Sin embargo, en ambos métodos, existe la posibilidad de perder muchas células durante la preparación de la muestra. Dado que la médula ósea del ratón contiene un número muy bajo de MSCs (estimado en aproximadamente el 0,001% al 0,08% de las células de médula ósea), preferimos el método estándar de aislamiento basado en propiedades de adhesiones plásticos. Sin embargo, este método tiene algunos inconvenientes. El principal riesgo es la contaminación celular hematopoyética, que puede reducir la capacidad terapéutica de las MSC. Por ello, la identificación de un número específico de pasajes es crucial, cuando una población significativa de células expresa receptores superficiales específicos de las MSC.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Campana de cultivo celular con flujo laminar vertical, equipada con luz UV y nbsp;
Tijeras quirúrgicas estériles
25/75 cm2 frasco
Jeringuillas de 5/10 mL con agujas de 27G
6 platos de cultivo y nbsp;
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Bioleyenda	#123116
Anti-Mouse CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
APC antiratón CD 45.2	BD PharMingen	#558702
Anti-Mouse CD163 Percp eFluor710	eBiociencia	#46-1631-80
PE antiratón CD206	Bioleyenda	#141706
FITC Anti-Ratón CD86	BD PharMingen	#553691
Anti-Mouse iNOS PE-Cy7	eBiociencia	#25-5920-80
Kit CCL2 ELISA	Invitrogen	#554722
Antagonista de CCR2 (RS 102895)	Sigma	#R1903
Centrifugadora
DPBS	Corning	#21-031-CV
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Suero fetal bovino	Sigma	#F8067
Malla de filtro (70 mm)
Tinte de viabilidad rojo fantasma 780	Biociencia tonbo	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamina	Corning	#25-005-CI
Microscopio con equipo de contraste de fase
Murine IFNγ	R& Sistemas D	#485-MI-100
Penicilina-estreptomicina	Corning	#30-002-CI
Antiratón CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Pinzas quirúrgicas estériles (rectas y curvas)
Incubadora controlada por temperatura y composición de gases
Tripsina	Corning	#25052-cl
Baño-maria con control de temperatura